CN117720971A - 用于化学发光免疫检测的清洗液和化学发光免疫检测方法 - Google Patents
用于化学发光免疫检测的清洗液和化学发光免疫检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117720971A CN117720971A CN202311442164.5A CN202311442164A CN117720971A CN 117720971 A CN117720971 A CN 117720971A CN 202311442164 A CN202311442164 A CN 202311442164A CN 117720971 A CN117720971 A CN 117720971A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- optionally
- cleaning solution
- chemiluminescent immunoassay
- cleaning
- nonionic surfactant
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 title claims abstract description 100
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 title claims abstract description 57
- DMSMPAJRVJJAGA-UHFFFAOYSA-N benzo[d]isothiazol-3-one Chemical compound C1=CC=C2C(=O)NSC2=C1 DMSMPAJRVJJAGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 47
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 46
- 229940100555 2-methyl-4-isothiazolin-3-one Drugs 0.000 claims abstract description 32
- BEGLCMHJXHIJLR-UHFFFAOYSA-N methylisothiazolinone Chemical compound CN1SC=CC1=O BEGLCMHJXHIJLR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 32
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 28
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 claims abstract description 23
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 claims abstract description 21
- 230000008569 process Effects 0.000 claims abstract description 12
- 238000003860 storage Methods 0.000 claims abstract description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 53
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 claims description 24
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 22
- HUDPLKWXRLNSPC-UHFFFAOYSA-N 4-aminophthalhydrazide Chemical class O=C1NNC(=O)C=2C1=CC(N)=CC=2 HUDPLKWXRLNSPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 19
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 18
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 18
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 18
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 16
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical group [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 15
- ONJQDTZCDSESIW-UHFFFAOYSA-N polidocanol Chemical compound CCCCCCCCCCCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCO ONJQDTZCDSESIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims description 12
