CN117736941B - 一种对犬骨骼有益的地衣芽孢杆菌King58及其应用 - Google Patents
一种对犬骨骼有益的地衣芽孢杆菌King58及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种对犬骨骼有益的地衣芽孢杆菌King58及其应用，属于微生物技术领域，所述地衣芽孢杆菌King58于2023年12月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.29319，分类命名为地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis。本发明地衣芽孢杆菌King58在95℃下处理20分钟后，孢子存活率为78%；本发明地衣芽孢杆菌King58的发酵提取物对IL‑1β诱发SW‑1353细胞生成IL‑8的抑制率为34.02%；本发明地衣芽孢杆菌King58菌剂能够帮助犬提升钙、磷的消化率，提升骨质疏松犬的骨密度。
Description
技术领域
本发明涉及一种对犬骨骼有益的地衣芽孢杆菌King58及其应用，属于微生物技术领域。
背景技术
骨骼健康是动物身体健康的重要基石之一，身体的所有行为、动作都离不开骨骼的支撑。对于犬来说，无论是在生长期，还是成年期，骨骼健康都是重中之重。幼犬骨质疏松症又称软骨症、钙磷代谢不良症，是一种常发病，而且发病急、疼痛明显、行走困难、行动时常鸣叫不安。进入老年期的犬，从形态到功能代谢开始发生一系列的变化，基础代谢每年降低，钙代谢出现异常，随着衰老，犬身体的各个器官都会发生变化，骨关节发生退变，易发生坏死和关节炎，骨密度的下降以及骨质疏松也使其不再适合剧烈运动。
钙、磷是犬机体内含量最多的矿物元素，是骨骼生长必需的核心元素。当钙磷缺乏时，血钙、血磷水平较低，骨骼灰分及其中的钙、磷浓度降低；同时钙还是血凝和神经兴奋传递的必需物质，当血钙含量低时，神经和肌肉兴奋性增强，容易引起抽搐。临床研究表明，犬长期缺钙容易导致骨骼畸形、易折等异常，幼年动物表现为佝偻病，成年则为骨软病或骨骼疏松症。在日常饲喂中，虽然各类食物中含有一定量的钙和磷，但大部分犬的钙磷消化吸收率较低，不能充分利用，仍需要主人喂食大量补钙产品才能达到补钙的目的。而单独喂食补液或者口服药品，量大影响食欲，增加心脏和胃的负担，反而影响消化吸收，产生副作用。
近年来，研究者们对骨骼健康的关注越来越多，肠道微生物与骨代谢之间的密切关系也被揭开。研究显示，肠道微生物中的有益菌在肠道内的增殖不仅可以抑制肠道病原菌的生长，预防和治疗各种肠道疾病，而且在远离肠道的器官和组织，如皮肤、动脉和骨骼的健康也都与益生菌密切相关。益生菌通过肠道菌群和宿主免疫代谢系统之间的复杂相互作用会影响与其他器官相关的身体功能，它们之间形成“轴”，而肠道微生物群落及其代谢物对骨骼健康产生的影响称为“肠骨轴”。目前，已有小鼠、肉鸡等动物试验研究表明，肠道有益菌对骨骼健康有积极影响。研究发现，在小鼠饲粮中添加罗伊氏乳杆菌促进了骨小梁结构发育并增加了骨密度含量（Mutus R, Kocabagli N, Alp M, et al. The effect ofdietary probiotic supplementation on tibial bone characteristics andstrengthin broilers[J]. Poultry science, 2006, 85(9): 1621-1265.）；在肉鸡饲粮中添加益生菌提高了胫骨内侧壁厚度以及胫骨灰分和钙含量（Sadeghi A A.Bone Mineralizationof Broiler Chicks Challenged withSalmonella enteritidisFed Diet ContainingProbiotic (Bacillussubtilis) [J]. Probiotics&Antimicrobial Proteins, 2014, 6(3-4): 136-140.）。而探究肠道有益菌对犬骨骼健康影响的研究仍处于空白。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明提供一种对犬骨骼有益的地衣芽孢杆菌King58及其应用，实现以下发明目的：
提升犬对钙、磷的消化和吸收，改善血钙、血磷、碱性磷酸酶指标，提高骨质疏松犬的骨密度。
为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案：
一种对犬骨骼有益的地衣芽孢杆菌King58，所述地衣芽孢杆菌King58于2023年12月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.29319，分类命名为地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis。
