CN117723641A - 吡咯里西啶生物碱的检测试剂盒及其检测方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种吡咯里西啶生物碱的检测试剂盒及其检测方法和应用，通过选择合适的沉淀剂，一步即可完成沉淀，再经归一化反应，使十种药物性肝损伤吡咯里西啶生物碱转化为二羟乙基脱氢吡咯里西啶生物碱，并选择最佳的内标，经液相色谱串联质谱并采用内标法定量，实现吡咯里西啶生物碱的精确定量检测，流程短，特异性好，灵敏度高，可使DILI患者得到精准的病因诊断，及时避免进一步肝损伤，肝功能衰竭。
Description
技术领域
本发明涉及生物化学分析技术领域，具体而言，涉及一种吡咯里西啶生物碱的检测试剂盒及其检测方法和应用。
背景技术
药物性肝损伤(Drug induced liver injury,DILI)是最常见和最严重的药物不良反应之一。近年来，随着新药的不断出现和中草药的广泛应用，DILI的发病率也随之增加。
2019年，全球DILI的年发病率约为14-19/10万人。中国DILI的年发生率则达到23.80/10万人。中草药及保健品在我国使用广泛，但其所致的肝损害发病隐匿，部分患者发展至肝衰竭，已经成为我国DILI比例最大的一种病因，约为26.81％。
作为一种血管型DILI的代表，含吡咯里西啶生物碱(Pyrrolizidine alkaloids,PAs)的中草药或制剂引起的肝静脉闭塞综合征或肝窦阻塞综合征(Hepatic SinusoidalObstructive Syndrome,HSOS)病例日益增多。全球范围由PAs导致HSOS的临床报道已超过8000例，我国以土三七为主。土三七等中草药里所含有的PAs在肝细胞代谢脱氢后产生化学性质更活泼的脱氢吡咯里西啶生物碱；该类生物碱易于血浆和细胞内会与含巯基蛋白质、谷胱甘肽、核苷碱基等亲核性物质反应，经加成反应得到一系列PAs加成蛋白、加成核酸等分子，严重影响肝细胞正常生理功能，由此产生肝毒性和肝损伤。伴随病程的进一步发展，将导致肝窦和肝小静脉的内皮细胞损伤和坏死，肝脏血液“只进不出”，引起门静脉压力增加，形成腹水、黄疸等症状。这种损害一经形成，常常无法逆转，并快速发展为肝功能衰竭，危及患者生命。调查结果表明国内报道的116例PAs导致的HSOS，有9.7％患者病情迅速进展最终死于多器官功能衰竭。
PA-HSOS的诊断主要是排除性诊断，常被误诊为Budd-Chiari综合征、失代偿期肝硬化或急性重型肝炎等。临床常用的Seattle和Baltimore诊断标准，均基于体重增加(腹水)、肝肿大以及黄疸等临床症状的改变进行判断。适用于国外较常见的造血干细胞移植后肝窦阻塞综合征(HSCT-HSOS)。而我国以PA-HSOS为主，其中因服用土三七导致的HSOS占50.0％～88.6％，肝组织病理学检查、血管造影等是PA-HSOS的重要方法，但是为创伤性的，加上大量患者不能准确回忆服药史，也无法提供服用的可疑药物或食物，导致即使肝脏病理检查发现肝窦淤血等组织学改变，也不能获得确切病因诊断。相当一部分患者没有得到及时诊断和恰当的治疗，导致预后不佳。
发展有效的精准诊断方法有助于解决PAs导致的HSOS诊治的“卡脖子”问题。针对PAs的致病机制，科学家将血浆等含毒素生物样本经生化处理后，将上清液与AgNO3、乙醇共孵育，将吡咯里西啶生物碱加成分子群体归一转化为关键的二羟乙基脱氢吡咯里西啶生物碱。随后经与DABA进行衍生化反应原位生成二甲氨苄吡咯里西啶碱(DABP)，用于HPLC-MS联用检测。经过与化学合成的DABP标准品进行HPLC-MS联用技术检测比对，通过检测相应分子的保留时间，可以达到得到病人来源样品的PAs存在的确切依据。通过对病人来源样品的PAs存在丰度进一步进行定量研究，还可以得到毒素含量与肝损伤程度的定量关系。
目前临床针对PA-HSOS患者血液中中毒成分定量的难点在于检测试剂盒的市场空白，因为获取标准品和加入内标定量是建立HSOS疾病标志物检测方案的关键因素，本研究团队自主合成了相关标准品，可用于吡咯里西啶生物碱的检测，并申请了发明专利CN115403587A，但是至今还没有合适的内标可用于吡咯里西啶生物碱的精确定量。
