CN117736344A - 具有自组装性能的重复结构单元重组蛋白ⅡAⅡB-ⅡAⅡBrQTY及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种具有自组装性能的重复结构单元重组蛋白ⅡAⅡB‑ⅡAⅡB^rQTY及应用。该重组蛋白包含2个人血清白蛋白Ⅱ型结构域中的ⅡAⅡB重复结构片段，其中第2个ⅡAⅡB结构片段中的氨基酸存在突变，具体为第2个ⅡAⅡB结构片段中的第123、124、137、139、157、158、160、161和175位亲水性氨基酸突变为疏水性。

Description

具有自组装性能的重复结构单元重组蛋白ⅡAⅡB-ⅡAⅡBrQTY 及应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种具有自组装性能的重复结构单元重组蛋白ⅡAⅡB-ⅡAⅡB^rQTY及应用。

背景技术

药物载体材料在提升疏水性药物的水溶性、药物生物利用度、药物控释缓释、药物靶向递送、药物穿透生物屏障(如内皮细胞屏障、血脑屏障等)等研究中起着重要的作用。以蛋白质为基础而构建的药物载体能有效地提高药物生物利用率、水溶性、安全性等，还能有效地降低给药频率，从而减少频繁给药对患者造成的痛苦。传统的蛋白质类药物载体在制备过程中需要通过添加化学诱导试剂、调节溶液pH或修饰自组装多肽等，以此来实现自组装成稳定药物载体的目的。然而，以蛋白质为基础构建的自组装药物载体，由于蛋白质的性质在接触到有机化学试剂、pH变化、高温高压等因素后往往容易发生变性失活，使蛋白质失去原有的生物学活性，进而导致所制备的蛋白质自组装药物载体具有较大的免疫原性。当该蛋白质自组装药物载体经注射等方式进入体内后，会引起较为强烈的免疫反应，影响药物的安全性。

人血清白蛋白(HSA)是人血浆中含量最丰富的蛋白质，其由585个氨基酸残基组成，分子量约为67KDa,单分子构象呈“心形”结构，主要分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三个结构域，每个结构域又分为两个亚结构域，即ⅠA和ⅠB、ⅡA和ⅡB、ⅢA和ⅢB。因为HSA来源广泛又具有良好的生物相容性等特点，因此被广泛应用于医药、生化、药物载体开发等领域。

公布号为CN114262373A(20220401)，发明名称为“具自组装性能的白蛋白HSA-Hydrophoboic-ⅡB及其应用”的中国专利，公开了一种疏水性重组HSA蛋白，该重组蛋白带有部分ⅡB亚结构域片段。该重组蛋白自组装形成的纳米粒平均粒径为115.4nm，载药量达到21.09％。然而，追求更高的载药量和在复杂体液环境中的稳定性是本领域技术人员持续追求的目标。

综上所述，有必要提出新的方法和策略，以补充现有技术的不足。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种具有ⅡAⅡB-ⅡAⅡB^rQTY重复结构单元的重组蛋白及其应用，具体技术方案如下。

一种重复结构单元重组蛋白ⅡAⅡB-ⅡAⅡB^rQTY，所述重组蛋白ⅡAⅡB-ⅡAⅡB^rQTY的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步，所述重组蛋白ⅡAⅡB-ⅡAⅡB^rQTY包含2个人血清白蛋白Ⅱ型结构域中的ⅡAⅡB重复结构片段，其中第2个ⅡAⅡB结构片段中的氨基酸存在突变。

进一步，所述突变为第2个ⅡAⅡB结构片段中的第123、124、137、139、157、158、160、161和175位亲水性氨基酸突变为疏水性，具体为将天冬酰胺(N)、酪氨酸(Y)、酪氨酸(Y)、酪氨酸(Y)、苏氨酸(T)、酪氨酸(Y)、苏氨酸(T)、苏氨酸(T)和酪氨酸(Y)分别突变为亮氨酸(L)、苯丙氨酸(F)、苯丙氨酸(F)、苯丙氨酸(F)、缬氨酸(V)、苯丙氨酸(F)、缬氨酸(V)、缬氨酸(V)和苯丙氨酸(F)。