所述的地衣芽孢杆菌King58制备得到的菌剂。
所述菌剂中，菌体数量为0.8-1.2×109cfu/g。
所述菌剂的制备方法为将地衣芽孢杆菌King58经活化、发酵得到菌液，离心后收集菌体，重悬于复原脱脂乳中，获得菌悬液，冷冻干燥后得到菌粉，再与葡萄糖混合，得到地衣芽孢杆菌的菌剂。
所述的地衣芽孢杆菌King58在制备改善犬骨骼健康的产品中的应用。
所述地衣芽孢杆菌King58，分类命名：地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis，保藏日期：2023年12月15日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏编号：CGMCC No.29319。
与现有技术相比，本发明取得以下有益效果：
（1）本发明地衣芽孢杆菌King58在95℃下处理20分钟后，孢子存活率为78%；
（2）本发明地衣芽孢杆菌King58的发酵提取物对IL-1β诱发SW-1353细胞生成IL-8的抑制率为34.02%；
（3）本发明地衣芽孢杆菌King58菌剂能够帮助犬提升钙、磷的消化率，有效调节犬血钙、血磷和碱性磷酸酶的检测值，有利于犬血液生化健康，提升骨质疏松犬的骨密度，为犬骨骼健康提供有效帮助。
附图说明
图1为筛选的6株芽孢杆菌在高温处理后的孢子存活量的柱状图；
图2为芽孢杆菌发酵提取物对IL-1β诱发SW-1353细胞生成IL-8的抑制率的柱状图；
图3为实施例6中试验组和对照组的骨密度的柱状图。
具体实施方式
MRS琼脂培养基的配制：蛋白胨10g，牛肉粉5g，葡萄糖20g，吐温80 1mL，磷酸氢二钾2g，乙酸钠5g，柠檬酸三氨2g，七水硫酸镁0.2g，四水硫酸锰0.05g，酵母粉4g，琼脂15g，用蒸馏水溶解，定容至1000mL，在121℃、0.1MPa下灭菌20min，将灭菌后的培养基倒入平皿中，放凉后待用。
液体发酵培养基的配制：称取酵母粉3.0g、蛋白胨5.0g、牛肉膏2.0g、磷酸氢二钾3g、硫酸锰0.005g、硫酸镁0.02g和氯化钠2g，混匀，用蒸馏水溶解，定容至1000mL，121℃、0.1MPa灭菌20分钟。
实施例1菌株的分离筛选
1、芽孢杆菌的初筛
（1）菌株来源：2022年4月27日于西藏自治区采集健康藏獒粪便10份，运送回实验室后低温保存，待用。
（2）制备样品：取10份10mL灭菌后的生理盐水（0.85%）放于无菌试管中，然后将步骤（1）的10份健康藏獒粪便分别取1g加入其中，振荡混匀，水浴锅70℃加热10分钟，得到悬浊液；将10份悬浊液稀释，分别制成10-1、10-2、10-3浓度梯度的稀释样品。
（3）培养菌株：分别取上述稀释样品100μL涂布在含有10mg/kg放线菌酮的MRS琼脂培养基上，好氧条件下37℃培养48h，将长势良好的单菌落划线接种到新的MRS琼脂培养基上，好氧条件下37℃培养48h，重复划线2次，得到纯化后的单菌落，挑单菌落进行革兰氏染色，用显微镜油镜观察细菌类型及细菌形态，得到了6株革兰氏阳性杆菌，蓝紫色，有芽孢。初步判定分离株为芽孢杆菌，并命名为YB-1，YB-2，YB-3，YB-4，YB-5，YB-6。
2、芽孢杆菌的复筛
（1）95℃条件下存活率筛选
将芽孢杆菌YB-1，YB-2，YB-3，YB-4，YB-5，YB-6分别于MRS琼脂培养基上活化，挑1个单菌落转接到100mL液体发酵培养基中，37℃好氧条件下培养24h制得种子液，然后按6％（体积比）接种量接种于液体发酵培养基中，37℃好氧条件下培养48h后，得到发酵液，将发酵液在80℃条件，加热10分钟灭活菌体；然后利用液体发酵培养基稀释发酵液，使6株芽孢杆菌的发酵液中孢子量的对数值均为9.0logCFU/mL，将稀释后的发酵液在95℃条件下处理20分钟后，测定孢子存活量，6株菌的孢子存活量的对数值如图1所示，其中菌株YB-2和YB-5的孢子存活量最多，对数值分别为6.94和7.02logCFU/mL，存活率分别为77%和78%。
（2）芽孢杆菌发酵提取物抗关节炎活性的筛选
利用白介素（IL-1β）诱发人类软骨肉瘤细胞（SW-1353）产生IL-8等骨关节炎相关细胞因子的表达，评估芽孢杆菌发酵提取物调节IL-1β对SW-1353细胞的诱发活性，以了解芽孢杆菌发酵样品应用于抗关节炎等保护骨骼健康方面的潜力。