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 11
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 9
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 8
- 230000005284 excitation Effects 0.000 claims description 7
- -1 X-114 Chemical compound 0.000 claims description 6
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 5
- LEOJISUPFSWNMA-UHFFFAOYSA-N ABEI Chemical compound O=C1NNC(=O)C=2C1=CC(N(CCCCN)CC)=CC=2 LEOJISUPFSWNMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 claims description 4
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 claims description 4
- IEQAICDLOKRSRL-UHFFFAOYSA-N 2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-dodecoxyethoxy)ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethanol Chemical compound CCCCCCCCCCCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCO IEQAICDLOKRSRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 3
- 230000037452 priming Effects 0.000 claims description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 32
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 abstract description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 4
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 abstract description 3
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 18
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 14
- 108010048233 Procalcitonin Proteins 0.000 description 12
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 12
- CWCXERYKLSEGEZ-KDKHKZEGSA-N procalcitonin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)NCC(O)=O)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CSSC1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 CWCXERYKLSEGEZ-KDKHKZEGSA-N 0.000 description 12
- 239000000047 product Substances 0.000 description 12
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 11
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 10
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 8
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 8
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 8
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 7
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 4
- 239000012263 liquid product Substances 0.000 description 4
- HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N luminol Chemical compound O=C1NNC(=O)C2=C1C(N)=CC=C2 HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000029058 respiratory gaseous exchange Effects 0.000 description 4