一种重组表达载体，包含上述重组蛋白ⅡAⅡB-ⅡAⅡB^rQTY的基因。

优选的，所述表达载体为质粒载体。

一种重组细菌，表达上述重组蛋白ⅡAⅡB-ⅡAⅡB^rQTY。

一种用于疏水性药物递送的纳米胶束，由所述重组蛋白ⅡAⅡB-ⅡAⅡB^rQTY制备得到。

上述纳米胶束在制备药物递送载体中的应用。

进一步，所述纳米胶束用于搭载疏水性药物，所述疏水性药物包括疏水性抗肿瘤药、疏水性抗生素、疏水性多肽或蛋白。

进一步，所述药物递送载体的剂型为注射剂。

有益技术效果

1.本发明提供的重组蛋白ⅡAⅡB-ⅡAⅡB^rQTY相较于现有技术，具有更小的粒径和更高的载药量。

2.本发明提供的重组蛋白ⅡAⅡB-ⅡAⅡB^rQTY为一种“两亲性”性能的蛋白质，即蛋白质一端呈现亲水特性、一端呈现疏水特性，能在中性pH溶液不变性、不依靠诱导试剂的情况下自组装成一定尺寸的纳米微粒，该纳米微粒中间形成的“疏水性核”结构可以通过疏水相互作用搭载疏水性药物。而未经过关键位点氨基酸突变的重组蛋白ⅡAⅡB-ⅡAⅡB不能实现自组装。

3.本发明提供的重组蛋白ⅡAⅡB-ⅡAⅡB^rQTY作为载体搭载药物具有更长的缓释时间，其药物累计释放量在168h后才达到90％以上，而天然人血清白蛋白(HSA)载药纳米胶束在96h左右的药物累计释放量就达到了90％。

4.本发明提供的重组蛋白ⅡAⅡB-ⅡAⅡB^rQTY对细胞毒性小、安全性高、生物相容性好。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。在所有附图中，类似的元件或部分一般由类似的附图标记标识。附图中，各元件或部分并不一定按照实际的比例绘制。显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

图1为通过Alphafold 2预测的重组蛋白ⅡAⅡB-ⅡAⅡB^rQTY晶体结构图；

图2为实施例中纯化得到的重组蛋白ⅡAⅡB-ⅡAⅡB^rQTY和重组蛋白ⅡAⅡB-ⅡAⅡB的SDS-PAGE图(A为ⅡAⅡB-ⅡAⅡB^rQTY，B为未突变ⅡAⅡB-ⅡAⅡB)；

图3为重组蛋白ⅡAⅡB-ⅡAⅡB^rQTY自组装纳米胶束冷冻干燥后的透射电镜图(比例尺：100nm)；

图4为重组蛋白ⅡAⅡB-ⅡAⅡB纳米胶束冷冻干燥后的透射电镜图(比例尺：100nm)；

图5为重组蛋白ⅡAⅡB-ⅡAⅡB^rQTY自组装纳米粒对人胚胎肾细胞(293T)存活率的影响实验图；

图6为重组蛋白ⅡAⅡB-ⅡAⅡB^rQTY自组装载药纳米胶束和通过反溶剂沉淀法制备而得的天然人血清白蛋白载药纳米胶束的药物释放速率实验图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本文中“和/或”包括任何和所有一个或多个列出的相关项的组合。

本文中“多个”意指两个或两个以上，即其包含两个、三个、四个、五个等。

需要说明的是，在本文中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者装置不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者装置所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括该要素的过程、方法、物品或者装置中还存在另外的相同要素。

如在本说明书中使用的，术语“大约”，典型地表示为所述值的+/-5％，更典型的是所述值的+/-4％，更典型的是所述值的+/-3％，更典型的是所述值的+/-2％，甚至更典型的是所述值的+/-1％，甚至更典型的是所述值的+/-0.5％。

在本说明书中，某些实施方式可能以一种处于某个范围的格式公开。应该理解，这种“处于某个范围”的描述仅仅是为了方便和简洁，且不应该被解释为对所公开范围的僵化限制。因此，范围的描述应该被认为是已经具体地公开了所有可能的子范围以及在此范围内的独立数字值。例如，范围1～6的描述应该被看作已经具体地公开了子范围如从1到3，从1到4，从1到5，从2到4，从2到6，从3到6等，以及此范围内的单独数字，例如1，2，3，4，5和6。无论该范围的广度如何，均适用以上规则。