芽孢杆菌发酵提取物的制备：将芽孢杆菌YB-1，YB-2，YB-3，YB-4，YB-5，YB-6分别于MRS琼脂培养基上活化，挑1个单菌落转接到100mL上述液体发酵培养基中，37℃好氧条件下培养24h制得种子液，然后按6％（体积比）接种量接种于液体发酵培养基中，37℃好氧条件下培养48h后，得到发酵液，离心去除菌体获得上清液，取100mL上清液与400mL的100％乙醇混合均匀，产生沉淀后，离心弃上清，收集沉淀物，重复乙醇沉淀步骤4次，真空干燥沉淀物，得到6株芽孢杆菌的发酵提取物。
每1L芽孢杆菌YB-1，YB-2，YB-3，YB-4，YB-5，YB-6的发酵液分别得到发酵提取物的质量为1.90、1.71、1.85、1.97、1.89、1.45g。
芽孢杆菌的发酵提取物调节IL-1β诱发SW-1353细胞生成IL-8的实验：从液氮中取出1×106个SW 1353细胞（誉弛（上海）生物科技有限公司，编号SC0216），37℃水浴融化，将融化后的细胞转移至离心管中，加入5mL专用培养基（誉弛（上海）生物科技有限公司），1000rpm离心5min，弃去上清，再加入5mL专用培养基，将细胞吹打悬浮，加入到T25细胞培养瓶中，在37℃、100%空气、湿度75%的细胞培养箱中培养，培养期间定时观察细胞状态，及时更换细胞培养液；在倒置显微镜下对细胞进行观察，当细胞贴壁布满瓶底时，对细胞进行传代培养。
待细胞传代一次后，细胞贴壁布满瓶底时，将培养瓶中旧的细胞培养液吸出，用适量PBS缓冲液洗涤一次，每个T25培养瓶加入1mL 0.5％胰蛋白酶，静置2min使细胞脱落，加入5mL PBS使细胞混匀，转移至离心管中，1000rpm离心5min，弃去上清液，加入10mL专用培养基使细胞悬浮，得到细胞悬液；取20μL细胞悬液到血细胞计数板上，在倒置显微镜下观察计数；将细胞悬液用专用培养基进行稀释，稀释后在24孔板中每孔加入1000μL细胞稀释液（105细胞/孔）。
试验组每孔分别加入200μL的各芽孢杆菌发酵提取物的待测液（上述发酵提取物用无菌PBS复溶制得，终浓度为200μg/mL）；空白对照组（CON）加入等量无菌PBS；阳性对照组（PC）加入等量葡萄糖胺（终浓度为100μg/mL）。作用1h后，去除上清液，并以PBS清洗3次，每孔加入10μL的IL-1β（Acro），终浓度为10ng/mL，反应24小时后，收集上清液，利用ELISA试剂盒（上海研启生物科技有限公司）分析其中的发炎细胞因子IL-8表达量，并根据说明书进行计算。
芽孢杆菌抑制IL-1β诱发SW-1353细胞表达IL-8的测定结果如图2所示，其中阳性对照组葡萄糖胺的抑制率为31.46%，6株菌中抑制率较高的是YB-5和YB-1，抑制率分别为34.02%和32.68%，两者的效果略高于阳性对照组。
实施例2菌株鉴定
根据初筛和复筛结果，选择菌株YB-5并对其进行分子生物学鉴定。将YB-5分离纯化后得到的单菌落送去鉴定，鉴定单位：中国工业微生物菌种保藏管理中心；检测方法：FMIC-QO01-001-2015微生物学检测 细菌多相鉴定检测方法；鉴定结果为：该菌株为地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis；
该菌株的16S rDNA的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。
将鉴定后的菌株命名为地衣芽孢杆菌King58，将该菌株送至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏信息如下；
分类命名：地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis，保藏日期：2023年12月15日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏编号：CGMCC No.29319。
实施例3制备地衣芽孢杆菌King58菌剂
（1）取保藏的地衣芽孢杆菌King58在MRS琼脂培养基上活化，挑1个单菌落转接到100mL上述液体发酵培养基中，37℃好氧条件下培养24h制得种子液，然后按6％（v/v）接种量接种于液体发酵培养基中，37℃好氧条件下培养48h，获得菌液；
（2）将菌液离心后，收集菌体，使用无菌生理盐水洗涤后，重悬于15%（w/w）的复原脱脂乳中，获得浓度为2.0×1010cfu/mL的菌悬液，将菌悬液冷冻干燥后，获得菌粉；
（3）将菌粉与葡萄糖混合制成菌剂，葡萄糖购自保龄宝生物股份有限公司。
在本实施例中，制备的地衣芽孢杆菌King58菌剂中菌体数量为1.0×109cfu/g。
实施例4地衣芽孢杆菌King58对犬钙、磷消化吸收的影响