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 4
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 4
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 4
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 3
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 3
- 238000013329 compounding Methods 0.000 description 3
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 3
- 230000005281 excited state Effects 0.000 description 3
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 3
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 3
- 208000006379 syphilis Diseases 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- WGLQHUKCXBXUDV-UHFFFAOYSA-N 3-aminophthalic acid Chemical compound NC1=CC=CC(C(O)=O)=C1C(O)=O WGLQHUKCXBXUDV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 2
- 230000000254 damaging effect Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000005283 ground state Effects 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M hydroxide Chemical compound [OH-] XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 239000002563 ionic surfactant Substances 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 1
- 108091007491 NSP3 Papain-like protease domains Proteins 0.000 description 1
- 241000589884 Treponema pallidum Species 0.000 description 1
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000002038 chemiluminescence detection Methods 0.000 description 1
- VXIVSQZSERGHQP-UHFFFAOYSA-N chloroacetamide Chemical class NC(=O)CCl VXIVSQZSERGHQP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005260 corrosion Methods 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- SFNALCNOMXIBKG-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol monododecyl ether Chemical compound CCCCCCCCCCCCOCCO SFNALCNOMXIBKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000005111 flow chemistry technique Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000011325 microbead Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 150000002978 peroxides Chemical class 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000005086 pumping Methods 0.000 description 1
- 238000004451 qualitative analysis Methods 0.000 description 1
- 239000013062 quality control Sample Substances 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