名词解释

本发明所述的“重复结构单元重组蛋白ⅡAⅡB-ⅡAⅡB^rQTY”是指人血清白蛋白的结构区域Ⅱ(ⅡAⅡB)经柔性linker(GGGGSGGGGSGGGGS)连接上突变后的结构区域Ⅱ(ⅡAⅡB^rQTY)的得到的重组蛋白。其中，rQTY代表一种蛋白质设计方法，将特定的亲水性α螺旋转化为疏水性α螺旋。

材料和试剂

人胚肾细胞293T购买自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，目录号SCSP-502，细胞名称：人胚胎肾细胞，动物种别：人，组织来源：胎儿，胚肾。

大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞购买自北京索莱宝科技有限公司。

pET-22b(+)质粒为市售的大肠杆菌表达载体，购买自北京擎科生物科技股份有限公司。载体标签为N-pelB和C-His，载体抗性为Ampicillin(氨苄青霉素)。

限制性内切酶NdeI和XhoI购买自NEB(北京)有限公司。His-tag蛋白纯化树脂(镍柱)，购买自上海联迈生物工程有限公司，货号LM-616。IPTG、氨苄青霉素、DMSO(二甲基亚砜)均购买自北京索莱宝科技有限公司。DMEM培养基购买自GIBCO。CCK8试剂购自重庆葆光技术有限公司，按照试剂说明书操作使用。阿霉素(英文名称adriamycin)是一种抗生素类药物，分子式为C₂₇H₂₉NO₁₁，CAS登录号为23214-92-8，购买自上海麦克林生化科技有限公司。

培养基

每升LB培养基含有：5g酵母提取物、10g胰蛋白胨、10g氯化钠，调节pH至7.0。

配制方法：在950ml双蒸水中溶解5g酵母提取物、10g胰蛋白胨、10g氯化钠，再用氢氧化钠溶液调节pH至7.0，用双蒸水定容至1L。如果配制固体培养基，按1.5g/100ml加入琼脂。121℃高压蒸汽灭菌30min。

本发明未特别说明的实验试剂均为本领域常规试剂，可以按照本领域常规方法配制而得或从相关试剂供应商购买获得；未特别说明的实验方法，均为本领域常规方法，可参考相关实验手册，例如分子克隆实验手册或相关试剂生产商的说明书。

实施例1

本实施提供一种ⅡAⅡB-ⅡAⅡB^rQTY基因设计及蛋白表达示例

1.基因设计

设计了一个基因，包含HSA蛋白中I型结构域的2个重复结构片段(ⅡAⅡB-ⅡAⅡB)，其中第2段ⅡAⅡB氨基酸序列中包含多个亲水性氨基酸突变(ⅡAⅡB-ⅡAⅡB^rQTY)，该基因表达的蛋白具有402个氨基酸，其序列如SEQ ID NO.1所示；编码该蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，全长为1206bp。进一步，在该基因的5’端和3’端分别加上NdeI酶切位点(CATATG)和XhoI酶切位点(CTCGAG)，带有酶切位点的基因核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，全长为1215bp。本实施例涉及到的序列如表1所示。

表1

2.载体构建

采用pET-22b(+)质粒作为表达载体。用限制性内切酶NdeI、XhoI分别对pET-22b(+)质粒和目的基因(SEQ ID No.1)进行双酶切反应，然后通过连接反应将目的基因连接到pET-22b(+)载体中，得到连接产物。

3.转化

(1)将大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞从-80℃冰箱中取出，冰浴5min。

(2)待保存BL21(DE3)感受态细胞的甘油融化后，将感受态细胞加入连接产物中，枪头吸放3-4次混匀，冰浴静置30min。

(3)用吸水纸迅速擦干管壁的水分，然后42℃热激90s，立即冰浴2min。

(4)在无菌条件下加入800μl的LB液体培养基，37℃，150rpm培养45min。

(5)8000rpm离心5min收集菌体，弃掉部分上清，用剩下的100μl左右的上清重悬大肠杆菌，然后均匀地涂布在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB固体培养基上，放入37℃恒温箱中，倒置培养10-16h。