与山东省某犬猫繁育中心合作收集藏獒幼犬（5-7月龄，体重40.37±2.64kg）、藏獒成年犬（2-3岁，体重51.92±1.97kg）、藏獒老年犬（10-13岁，体重50.36±3.46kg）各20只，上述藏獒均健康、无重大疾病。随机分为6组，分别为幼犬对照组、幼犬试验组、成年犬对照组、成年犬试验组、老年犬对照组、老年犬试验组，每组10个重复，每个重复1只，每组体重、雌雄保持平衡，雌雄比例为1：1。试验期为28d，试验期间每只犬单笼饲养，每日除饲喂基础饲粮外，所有试验组犬补充实施例3制备的地衣芽孢杆菌King58菌剂6g/d，基础饲粮的营养水平见表1。
采用盐酸不溶灰分（AIA）法推算各饲粮营养物质的表观消化率，试验结束前5d为收粪期，收粪期每天收集1次，连续收集5天，称重，放入-20℃冰箱冷藏保存，待收粪期结束后，将5d的粪便混匀，制成风干样品用于测定各营养物质含量。
各营养物质表观消化率（％）=100-100×（饲粮中指示剂含量/粪中指示剂含量）×（粪中某营养物质含量/饲粮中某营养物质含量），结果见表2。
由表2可知，不论是幼犬、成年犬还是老年犬，试验组在服用28d实施例3所制备的地衣芽孢杆菌King58菌剂后，钙表观消化率和总磷表观消化率均有显著提升，说明补饲该菌剂可帮助犬提升钙、磷的消化率。
表1 基础饲粮营养水平（风干基础，%）
表2 地衣芽孢杆菌King58菌剂对犬钙、磷表观消化率的影响
注：与相同生长阶段对照组相比，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001。
实施例5地衣芽孢杆菌King58对犬血液生化的影响
与山东省某宠物医院合作收集20只患有骨质疏松症的雌性绝育杂种犬，年龄7-9岁，体重29.52±2.08kg。将20只犬随机分为对照组和试验组两组，每组10只，两组犬的整体体重和品种均衡。试验期为28d，试验期间所有犬于相同环境中饲养，饲粮相同，试验组犬补饲实施例3制备的地衣芽孢杆菌King58菌剂10g/d。分别在第0天、第14天和第28天时，经犬后肢小隐静脉采血，用日立7060型全自动生化分析仪测定血中钙、磷、碱性磷酸酶。
血液生化检测结果如表3所示，在第0天时，所有犬血钙、血磷、碱性磷酸酶的检测结果均在正常参考值以外。在试验第14天时，试验组犬的血钙、血磷、碱性磷酸酶指标有一定改善，但不显著，第28天时，试验组的血磷值恢复到正常参考值以内，试验组三项指标的测定结果与对照组相比均有显著改善。而对照组在整个试验期间，血磷、血钙、碱性磷酸酶的测定结果均不在正常参考范围以内。故该地衣芽孢杆菌King58菌剂可有效调节犬血钙、血磷和碱性磷酸酶的检测值，有利于犬血液生化健康。
表3 犬血液生化检测结果
注：与相同时间对照组相比，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001。
实施例6地衣芽孢杆菌King58对犬骨密度的影响
骨密度（BMD）是反映骨质疏松程度的客观指标，在实施例5中试验的第0天、第14天、第28天对所有试验犬进行骨密度测定。待专业动物麻醉师对犬进行静脉麻醉后，由专业技术人员采用双能X线骨密度仪测定骨密度，研究对象取仰卧位测定其腰椎L2～L4的BMD值（g/cm2），以L2～L4 BMD平均值作为其BMD值，T值=（实验组BMD值－对照组BMD值）/实验组标准差，具体操作进行。
根据骨密度测定结果见图3和表4，试验第28天时，试验组犬的骨密度相对于对照组提高了15.2%；本发明地衣芽孢杆菌King58菌剂对骨质疏松犬的骨密度有一定的改善作用，能够为犬骨骼健康提供有效帮助。
表4 两组犬BMD比较
。
Claims (5)
1.一种对犬骨骼有益的地衣芽孢杆菌King58，其特征在于：所述地衣芽孢杆菌King58于2023年12月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.29319，分类命名为地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis。
2.利用权利要求1所述的地衣芽孢杆菌King58制备得到的菌剂。
3.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于：所述菌剂中，菌体数量为0.8-1.2×109cfu/g。
4.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于：所述菌剂的制备方法为将地衣芽孢杆菌King58经活化、发酵得到菌液，离心后收集菌体，重悬于复原脱脂乳中，获得菌悬液，冷冻干燥后得到菌粉，再与葡萄糖混合，得到地衣芽孢杆菌的菌剂。
5.权利要求1所述的地衣芽孢杆菌King58在制备改善犬骨骼健康的产品中的应用。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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