综上分析，(1)目前却还没有利用标准品及内标品同时精确定量十种血清中吡咯里西啶生物碱的报道，(2)目前还没有对于同时精确定量十种血清中吡咯里西啶生物碱的前处理方法的报道，(3)更没有经过性能验证的定量吡咯里西啶生物碱中毒筛查方法。这主要是十种生物碱在体内的含量极低，且对前处理和LC-MS/MS方法的要求严格，如果不进行归一化检测，则需要对瑞氏千里光碱、野百合碱、倒千里光碱、石蒜碱、瑞氏千里光碱N-氧化物、天芥菜碱、毛果天芥菜碱、山冈橐吾碱、克氏千里光碱、倒千里光裂碱进行分别开发质谱方法、液相方法及前处理方法，可能也能达到定量的要求，但费时费力，大大增加了开发和检测成本。
因此迫切需要一种操作简单、处理效率高、回收率高、成本低、人工工作量小等优点的药物性肝损伤吡咯里西啶生物碱的归一化检测方法，并找出最合适的标准品和内标，开发相应的药物性肝损伤吡咯里西啶生物碱的归一化检测试剂盒，以克服现有方法的不足和缺陷，并能保证检测结果的准确性和稳定性。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种吡咯里西啶生物碱的检测试剂盒及其检测方法和应用，通过选择合适的沉淀剂，一步即可完成沉淀，再经归一化反应，使十种药物性肝损伤吡咯里西啶生物碱转化为二羟乙基脱氢吡咯里西啶生物碱，并选择最佳的内标，经液相色谱串联质谱并采用内标法定量，实现吡咯里西啶生物碱的精确定量检测，流程短，特异性好，灵敏度高，可使DILI患者得到精准的病因诊断，及时避免进一步肝损伤，肝功能衰竭。
一方面，本发明提供了一种吡咯里西啶生物碱的归一化检测试剂盒，所述试剂盒包括沉淀剂、归一化反应试剂和内标溶液，所述内标溶液中含有苯妥英-d10内标，苯妥英-d10的结构如式Ⅰ所示。
本发明所述归一化检测，是指对样本中含量非常低的药物性肝损伤吡咯里西啶生物碱(PAs)的加成蛋白PPA，PPA经归一化反应试剂反应后，能统一转化为二羟乙基脱氢吡咯里西啶(dE-DHP，结构式如式Ⅱ所示)，再经液相色谱串联质谱一次性检出。
为了能更精确地定量检测二羟乙基脱氢吡咯里西啶生物碱，需要通过内标定量法进行精确定量，本发明针对二羟乙基脱氢吡咯里西啶生物碱选用了多种内标品，比如左乙拉西坦-D6、苯妥英-d10，还专门针对二羟乙基脱氢吡咯里西啶生物碱合成了PAs-D3的内标品，研究证明，苯妥英-d10是二羟乙基脱氢吡咯里西啶生物碱最为合适的内标，具有提高待测物响应信号，提高检测结果准确性的作用。
进一步地，所述内标溶液的溶剂为甲醇；所述药物性肝损伤吡咯里西啶生物碱包括瑞氏千里光碱(Riddelliine)、野百合碱(Monocrotaline)、倒千里光碱(Retrorsine)、石蒜碱(Lycopsamine)、瑞氏千里光碱N-氧化物(Riddelliine N-oxide)、天芥菜碱(Heliotrine)、毛果天芥菜碱(Lasiocarpine)、山冈橐吾碱(Clivorine)、克氏千里光碱(Senkirkine)、倒千里光裂碱(Retronecine)中的任意一种或多种。
本发明所述的十种吡咯里西啶生物碱(PAs)的结构式如下：
进一步地，所述沉淀剂包括丙酮、乙醇、异丙醇和乙酸铵。
吡咯里西啶生物碱(PAs)在血浆和细胞内会与含巯基蛋白质、谷胱甘肽、核苷碱基等亲核性物质反应，经加成反应得到一系列PAs加成蛋白(PPA)严重影响肝细胞正常生理功能。PAs的加成蛋白PPA共有如式Ⅲ所示的三种结构。
三种结构的PPA再经归一化反应试剂反应后，获得二羟乙基脱氢吡咯里西啶(dE-DHP)(式Ⅱ)。
因此在进行归一化反应之前，需要先将PPA从血液样本中沉淀出来，为了使PPA沉淀完全，现有方法中通常需要进行多步沉淀，比如先加入丙酮，混匀离心后弃上清，留沉淀蛋白，然后在沉淀的蛋白中再加入乙醇进行二次沉淀，混匀离心后弃上清，留沉淀蛋白，之后进行归一化反应。
本发明针对用于归一化反应之前的沉淀步骤进行改进，采用丙酮、乙醇、异丙醇和乙酸铵作为沉淀剂，可以实现经一步沉淀即可完成对PPA的充分富集，还有助于归一化反应的进行，并能提高检测结果的准确性。
进一步地，所述丙酮、乙醇、异丙醇的体积比为(10～30):(50～90):(5～15)，所述乙酸铵的含量为30～80mM。
进一步地，所述丙酮、乙醇、异丙醇的体积比为15:75:10，所述乙酸铵的含量为50mM。
进一步地，所述归一化反应试剂包括硝酸银、三氟乙酸溶液，和碳酸钾溶液，所述硝酸银含量为1～5％，三氟乙酸含量为1～10％，碳酸钾含量为20～30％。