(6)挑取单克隆接种于含有100μg/ml氨苄青霉素的液体LB培养基中，37℃培养10-16h后进行阳性克隆鉴定，得到含有目的基因质粒的阳性克隆。

4.蛋白表达与纯化

(1)接种：配制好液体LB培养基并灭菌，灭菌完毕后的液体LB培养基放置于超净工作台中冷却至室温，在超净工作台中加氨苄青霉素至LB培养基中并混匀，使得氨苄青霉素的终浓度为100μg/mL，再按200μL/L的量向LB培养基接种含目的基因质粒的大肠杆菌(阳性克隆)，然后将该LB培养基放置于摇床中，按照转速为170rpm、温度为37℃的条件培养8-10h。

(2)诱导：摇床培养8-10h后，取出2mL菌液经分光光度计测量其OD600值，当菌液的OD600值达到0.6-0.8时，向该菌液中添加终浓度为200μL/mL的IPTG，再按照37℃、170rpm的条件摇床培养8h。

(3)纯化：添加IPTG并摇床培养8h后，取出菌液，于4℃，8000rpm离心5min，离心完毕后去掉上清，保留沉淀(沉淀即为大肠杆菌)。

(4)超声破碎：将大肠杆菌超声破碎后进行离心，离心得到的沉淀即含目的蛋白，将离心得到的沉淀先用洗涤液I(50mmol/L Tris-HCl，1mol/L尿素，10mL/L Triton X-100)洗涤，然后再用洗涤液II(50mmol/L Tris-HCl，2mol/L尿素，5mL/L Triton X-100)洗涤，再用包涵体溶解液(50mmol/L Tris-HCl，8mol/L尿素，100mmol/L NaCl)溶解。

(5)最后对上述包涵体溶解液进行梯度复性，方法如下：将包涵体溶解液装于透析袋中，再将透析袋依次置于6M、4M、2M、1M、0.5M的尿素溶液中进行梯度复性，每个尿素浓度下复性2-4小时，需在4℃低温条件下进行复性。复性完毕后的溶液过His-tag蛋白纯化树脂(镍柱)纯化即可得到新型重组蛋白ⅡAⅡB-ⅡAⅡB^rQTY(目的蛋白的基因序列在设计时加入组氨酸标签，以便于蛋白纯化)。纯化完毕后通过跑聚丙烯酰胺-凝胶电泳(SDS-PAGE)来鉴定是否成功获得纯化的目的蛋白。结果如图2A所示，获得了大小约45.11kDa的重组蛋白ⅡAⅡB-ⅡAⅡB^rQTY。图2B为大小约45.19kDa的重组蛋白ⅡAⅡB-ⅡAⅡB(未进行亲水性位点突变)电泳图。在图2中，左侧泳道为蛋白分子标记，右侧泳道为纯化得到的ⅡAⅡB-ⅡAⅡB^rQTY蛋白或ⅡAⅡB-ⅡAⅡB蛋白。

未进行亲水性位点突变的重组蛋白ⅡAⅡB-ⅡAⅡB的氨基酸和核苷酸序列如表2所示。类似的，在其编码基因的5’端和3’端分别加上NdeI酶切位点(CATATG)和XhoI酶切位点(CTCGAG)。

表2

5.重组蛋白ⅡAⅡB-ⅡAⅡB^rQTY纳米胶束的制备

(1)取磷酸盐缓冲液干粉于烧杯中，加入去离子水进行稀释，最终得到pH为7.4的1×PBS，制得分散溶液，备用。

(2)称取纯化后得到的新型重组蛋白50mg，在磁力搅拌的条件下溶于10mL去离子水中，配制成质量浓度为5mg/mL的新型重组蛋白水溶液。

(3)量取步骤(1)中配制的分散溶液10mL于25mL的烧杯中，在冰浴的条件下以400W的功率超声分散，同时，量取步骤(2)中制备得到的新型重组蛋白溶液10mL，通过恒流泵以0.4mL/min的速率滴注到分散溶液中，新型重组蛋白溶液滴注完毕后即可停止超声，得到重组蛋白ⅡAⅡB-ⅡAⅡB ^rQTY纳米胶束溶液。