Landscapes
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
Abstract
本发明提出了用于化学发光免疫检测的清洗液和化学发光免疫检测方法，所述清洗液含有防腐剂，所述防腐剂选自甲基异噻唑啉酮和苯并异噻唑啉酮。本发明的清洗液在储运过程稳定，清洗能力强，可以有效分离结合免疫反应物和非特异性干扰物质，并且提供适宜的检测环境，保证化学发光免疫检测正常进行，有助于提高检测的信噪比、重复性和准确性。
Description
技术领域
本发明涉及生物领域。具体地，本发明涉及用于化学发光免疫检测的清洗液和化学发光免疫检测方法。
背景技术
目前化学发光领域的主流方法学为化学发光免疫分析法，化学发光免疫分析是一种检测微量抗原或抗体的免疫分析技术。这种方法兼有发光分析的高灵敏度和抗原抗体反应的高特异性，且具有检测范围宽和检测时间短等优点，可以用于各种抗原、抗体、激素、脂肪酸和维生素等的检测分析，是临床上常用的体外检测技术。
异鲁米诺或其衍生物为现有化学发光免疫分析法中用到的一种发光标记物，具有不易水解、反应迅速和发光效率高的优势。异鲁米诺或其衍生物发光检测体系的具体原理为将待测物抗原(抗体)包被固相载体形成固相载体-免疫复合物，异鲁米诺或其衍生物标记待测物抗原(抗体)制备标记结合物，通过免疫反应形成抗原-抗体-标记抗原(抗体)复合物，发光强度与待测物抗体(抗原)的含量成比例关系。在免疫检测过程中，需要在特定的节点加入清洗液清洗去除未结合到固相载体-免疫复合物的物质，这就要求清洗液具备稳定的性质，既要达到良好的清洗效果，更重要的是不能影响异鲁米诺或其衍生物发光体系的检测。
现有清洗液在长期储存、运输过程中，尤其是遭遇极端条件后(如夏季海运可达45-55℃的高温)，易发生理化性质的改变，难以稳定保存，不稳定的清洗液会影响异鲁米诺或其衍生物发光体系的发光性能，导致检测结果不准确。因此，亟需一种新的清洗液，能够长期稳定保存，以保证异鲁米诺或其衍生物发光体系的检测准确性。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题。为此，本发明提出了用于化学发光免疫检测的清洗液和用于化学发光免疫检测系统在化学发光免疫检测中的应用、化学发光免疫检测方法、提高用于化学发光免疫检测的清洗液在储存过程中稳定性的方法，本发明的清洗液在储存过程中稳定，保证化学发光免疫检测的准确性，且清洗能力强，可以有效分离结合的免疫反应物及非特异性干扰物质，有助于提高检测的信噪比和重复性。并且，本发明的清洗液制备方法工艺简单，操作方便，适于生产和推广应用。
需要说明的是，本发明是基于发明人的下列发现而完成的：
本发明的发明人发现应用于异鲁米诺或其衍生物的化学发光免疫体系的清洗液在储存过程中不稳定，极大地影响上述化学发光免疫体系的发光性能，从而影响检测的准确性。
有鉴于此，本发明的发明人经过大量的理论分析和实验探索，创造性地获得一种新的清洗液配方，其中，选择苯并异噻唑啉酮(BIT)和甲基异噻唑啉酮(MIT)作为防腐剂，可在长期储存过程中保持稳定，不干扰化学发光免疫检测正常进行。
进一步地，发明人在清洗液中添加表面活性剂，以提高清洗能力。在选择表面活性剂种类时，发明人发现，离子型表面活性剂对于化学发光体系中部分蛋白有损伤作用，因此选择非离子型表面活性剂作为清洗液成分。发明人经深入研究筛选获得了较佳的非离子型表面活性剂，其不仅具有较好的清洗能力，以降低大部分非特异性结合，有助于提高检测的信噪比和重复性。
为此，在本发明的一个方面，本发明提出了一种用于化学发光免疫检测的清洗液。根据本发明的实施例，所述清洗液含有防腐剂，所述防腐剂选自甲基异噻唑啉酮和苯并异噻唑啉酮。
根据本发明实施例的清洗液中，防腐剂包括BIT和MIT，这两种成分通过穿透细胞膜，抑制细胞呼吸过程中的关键酶达到一致细胞活性的效果，具有快速、广谱的抗菌能力。其中，BIT在抑菌的同时具有极好的热稳定性，可在恶劣运输环境下保障试剂产品的抑菌能力。与MIT联用时，对BIT能产生一定的增溶增效作用，能够提高BIT在清洗液产品中的溶解度，减少低温下BIT析出风险，并增加防腐剂穿透细胞膜的能力，提高产品整体抑菌效果。
根据本发明的实施例，上述用于化学发光免疫检测的清洗液还可以具有下列附加技术特征：
根据本发明的实施例，所述甲基异噻唑啉酮和苯并异噻唑啉酮的质量比为1：(0.5～3)，例如1:0.5、1:1、1:1.5、1:2、1：2.5、1:3，优选1:2～1:3。由此，可以进一步提高抑菌效果，维持体系pH值稳定，并且，复配下BIT在清洗液中的溶解度高，不易析出。采用上述较佳配比，一方面避免了BIT添加过多而导致析出，另一方面避免了MIT单一使用而导致抑菌能力不足。
根据本发明的实施例，以所述清洗液的总体积计，所述防腐剂的含量为0.05～0.5g/L，例如为0.05g/L、0.1g/L、0.15g/L、0.2g/L、0.25g/L、0.3g/L、0.35、0.4、0.45、0.5g/L，其中优选0.1～0.3g/L。由此，可以进一步提高抑菌效果，维持体系pH值稳定。
根据本发明的实施例，所述清洗液进一步含有非离子型表面活性剂，所述非离子型表面活性剂选自AEO-9、X-100、X-114、T-20、Brij35、NP40和NP10中的至少一种。发明人发现，离子型表面活性剂对于化学发光体系中部分蛋白有损伤作用，因此选择非离子型表面活性剂作为清洗液成分。发明人经深入研究筛选获得了上述较佳的非离子型表面活性剂，其不仅具有较好的清洗能力，可有效破坏非特异的复合物之间的结合，同时避免破坏特异性的免疫复合物结合，达到非特异复合物解离的效果，从而提高试剂的特异性，有助于提高检测的信噪比和重复性。