另一方面，本发明提供了一种吡咯里西啶生物碱的归一化检测方法，所述方法采用如上所述的试剂盒进行检测；包括以下步骤：
(1)在待测样本中加入内标溶液，再加入沉淀剂，混匀离心弃上清，留蛋白沉淀；
(2)在蛋白沉淀中加入归一化反应试剂，震荡混匀；
(3)离心取上清，进行液相色谱串联质谱检测。
进一步地，步骤(2)所述震荡混匀的时间为1～3小时；步骤(3)所述液相色谱串联质谱分析采用MRM模式，选择210.1-163.9为定量离子对，227.2-163.9为定性离子对。
由于归一化反应所需时间较长，对方法的稳定性和推广性都存在考验，因此本发明对每一步的试剂配比及操作步骤都进行了优化，保证样品上样进入流动相的时候都在合理范围内，不影响质谱响应离子强度，使检测结果更加稳定和精确。
再一方面，本发明提供了一种组合物用于制备提高吡咯里西啶生物碱归一化检测灵敏度的沉淀剂的用途，所述组合物包括丙酮、乙醇、异丙醇和乙酸铵，所述药物性肝损伤吡咯里西啶生物碱包括瑞氏千里光碱、野百合碱、倒千里光碱、石蒜碱、瑞氏千里光碱N-氧化物、天芥菜碱、毛果天芥菜碱、山冈橐吾碱、克氏千里光碱、倒千里光裂碱中的任意一种或多种。
再一方面，本发明提供了苯妥英-d10用于制备提高吡咯里西啶生物碱归一化检测灵敏度的内标溶液的用途，所述药物性肝损伤吡咯里西啶生物碱包括瑞氏千里光碱、野百合碱、倒千里光碱、石蒜碱、瑞氏千里光碱N-氧化物、天芥菜碱、毛果天芥菜碱、山冈橐吾碱、克氏千里光碱、倒千里光裂碱中的任意一种或多种。
本发明具有以下有益效果：
(1)提供了一种药物性肝损伤吡咯里西啶生物碱的归一化为dE-DHP的检测方法，可以一针同时分析十种还有肝毒性的吡咯里西啶生物碱，并采用内标法定量，实现更加精准定量检测，并且整个流程时间短，通量高，特异性好，灵敏度高，能极大地节约耗材和时间成本；
(2)找到了最适于本发明提供的归一化检测方法的内标，具有提高待测物响应信号，提高检测结果准确性的作用；
(3)优化了前处理步骤，筛选了最优的沉淀剂，可以实现一步沉淀，高效富集PAs的蛋白质加合物PPA；
(4)优化了试剂配比及操作步骤，保证样品上样进入流动相的时候都在合理范围内，不影响质谱响应离子强度，使检测结果更加稳定和精确；
(5)成功应用于临床将使得大量DILI患者得到精准的病因诊断，及时避免进一步肝损伤，肝功能衰竭，从而拯救大量患者生命。
附图说明
图1：dE-DHP的校准曲线图谱；
图2：dE-DHP-D6作为内标的标准曲线图谱；
图3：左乙拉西坦-D6和dE-DHP的保留时间；
图4：左乙拉西坦-D6作为内标的标准曲线图谱；
图5：dE-DHP及dE-DHP定量用内标品的总离子流图及其定性定量离子对图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细描述，需要指出的是，以下所述实施例旨在便于对本发明的理解，而对其不起任何限定作用。本实施例中使用的试剂均为已知产品，通过购买市售产品获得。
实施例1：样品配制、前处理、检测、分析
一、仪器与试剂
1.仪器：UPLC I-Class IVD//>TQ-S IVD System超高效液相色谱串联质谱系统(Waters，美国)；离心机(Eppendorf，德国)；涡旋混合仪；(Miulab，中国)；Q-POD超纯水仪(Millipore，美国)；/>plus移液器(Eppendorf，德国)。
2.试剂耗材：HPLC级甲醇、乙腈、甲酸(Merck，美国)；分析纯硝酸银、三氟乙酸、碳酸钠(凌峰化工，中国)；标准品(按照发明专利CN115403587A制备)，内标苯妥英-d10(剑桥生物科学，英国)。
二、仪器条件
1.色谱条件：色谱柱：Kinetex C18(100×2.1mm,2.6μm)；流速：0.3mL/min；柱温：40℃；进样量：20L；流动相：A：0.03％的甲酸水溶液，B：甲醇；梯度洗脱，洗脱梯度见表1。
表1、洗脱梯度
| 时间(min) | B％ |
| 0 | 20 |
| 0.5 | 35 |
| 2.0 | 95 |
| 3.2 | 20 |
2.质谱条件：质谱采用电喷雾电离(ESI)模式，使用正离子模式。雾化气45psi，辅助加热器40psi，气帘气30psi，离子源温度500℃，正离子模式喷雾电压5500。定量和定性离子对表2。