重组蛋白ⅡAⅡB-ⅡAⅡB蛋白纳米胶束的制备方法与重组蛋白ⅡAⅡB-ⅡAⅡB^rQTY纳米胶束的一致。制备重组蛋白ⅡAⅡB-ⅡAⅡB纳米胶束的目的是为了验证其是否能像重组蛋白ⅡAⅡB-ⅡAⅡB^rQTY那样进行自组装，以进一步突出显示ⅡAⅡB-ⅡAⅡB^rQTY能在不添加诱导试剂(例如：乙醇、异丙醇、二甲基亚砜等)的条件下进行自组装。

实施例2

本实施例提供重组蛋白ⅡAⅡB-ⅡAⅡB^rQTY的细胞毒性评价

通过CCK8法研究重组蛋白ⅡAⅡB-ⅡAⅡB^rQTY对人胚胎肾细胞293T(中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)的毒性，以评价重组蛋白ⅡAⅡB-ⅡAⅡB ^rQTY的生物安全性。在96孔板中，按照每孔接种1×10⁴个人胚胎肾细胞293T到DMEM培养基中，设置5个实验组和1个对照组，每组设置3个复孔。37℃培养细胞24h后，向实验组的孔(实验孔)中加入重组蛋白ⅡAⅡB-ⅡAⅡB^rQTY，使得5个实验组的重组蛋白ⅡAⅡB-ⅡAⅡB^rQTY的终浓度分别为10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml。对照组的孔(对照孔)中不加重组蛋白ⅡAⅡB-ⅡAⅡB^rQTY。37℃继续培养24h，然后使用CCK8法检测活细胞数量，步骤如下：每孔加入10μlCCK8试剂，37℃孵育3h。然后用酶标仪测定各孔在450nm处的吸光度。

细胞存活率的计算方法如下：[实验孔吸光度(含有细胞的培养基、CCK8试剂、蛋白样品)-空白孔吸光度(不含细胞和蛋白样品的培养基、CCK8试剂)]/[对照孔吸光度(含有细胞的培养基、CCK8试剂、没有蛋白样品)-空白孔吸光度(不含细胞和蛋白样品的培养基、CCK8试剂)]×100％。

每组的细胞存活率为该组三个复孔的细胞存活率的平均值。以对照组的细胞存活率为100％作图，结果如图5所示，其中横坐标为培养基中的ⅡAⅡB-ⅡAⅡB ^rQTY自组装纳米粒的浓度(μg/mL)，纵坐标为人胚胎肾细胞(293T)的存活率(％)，以培养基中不加ⅡAⅡB-ⅡAⅡB^rQTY自组装纳米粒的对照组细胞的存活率为100％。图5可见细胞在添加10-400μg/ml浓度的重组蛋白ⅡAⅡB-ⅡAⅡB^rQTY后均表现出了较高的存活率，证明重组蛋白ⅡAⅡB-ⅡAⅡB^rQTY对细胞毒性低、生物相容性好。

实施例3

本实施例提供重组蛋白ⅡAⅡB-ⅡAⅡB^rQTY的性能测试

1.重组蛋白ⅡAⅡB-ⅡAⅡB^rQTY纳米胶束的透射电镜观察

样品准备：用移液枪吸取10μl实施例1中制备的重组蛋白ⅡAⅡB-ⅡAⅡB^rQTY纳米胶束溶液滴加至铜网(300目)上，再用移液枪吸取4μl醋酸双氧铀同样滴加至铜网上对其进行染色，然后自然晾干以备进行形貌观察。继续用实施例1中制备的未突变亲水性位点重组蛋白ⅡAⅡB-ⅡAⅡB纳米胶束溶液，按照上述步骤在铜网上制备重组蛋白ⅡAⅡB-ⅡAⅡB的电镜观察样品。