根据本发明的实施例，所述非离子型表面活性剂选自AEO-9、X-114和NP40中的至少一种。由此，可以进一步提高清洗能力，提高检测的信噪比和重复性。
在一些实施例中，所述非离子型表面活性剂选自下列四种组合之一：
组合1：AEO-9和X-114。
组合2：AEO-9和NP40。
组合3：X-114和NP40。
组合4：AEO-9、X-114和NP40。
根据本发明的实施例，以所述清洗液的总体积计，所述非离子型表面活性剂的含量为0.1～10g/L，例如为0.5g/L、1g/L、3g/L、5g/L、8g/L。其中，优选0.1～2g/L。由此，可以进一步提高清洗能力，提高检测的信噪比和重复性。
根据本发明的实施例，任意两种所述非离子型表面活性剂的质量比为(0.5～1.5)：(0.5～1.5)，例如1:1、1:2、2:3、1.5:1、2:1、2.5:1、3:1、3:2，其中优选(0.8～1.2)：(0.8～1.2)。由此，可以进一步提高清洗能力，提高检测的信噪比和重复性。
根据本发明的实施例，所述清洗液进一步含有缓冲液和氯化钠。添加缓冲液有助于维持体系的pH值。添加氯化钠有助于提供适宜免疫反应的离子环境。
根据本发明的实施例，所述缓冲液选自三羟甲基氨基甲烷和盐酸。
根据本发明的实施例，以所述清洗液的总体积计，所述氯化钠的含量为1～10g/L，例如为2g/L、4g/L、5g/L、6g/L、8g/L。由此，以便更好地适于免疫反应。
根据本发明的实施例，所述用于化学发光免疫检测的清洗液的pH值为7.5～8.3，例如7.6、7.8、8.0、8.2。由此，有助于维持清洗液的稳定性，且有助于免疫反应。
在本发明的另一方面，本发明提出了一种用于化学发光免疫检测的系统。根据本发明的实施例，所述系统包括：前面所述用于化学发光免疫检测的清洗液。由此，根据本发明实施例的试剂盒中的清洗液稳定且清洗能力强，可以有效分离结合的免疫反应物及非特异性干扰物质，并且提供适宜的检测环境，保证化学发光免疫检测正常进行。前面针对用于化学发光免疫检测的清洗液所描述的特征和优点，同样适用于化学发光免疫检测的系统。
根据本发明实施例的清洗液中，防腐剂包括BIT和MIT。这两种成分通过穿透细胞膜，抑制细胞呼吸过程中的关键酶达到一致细胞活性的效果，具有快速、广谱的抗菌能力。其中，BIT在抑菌的同时具有极好的热稳定性，可在恶劣运输环境下保障试剂产品的抑菌能力。与MIT联用时，对BIT能产生一定的增溶增效作用，能够提高BIT在清洗液产品中的溶解度，减少低温下BIT析出风险，并增加防腐剂穿透细胞膜的能力，提高产品整体抑菌效果。能够维持体系稳定。
根据本发明的实施例，所述甲基异噻唑啉酮和苯并异噻唑啉酮的质量比为1：(0.5～3)，例如1:0.5、1:1、1:1.5、1:2、1：2.5、1:3，其中优选1:2～1:3。由此，可以进一步提高抑菌效果，维持体系pH值稳定，并且，复配下BIT在清洗液中的溶解度高，不易析出。采用上述较佳配比，一方面避免了BIT添加过多而导致析出，另一方面避免了MIT单一使用而导致抑菌能力不足。
根据本发明的实施例，以所述清洗液的总体积计，所述防腐剂的含量为0.05～0.5g/L，例如为0.05g/L、0.1g/L、0.15g/L、0.2g/L、0.25g/L、0.3g/L、0.35、0.4、0.45、0.5g/L，其中优选0.1～0.3g/L。由此，可以进一步提高抑菌效果，维持体系pH值稳定。
根据本发明的实施例，所述化学发光免疫检测的系统进一步包括下列至少一种：激发底物、标记有发光标记物的抗原或抗体和包被有抗原或抗体的固相载体。
根据本发明的实施例，所述发光标记物包括异鲁米诺衍生物。
根据本发明的实施例，所述异鲁米诺衍生物的基本结构为：
其中，R1选自C2H5、C3H7或C4H9，R2选自NH2-(CH2)4、NH2-(CH2)6、NH2-(CH2)8或NH2-(CH2)10。
上述发光标记物为在发光反应中参与能量转移并最终以发射光子的形式释放能量的化合物，该化合物能够经催化剂的催化和氧化剂的氧化，形成一个激发态的中间体，当这种激发态中间体回到稳定的基态时，同时发射出光子(hM)。
根据本发明的实施例，所述异鲁米诺衍生物选自N-(4-氨丁基)-N-乙基异鲁米诺(ABEI)。
根据本发明的实施例，所述激发底物选自NaOH和H2O2。异鲁米诺或异鲁米诺衍生物与氢氧化物反应时生成双负离子，它可被过氧化氢分解出的氧气氧化，生成很不稳定的过氧化物，立即分解出氮气，生成激发态的3-氨基邻苯二甲酸。
在本发明的又一方面，本发明提出了前面所述用于化学发光免疫检测的清洗液或用于化学发光免疫检测的系统在化学发光免疫检测中的应用。如前所述，本发明的清洗液在储存过程中稳定，清洗能力强，可以有效分离结合的免疫反应物及非特异性干扰物质，并且提供适宜的检测环境，保证化学发光免疫检测正常进行，有助于提高检测的信噪比和重复性。前面针对用于化学发光免疫检测的清洗液和用于化学发光免疫检测的系统所描述的特征和优点，同样适用于该应用，在此不再赘述。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种化学发光免疫检测方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：利用前面所述用于化学发光免疫检测的清洗液清洗固相载体-免疫复合物的过程。前面针对用于化学发光免疫检测的清洗液所描述的特征和优点，同样适用于该方法，在此不再赘述。