表2、PAs归一化后PPA的离子对信息
| 化合物 | 母离子 | 子离子 | DP | CE |
| PPA-1 | 227.2 | 163.9 | 40 | 21 |
| PPA-2 | 210.1 | 163.9 | 40 | 24 |
| 苯妥英-IS-1 | 263.3 | 109.1 | 66 | 45 |
| 苯妥英-IS-2 | 263.3 | 82.2 | 72 | 70 |
三、试剂配制：
1.储备液配制：使用甲醇溶解dE-DHP标准品及苯妥英-d10内标，得到如下浓度的dE-DHP标准品及内标储备液：dE-DHP:2mg/mL，苯妥英-d10：1mg/mL。
2.中间液配制：分别移取dE-DHP储备液20μL，再加入至800μL甲醇，得dE-DHP标准品中间液，各dE-DHP浓度均为20μg/mL；移取苯妥英-d10内标储备液10μL，再加入至990μL甲醇，得苯妥英-d10中间液，浓度10μg/mL。
3.标准品工作液配制：将上述标准品中间液以空白血清基质配制成七个不同浓度点的标准品溶液，所述标准品溶液的七个浓度点为：2.5ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、1000ng/mL。
4.内标工作液配制：移取内标中间液40μL，再加1760μL 50％甲醇水溶液，得苯妥英-d10内标工作液，浓度为222ng/mL。
5.质控品配制：取上述dE-DHP标准品中间液以空白血清基质配制成三个不同浓度质控品，其中QC1含各dE-DHP 10ng/mL，QC2含各dE-DHP 100ng/mL，QC3含各dE-DHP 1000ng/mL。
6、沉淀剂配制：
分别量取150ml丙酮、750ml乙醇和100ml异丙醇，配置成含15％丙酮，75％乙醇和10％异丙醇的混合溶液，再称取3.85g乙酸铵，配置成含有50mM乙酸铵，15％丙酮，75％乙醇和10％异丙醇的沉淀剂。
7、归一化反应试剂配制：分别取100μL 2％ AgNO3 5％TFA溶液和60μL 25％碳酸钾溶液混合。
四、样品处理
(1)分别取待测样本血清、不同浓度梯度标准品、质控品各100μL于1.5mL离心管，加入苯妥英-d10内标工作液20μL后混匀，加入500μL沉淀剂，涡旋混合1min，在4℃下1000g离心5min后，弃去上清液，留蛋白沉淀；
(3)在待测样本沉淀中加入160μL归一化反应试剂后，在25℃条件下震荡1h；
(4)在4℃下1000g离心5min后取上清溶液100μL进行液相色谱串联质谱分析，进样20μL。
五、方法验证
1.定量下限(LLMI)和检出限(LoD)
根据《液相色谱-质谱临床应用建议》中的要求，采用标准品梯度稀释的方法考察了方法的定量下限和检出限。以空白血清基质梯度稀释标准品工作液中的浓度最低点，其中Level 1浓度2.5ng/mL，Level 2浓度1.25ng/mL，Level 3浓度0.75ng/mL，以相同步骤处理重复测定10次，结果见表3。实验结果显示在浓度为2.5ng/mL时，信噪比>20:1；CV＜10％并且偏差<5％，能够满足应用建议的要求，故生物碱质谱检测方法的定量下限为2.5ng/mL。在浓度为1.25ng/mL时，信噪比满足至少3:1，CV<10％，但偏差>15％，能够满足应用建议的LoD要求，但不能满足LLMI的要求，故1.25ng/mL为本发明方法的检出限。
表3、dE-DHP的定量下限和检出限
| 检测周期 | Level 1 | Level 2 | Level3 |
| 1 | 2.51 | 1.37 | 0.55 |
| 2 | 2.51 | 1.42 | 0.36 |
| 3 | 2.50 | 1.33 | 0.39 |
| 4 | 2.75 | 1.86 | 0.62 |
| 5 | 2.54 | 1.31 | 0.13 |
| 6 | 2.52 | 1.49 | 0.43 |
| 7 | 2.70 | 1.32 | 0.70 |
| 8 | 2.76 | 1.38 | 0.80 |
| 9 | 2.56 | 1.45 | 0.19 |
| 10 | 2.71 | 1.47 | 0.29 |
| 理论值 | 2.5 | 1.25 | 0.625 |