样品观察：使用透射电镜分别观察铜网上的重组蛋白ⅡAⅡB-ⅡAⅡB和重组蛋白ⅡAⅡB-ⅡAⅡB^rQTY形貌。结果显示，本发明制备的重组蛋白ⅡAⅡB-ⅡAⅡB^rQTY在不添加诱导试剂的条件下能够自组装形成纳米粒(图3)，而未突变亲水性氨基酸的重组蛋白ⅡAⅡB-ⅡAⅡB在不添加诱导试剂的条件下则不能自组装形成纳米粒(图4)。

2.重组蛋白ⅡAⅡB-ⅡAⅡB^rQTY纳米胶束的粒径、包封率和载药量测定

以载阿霉素为例，使用重组蛋白ⅡAⅡB-ⅡAⅡB^rQTY对阿霉素进行包封，并测定粒径、包封率和载药量。

重组蛋白ⅡAⅡB-ⅡAⅡB^rQTY载药纳米胶束的制备：取重组蛋白ⅡAⅡB-ⅡAⅡB^rQTY，溶解于去离子水中，配制成质量浓度为5mg/mL的蛋白水溶液。再配制浓度为0.4mg/mL的阿霉素-PBS溶液(PBS溶液的pH值为7.4)，阿霉素-PBS溶液需不断地搅拌，否则由于阿霉素的疏水性会导致药物发生沉降、不能均匀地分散于PBS溶液中。最后，在冰浴条件下，将等体积的重组蛋白ⅡAⅡB-ⅡAⅡB^rQTY水溶液以0.4mL/min的速率滴注到浓度为0.4mg/mL的阿霉素-PBS溶液中，滴注过程中进行超声分散，滴注完毕后停止超声分散，得到重组蛋白ⅡAⅡB-ⅡAⅡB^rQTY载药纳米胶束溶液。

按照如下方法对制备得到的重组蛋白ⅡAⅡB-ⅡAⅡB^rQTY载药纳米胶束进行粒径、包封率和载药量测定。

1)粒径的测定方法：

用移液枪吸取2mL制备好的重组蛋白ⅡAⅡB-ⅡAⅡB^rQTY载药纳米胶束溶液，放置于4.5mL的透明比色皿中，将盛有载药纳米胶束溶液的透明比色皿放置于纳米粒度及ZETA电位分析仪(英国马尔文公司，型号：Nano ZS90)的样品分析孔中，按照Nano ZS90纳米粒度及ZETA电位分析仪的使用说明测定纳米粒的粒径。

2)包封率的测定方法：

将制备好的重组蛋白ⅡAⅡB-ⅡAⅡB^rQTY载药纳米胶束溶液溶液按照10000r/min的转速离心15min，然后取上清液，通过紫外分光光度计测定上清液在480nm处的吸光度，按照公式：A＝0.0184C+0.0216(A为吸光度，C为阿霉素浓度)计算游离药物含量。

包封率＝(W_总-W_游)/W_总*100％

W_总为初始投药量，W_游为纳米粒中未被包封的游离药物量。

3)载药量的测定方法：

将制备好的重组蛋白ⅡAⅡB-ⅡAⅡB^rQTY载药纳米胶束溶液溶液按照10000r/min的转速离心15min，然后取上清液，通过紫外分光光度计测定上清液在480nm处的吸光度，按照公式：A＝0.0184C+0.0216(A为吸光度，C为阿霉素浓度)计算游离药物含量。

载药量＝(W_总-W_游)/W_总重*100％

W_总为初始投药量，W_游为纳米粒中未被包封的游离药物量，W_总重为载药后的重组蛋白ⅡAⅡB-ⅡAⅡB^rQTY纳米粒总重量。

W_总重的测定方法：将重组蛋白ⅡAⅡB-ⅡAⅡB^rQTY载药纳米胶束在12000r/min的条件下进行离心，离心完毕后舍弃上清，沉淀的重量即为载药后的重组蛋白ⅡAⅡB-ⅡAⅡB^rQTY纳米粒总重量。即载药后的重组蛋白ⅡAⅡB-ⅡAⅡB^rQTY纳米粒总重量(W_总重)＝含沉淀的离心管总重量-空白离心管的重量。

结果如表3所示，重组蛋白ⅡAⅡB-ⅡAⅡB^rQTY载药纳米胶束的粒径较小且均匀，载药量达到25.75％。

表3重组蛋白ⅡAⅡB-ⅡAⅡB^rQTY纳米胶束的粒径、包封率、载药量测定结果(以载阿霉素为例)