| 平均值 | 2.61 | 1.44 | 0.45 |
| 偏差％ | 4.25 | 15.18 | 28.69 |
| CV％ | 3.78 | 6.98 | 39.95 |
| 平均信噪比 | 85.3 | 21.2 | 15.5 |
2、校准曲线
采用同位素内标定量法，以标准品与内标的浓度比为X轴，标准品与内标物峰面积比为Y轴，建立校准曲线(见图1)，并计算出血清中待测物的浓度。dE-DHP在2.5-1000ng/mL拟合线性方程为Y＝0.04998x+0.11200，线性良好，相关系数：r＞0.999，具体见表4。根据《液相色谱-质谱临床应用建议》中的要求，实验结果显示LLMI浓度点及其余浓度点的偏差均<±10％，CV<10％，满足建议要求。
表4、dE-DHP的线性回归方程
3、精密度
以三个浓度水平的质控品QC1、QC2、QC3为样本评价方法精密度，采用相同步骤处理并重复测定5次，结果见表5。根据《液相色谱-质谱临床应用建议》中的要求，LLMI浓度附近低值CV<20％，其余CV<15％，实验结果显示在三水平质控浓度，CV均<15％，能够满足应用建议的要求。
表5、dE-DHP的精密度
| 检测周期 | QC 1 | QC 2 | QC 3 |
| 1 | 9.07 | 101.68 | 1004.14 |
| 2 | 9.64 | 100.77 | 1035.63 |
| 3 | 10.66 | 100.18 | 990.60 |
| 4 | 10.01 | 102.39 | 1034.48 |
| 5 | 11.32 | 95.89 | 987.17 |
| 均值 | 10.14 | 100.18 | 1010.41 |
| SD | 0.68 | 1.72 | 19.72 |
| CV％ | 6.70％ | 1.72％ | 1.95％ |
4、基质效应
以临床检测后剩余空白血浆样本作为基质样本，采用萃取后添加的峰面积与纯溶剂配制的标准溶液比值评价方法的基质效应，其中纯溶剂使用的是初始流动相，结果见表6。根据《液相色谱-质谱临床应用建议》，实验数据显示基质效应引起的CV<5％，表现为离子增强，满足应用建议要求。
表6、dE-DHP的基质效应
实施例2：不同内标对检测结果的影响
在吡咯里西啶生物碱的检测方法中使用内标，可以有效的提高方法的精密度和准确度，可以很好的校准由基质干扰造成的信号抑制或放大。由于标样和样品中的内标含量是一定的，可以用来校准进样带来的偏差，同时通过计算与目标物保留时间的比值，也可以用来定性。选择合适的内标是关键。
合适的内标一般具备以下特征：与待测分析物具有相似的理化性质、相近的色谱保留；与待测分析物或可能的干扰物具有足够的质谱分离度。因此，现有技术中常使用结构类似物作为内标，选取的结构类似物与待测分析物具有相同的关键化学结构和官能团，相似的分子大小和理化性质(LogD值和PKa等)。结构和性质的差异，将导致提取回收率和离子化效率的差异，进而对定量产生影响。
1、采用dE-DHP-D6为内标
质谱定量方法中的同位素内标首选化合物本身的同位素标记物，我们对纯品dE-DHP经酰化反应、磺化反应、水解，并进行反应条件优化，最后在两个甲基上用氘代氢，合成高丰度、高纯度dE-DHP-D6，如式Ⅴ所示：左为dE-DHP，经酰化反应、磺化反应、水解得到右，右为dE-DHP-D6。
但是我们在定标的时候发现标准曲线并不能成一条直线，因此我们通过比对单双空白样本对dE-DHP内标进行了考察，同时检测单空白样本B(不含标准物质但含同位素内标的空白样本)，双空白样本DB(不含标准物质且不含同位素内标的空白样本)以及定量下限样本，结果如表7所示。
表7：使用dE-DHP内标对定量的影响
由结果可见所合成的dE-DHP-D6在空白样本中也得到了标准品的响应，且与定量下限的标准物质强度类似，这表明发生了氢氘交换(内标dE-DHP-D6与待测dE-DHP化学结构相同，氢氘交换导致内标与待测样品无法区分)，氢氘交换导致同位素内标产生回标，严重影响定量结果，无法作为内标进行使用，使用dE-DHP-D6作为内标得到的标准曲线如图2，表达式为y＝0.00358x+0.00269(r＝0.84782)，由标准曲线图谱可见标准曲线与定量点拟合不佳，且r值较低，不适合作为本发明的内标。
2、采用左乙拉西坦-D6为内标
上述尝试表明结构类似物可能存在同位素不够稳定的问题，导致无法作为内标，于是本发明进一步尝试使用稳定的同位素内标：左乙拉西坦-D6(Levetiracetam-D6，Sigma-Aldrich(Dorset,UK))，分子式C8H8D6N2O2，分子量176.25，CAS号1133229-29-4，结构式如Ⅳ所示。
如图3所示，左乙拉西坦-D6的保留时间为2.42分钟，而dE-DHP的保留时间为1.81分钟，色谱行为存在一定差异，不是内标的最佳选择，标准曲线如图4所示，标准曲线方程为y＝0.00735x-0.02475(r＝0.74883)；左乙拉西坦-D6作为内标，由图4可知，定量点与标准曲线偏差大，不利于定量的准确，由标准曲线方程r值可知，其线性较差。
3、使用苯妥英-d10内标
上述尝试表明：结构相似导致氢氘交换，同位素不稳定，定量结果不可靠；左乙拉西坦-D6作为内标，其色谱行为与待测dE-DHP迥异，定量偏差大，线性较差；本发明还对其他多种内标进行试验，结果均与左乙拉西坦-D6相似。
本发明在对内标的试验中意外发现了一种内标苯妥英-d10，其与待测的dE-DHP结构迥异，但其作为内标的效果显著突出，其化学式为C15D10H2N2O2，结构如式Ⅰ所示，CAS号为65854-97-9，分子量262.33；根据试验结果，苯妥英-d10的色谱行为与dE-DHP较相似，保留时间为1.78分钟，与dE-DHP的1.81分钟相似，且标准曲线可呈现一条直线(表达式为Y＝0.04998x+0.11200，r＝0.99954)，由图1可知，标准曲线与定量点的拟合度较好，且R值远高于上述其他两种内标的R值，R值更接近1，即定量更准确。
其次，对单空白样本B(不含标准物质但含同位素内标的空白样本)，双空白样本DB(不含标准物质且不含同位素内标的空白样本)以及定量下限样本的测试结果显示：其同位素稳定，与待测物之间不会产生氢氘交换，因此苯妥英-d10作为内标不会影响定量结果，可以有效的提高方法的精密度和准确度。
上述结果可能的原因在于，苯妥英-d10虽与待测dE-DHP结构迥异，分子量也不一，但在整体体系中，各个步骤对这二者的影响相近，且在本发明的体系中色谱行为也相似，最大程度发挥了内标的效果，使定量准确，且提供了较高的精密度，这样的内标是很难找到的。
此外，本发明对上述三种内标，分别进行了对质控品QC1、QC2、QC3的测试，每一种内标分别对每一种质控品平行测试5次，按照实施例1所述的方法计算平均值M、标准差SD，以此计算变异系数CV＝SD/M，结果如表8所示。
表8：内标选择与变异系数
根据试验结果，dE-DHP-D6或左乙拉西坦-D6作为内标，10次试验的精密度很差，低浓度质控品测试的变异系数高于20％，中、高浓度质控品测试的变异系数高于15％，这表明测定结果不可靠，根据《液相色谱-质谱临床应用建议》中的要求，属于不能进行应用；苯妥英-d10的变异系数极低，对低浓度质控品测试时，变异系数均低于10％，对中、高浓度的质控品测试时，变异系数低于2％，这表明检测结果更稳定、更可靠，符合《液相色谱-质谱临床应用建议》中的要求，适合进行应用。
实施例3：沉淀剂的筛选
现有技术对于生物样本检测，常使用两步沉淀法：第一步，样本血清、标准品、质控品加入内标后与丙酮混合，混匀离心后弃上清；第二步，沉淀中加入乙醇，混匀离心后弃上清。
上述两步沉淀法存在一定的缺陷：每一步沉淀都会产生一定的损耗，分两步沉淀会产生更大的损耗，不利于精准的定量检测；仅仅使用丙酮、乙醇进行沉淀，沉淀效果不佳；两步沉淀，在操作上更繁琐。
因此，本发明为了避免多次沉淀带来的损耗，尝试配置一次沉淀的沉淀剂；因此，本实施例按照实施例1的方法进行测试，测试样本为质控品QC1(dE-DHP浓度为10ng/mL)，每一组沉淀剂平行测试10次，取均值作为试验结果，并计算变异系数，部分试验结果如表9所示。
表9：一次沉淀剂与QC1检测浓度结果
根据试验结果，一步使用丙酮或乙醇，最终测定的浓度要么严重高于实际浓度、要么严重低于实际浓度，将二者1:1体积混合作为一步沉淀剂，效果略有提升，但其效果依然不及文献的两步沉淀法；我们尝试加入其他醇类，一是改变溶剂极性、二是改变对dE-DHP的溶解性，于是我们对醇类进行大量筛选试验，发现只有加入异丙醇或正丁醇时最终检测的效果取得了一定程度的改善，而且其中异丙醇效果优于正丁醇；我们还对上述比例进行了大量优化试验，发现丙酮、乙醇、异丙醇的体积比例为(10～30):(50～90):(5～15)时均能够产生较好的检测效果：检测浓度更接近真实值，提高了检测准确性，变异系数更小，检测精密度提升；其中，15％丙酮，75％乙醇、10％异丙醇的混合溶液取得了最好的效果，其测定浓度最接近实际浓度，偏差小于5％，变异系数低于10％。