3.重组蛋白ⅡAⅡB-ⅡAⅡB^rQTY载药纳米胶束的药物释放实验

对制备得到的重组蛋白ⅡAⅡB-ⅡAⅡB^rQTY载药纳米胶束进行药物释放实验。

药物释放实验方法：移取5mL的重组蛋白ⅡAⅡB-ⅡAⅡB^rQTY载药纳米胶束溶液于透析袋中，置于20mL含1g/L吐温80的磷酸盐缓冲液(pH7.4)的释放介质中，放置于恒温摇床上，按照37℃、170r/min的条件进行药物释放实验，分别于3h、6h、12h、24h、48h、72h、96h、120h、144h和168h取出1mL溶液(并增补1mL的释放介质)，通过紫外分光光度计测定取出的1mL溶液在480nm处的吸光度，按照公式：A＝0.0184C+0.0216(A为吸光度，C为阿霉素浓度)计算阿霉素含量，实验设3次重复，结果取平均值。计算3h、6h、12h、24h、48h、72h、96h、120h、144h和168h的累计药物释放量(％)并绘制出药物释放曲线。

累计药物释放量(％)＝释放的药物重量/包封的药物总重量。

结果如图6所示，重组蛋白ⅡAⅡB-ⅡAⅡB^rQTY载药纳米胶束的药物累计释放量在168h后才达到90％以上，而天然人血清白蛋白(HSA)载药纳米胶束在96h左右的药物累计释放量就达到了90％。因此，重组蛋白ⅡAⅡB-ⅡAⅡB^rQTY纳米胶束具有显著的药物缓释效果。优选的，该重组蛋白ⅡAⅡB-ⅡAⅡB^rQTY载药纳米胶束通过注射到体内的方式起效。

可以理解的是，本实施仅以装载阿霉素作为示例而不是限制，其他的疏水性药物，包括疏水性抗肿瘤药或疏水性多肽等同样适用于本发明。

上面结合附图对本发明的实施例进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可做出很多形式，这些均属于本发明的保护之内。

Claims (10)

1.一种重复结构单元重组蛋白ⅡAⅡB-ⅡAⅡB^rQTY，其特征在于，所述重组蛋白ⅡAⅡB-ⅡAⅡB^rQTY的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述的重组蛋白ⅡAⅡB-ⅡAⅡB^rQTY，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID NO.2所示。

3.如权利要求1所述的重组蛋白ⅡAⅡB-ⅡAⅡB^rQTY，其特征在于，所述重组蛋白ⅡAⅡB-ⅡAⅡB^rQTY包含2个人血清白蛋白Ⅱ型结构域中的ⅡAⅡB重复结构片段，其中第2个ⅡAⅡB结构片段中的氨基酸存在突变。

4.如权利要求3所述的重组蛋白ⅡAⅡB-ⅡAⅡB^rQTY，其特征在于，所述突变为第2个ⅡAⅡB结构片段中的第123、124、137、139、157、158、160、161和175位亲水性氨基酸突变为疏水性，具体为将天冬酰胺、酪氨酸、酪氨酸、酪氨酸、苏氨酸、酪氨酸、苏氨酸、苏氨酸和酪氨酸分别突变为亮氨酸、苯丙氨酸、苯丙氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸。

5.一种重组表达载体，其特征在于，包含权利要求1或2所述的重组蛋白ⅡAⅡB-ⅡAⅡB^rQTY的基因。

6.一种重组细菌，其特征在于，表达权利要求1-4所述的重组蛋白ⅡAⅡB-ⅡAⅡB^rQTY。

7.一种用于疏水性药物递送的纳米胶束，其特征在于，由权利要求1-4任一项所述的重组蛋白ⅡAⅡB-ⅡAⅡB^rQTY制备得到。

8.权利要求7所述的纳米胶束在制备药物递送载体中的应用。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述纳米胶束用于搭载疏水性药物，所述疏水性药物包括疏水性抗肿瘤药、疏水性抗生素、疏水性多肽或蛋白。

10.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述药物递送载体的剂型为注射剂。