为了提高沉淀的效果，进一步提高准确性与精密度，本发明在5％丙酮，75％乙醇、10％异丙醇的混合溶液的基础上，尝试分别加入一些化合物作为促进剂以促进沉淀，浓度均为50mM，加入聚乙二醇时质量为5g；设置有空白组(仅5％丙酮，75％乙醇、10％异丙醇的混合溶液)、对照A组(采用文献的两步沉淀法，在两步的沉淀剂中均加入50mM的乙酸铵)、对照B组(丙酮一次沉淀，丙酮含有50mM的乙酸铵)、对照C组(乙醇一次沉淀，乙醇含有50mM的乙酸铵)；并按照实施例1的方法进行测试，测试样本为质控品QC1(dE-DHP浓度为10ng/mL)，每一组沉淀剂平行测试10次，取均值作为试验结果，并计算变异系数，部分试验结果如表10所示。
表10：沉淀剂的促进剂与QC1检测浓度结果
| 促进剂 | QC1检测浓度(ng/mL) | 变异系数(％) |
| \ | 9.5 | 9.74 |
| 硫酸铵 | 9.4 | 9.62 |
| 硫酸锌 | 9.5 | 9.51 |
| 硫酸葡聚糖钠 | 9.5 | 9.38 |
| 磷钨酸 | 9.5 | 9.77 |
| 乙酸铵 | 9.9 | 6.70 |
| 乙酸钠 | 9.5 | 9.29 |
| 聚乙二醇 | 9.4 | 9.06 |
| 30mM乙酸铵 | 9.8 | 7.16 |
| 80mM乙酸铵 | 9.8 | 7.13 |
| 对照A(两步沉淀法+乙酸铵) | 8.6 | 16.44 |
| 对照B(丙酮+乙酸铵) | 8.1 | 18.59 |
| 对照C(乙醇+乙酸铵) | 8.3 | 18.27 |
根据试验结果，大多数化合物对本发明的检测结果没有明显的作用，只有乙酸铵能够起到效果，且检测结果非常接近真实值，检测的准确性好，且便宜系数低于10％，检测的精密度明显提高；在5％丙酮，75％乙醇、10％异丙醇的混合溶液加入乙酸铵能够显著提高检测准确度与精密度，而在两步沉淀法或丙酮、乙醇的一步沉淀中加入均无法产生明显效果；上述现象的原因在于：乙酸铵与本发明的沉淀剂(5％丙酮，75％乙醇、10％异丙醇的混合溶液)高度匹配，能协同促进沉淀的完全发生，减小一般前处理会产生的误差；而与其他沉淀剂无法协同生效，只能发挥单一沉淀剂的效果。且进一步的试验表明，乙酸铵的浓度在30～80mM内均能发挥较好的沉淀作用，最优的为50mM。
于是，我们得到了含有30～80mM乙酸铵，丙酮、乙醇、异丙醇比例为(10～30):(50～90):(5～15)的沉淀剂，能够通过一步沉淀对本发明对血清中吡咯里西啶生物碱的检测，起到更优于文献公开的两步沉淀的作用，极大提高检测的准确性与精密度。其中，含有50mM乙酸铵的15％丙酮，75％乙醇、10％异丙醇的混合溶液效果最佳。
实施例4：内标溶剂的筛选
为实现内标的效果，本实施例对溶解内标的溶剂进行了筛选试验，按照实施例1的方式进行各工作液的配置、并上机测试，测试对象为质控品QC1(dE-DHP浓度为10ng/mL)，设置多组不同的内标溶剂，每一组内标溶剂平行测试10次，取均值作为试验结果，部分筛选试验结果如表11所示。
表11：内标溶剂与QC1检测浓度结果
| 内标溶剂 | QC1检测浓度(ng/mL) |
| 甲醇 | 9.1 |
| 乙腈 | 8.7 |
| 甲醇:乙腈＝1:1 | 8.9 |
| 50％甲醇水 | 9.9 |
| 50％乙腈水 | 8.9 |
| 60％甲醇水 | 9.8 |
| 40％甲醇水 | 9.7 |
根据试验结果，可能是由于不同的内标溶剂极性不同，内标溶剂的选取对最终的检测结果会产生较大的影响，其中50％甲醇水作为溶剂是最佳的，检测浓度最接近真实浓度，另外对多种比例的甲醇水也做了筛选试验，发现50％是甲醇水的最佳的体积分数；其他内标溶剂加入时影响沉淀效率，反而削弱检测准确性。
实施例5：离子对的选择
在LC-MS中建立定量方法时，确定定量离子对和定性离子对是非常关键的。
定量离子对：通常选择强度最高的离子作为定量离子，因为它提供了最佳的信噪比。在实际操作中，首先需要获取目标化合物的全扫描质谱图谱，然后从中找到最高丰度的且具有代表性的离子。这些离子可以是分子离子(如[M+H]+或[M-H]-)或特征碎片离子。在选择定量离子对时，应确保它们在方法的线性范围内呈现良好的线性关系。
定性离子对：定性离子通常用于验证目标化合物的结构和身份。从全扫描质谱图谱中选择强度较高的、具有结构特征的离子作为定性离子。选择定性离子时，要确保它们与目标化合物的结构和化学性质相关，并且在实际应用中具有足够的选择性和特异性。
我们筛选并测试了四种离子对，得到了dE-DHP及dE-DHP内标品的总离子流图及其定性定量离子对图，如图4所示；根据峰形和响应，我们确定选择响应最高的210.1-163.9为定量离子对，响应其次的227.2-163.9为定性离子对。
虽然本发明披露如上，但本发明并非限定于此。任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种更动与修改，因此本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。
Claims (10)
1.一种吡咯里西啶生物碱的归一化检测试剂盒，其特征在于，包括沉淀剂、归一化反应试剂和内标溶液，所述内标溶液中含有苯妥英-d10内标。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述内标溶液的溶剂为甲醇水溶液；所述药物性肝损伤吡咯里西啶生物碱包括瑞氏千里光碱、野百合碱、倒千里光碱、石蒜碱、瑞氏千里光碱N-氧化物、天芥菜碱、毛果天芥菜碱、山冈橐吾碱、克氏千里光碱、倒千里光裂碱中的任意一种或多种。
3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述沉淀剂包括丙酮、乙醇、异丙醇和乙酸铵。
4.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述丙酮、乙醇、异丙醇的体积比为(10～30):(50～90):(5～15)，所述乙酸铵的含量为30～80mM。
5.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述丙酮、乙醇、异丙醇的体积比为15:75:10，所述乙酸铵的含量为50mM。
6.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述归一化反应试剂包括硝酸银、三氟乙酸溶液，和碳酸钾溶液，所述硝酸银含量为1～5％，三氟乙酸含量为1～10％，碳酸钾含量为20～30％。
7.一种吡咯里西啶生物碱的归一化检测方法，其特征在于，采用如权利要求1-6任一项所述的试剂盒进行检测；包括以下步骤：
(1)在待测样本中加入内标溶液，再加入沉淀剂，混匀离心弃上清，留蛋白沉淀；
(2)在蛋白沉淀中加入归一化反应试剂，震荡混匀；
(3)离心取上清，进行液相色谱串联质谱检测。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述震荡混匀的时间为1～3小时；步骤(3)所述液相色谱串联质谱分析采用MRM模式，选择210.1-163.9为定量离子对，227.2-163.9为定性离子对。
9.一种组合物用于制备提高吡咯里西啶生物碱归一化检测灵敏度的沉淀剂的用途，其特征在于，所述组合物包括丙酮、乙醇、异丙醇和乙酸铵，所述药物性肝损伤吡咯里西啶生物碱包括瑞氏千里光碱、野百合碱、倒千里光碱、石蒜碱、瑞氏千里光碱N-氧化物、天芥菜碱、毛果天芥菜碱、山冈橐吾碱、克氏千里光碱、倒千里光裂碱中的任意一种或多种。
10.苯妥英-d10用于制备提高吡咯里西啶生物碱归一化检测灵敏度的内标溶液的用途，所述药物性肝损伤吡咯里西啶生物碱包括瑞氏千里光碱、野百合碱、倒千里光碱、石蒜碱、瑞氏千里光碱N-氧化物、天芥菜碱、毛果天芥菜碱、山冈橐吾碱、克氏千里光碱、倒千里光裂碱中的任意一种或多种。
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Legal Events
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