术语“免疫复合物”既包含了抗原和抗体特异性结合形成的免疫复合物，也包含了非特异结合形成的复合物，由于非特异性结合形成的复合物之间结合力较弱，抗原表位与抗体超变区分子间的结构互补性较差导致亲和力较弱，在本发明清洗液的清洗作用下容易解离，而特异性结合形成的免疫复合物之间结合力较强，清洗作用下不易解离，由此可以实现分离目的，便于后续化学发光检测。
根据本发明的实施例，所述方法包括：将待测样本、标记有发光标记的抗原或抗体、包被有抗原或抗体的固相载体进行混合和孵育，得到反应产物，所述反应产物中含有固相载体-免疫复合物；分离出固相载体-免疫复合物，去除上清液，利用所述清洗液清洗所述固相载体-免疫复合物；将清洗后的所述固相载体-免疫复合物与激发底物混合，检测发出的相对光强度；基于所述相对光强度，对待测样本进行定量或者定性分析。
根据本发明实施例的清洗液中，防腐剂包括BIT和MIT。这两种成分通过穿透细胞膜，抑制细胞呼吸过程中的关键酶达到一致细胞活性的效果，具有快速、广谱的抗菌能力。其中，BIT在抑菌的同时具有极好的热稳定性，可在恶劣运输环境下保障试剂产品的抑菌能力。与MIT联用时，对BIT能产生一定的增溶增效作用，能够提高BIT在清洗液产品中的溶解度，减少低温下BIT析出风险，并增加防腐剂穿透细胞膜的能力，提高产品整体抑菌效果。能够维持体系稳定。
根据本发明的实施例，所述甲基异噻唑啉酮和苯并异噻唑啉酮的质量比为1：(0.5～3)，例如1:0.5、1:1、1:1.5、1:2、1：2.5、1:3，其中优选1:2～1:3。由此，可以进一步提高抑菌效果，维持体系稳定，并且，复配下BIT在清洗液中的溶解度高，不易析出。采用上述较佳配比，一方面避免了BIT添加过多而导致析出，另一方面避免了MIT单一使用而导致抑菌能力不足。
根据本发明的实施例，以所述清洗液的总体积计，所述防腐剂的含量为0.05～0.5g/L，例如为0.05g/L、0.1g/L、0.15g/L、0.2g/L、0.25g/L、0.3g/L、0.35、0.4、0.45、0.5g/L，其中优选0.1～0.3g/L。由此，可以进一步提高抑菌效果，维持体系稳定。
根据本发明的实施例，所述发光标记物包括异鲁米诺衍生物。
根据本发明的实施例，所述异鲁米诺衍生物的基本结构为：
其中，R1选自C2H5、C3H7或C4H9，R2选自NH2-(CH2)4、NH2-(CH2)6、NH2-(CH2)8或NH2-(CH2)10。
根据本发明的实施例，所述异鲁米诺衍生物选自N-(4-氨丁基)-N-乙基异鲁米诺(ABEI)。
根据本发明的实施例，所述激发底物选自NaOH和H2O2。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种提高用于化学发光免疫检测的清洗液在储存过程中稳定性的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：使所述清洗液中含有防腐剂，所述防腐剂选自甲基异噻唑啉酮和苯并异噻唑啉酮。如前所述，BIT和MIT可以通过穿透细胞膜，抑制细胞呼吸过程中的关键酶达到一致细胞活性的效果，具有快速、广谱的抗菌能力。其中，BIT在抑菌的同时具有极好的热稳定性，可在恶劣运输环境下保障试剂产品的抑菌能力。与MIT联用时，对BIT能产生一定的增溶增效作用，能够提高BIT在清洗液产品中的溶解度，减少低温下BIT析出风险，并增加防腐剂穿透细胞膜的能力，提高产品整体抑菌效果，维持体系稳定。
根据本发明的实施例，所述甲基异噻唑啉酮和苯并异噻唑啉酮的质量比为1：(0.5～3)。
根据本发明的实施例，以所述清洗液的总体积计，所述防腐剂的含量为0.05～0.5g/L，优选0.1～0.3g/L。
根据本发明的实施例，所述清洗液中含有非离子型表面活性剂，所述非离子型表面活性剂包括AEO-9、X-100、X-114、NP40和NP10中的至少一种。
根据本发明的实施例，所述非离子型表面活性剂选自AEO-9、X-114和NP40中的至少一种。
根据本发明的实施例，以所述清洗液的总体积计，所述非离子型表面活性剂的含量为0.1～10g/L，优选0.1～2g/L。
根据本发明的实施例，任意两种所述非离子型表面活性剂的质量比为(0.5～1.5)：(0.5～1.5)，优选(0.8～1.2)：(0.8～1.2)。
根据本发明的实施例，所述清洗液进一步含有缓冲液和氯化钠，优选地，所述缓冲液选自三羟甲基氨基甲烷和盐酸。
根据本发明的实施例，以所述清洗液的总体积计，所述氯化钠的含量为1～10g/L。
根据本发明的实施例，所述用于化学发光免疫检测的清洗液的pH值为7.5～8.3。
需要说明的是，前面针对用于化学发光免疫检测的清洗液所描述的特征和优点，同样适用于该方法，在此不再赘述。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
以下实施例中涉及到的试剂、仪器和检测方法如下：
1、试剂和仪器
BIT：苏州晶茂生物GB01030
MIT：苏州晶茂生物GB01009
AEO-9、X-100、X-114、NP40、NP10、T-20、T-80、Brij35：购自阿拉丁
Maglumi4000P：深圳市新产业生物医学工程股份有限公司自产
质控品：购自朗道公司
PCT、HBsAg、Syphilis、CA153化学发光免疫试剂盒：深圳市新产业生物医学工程股份有限公司自产(发光标记物为ABEI)
2、方法(以双抗体夹心法为例)
A、将分别标记有异鲁米诺衍生物(ABEI)的第一株抗体和待测血清混匀温育。
B、待免疫反应完成后，再加入包被另一株抗体的免疫纳米磁性微珠。
C、在外加磁场的作用下，分离出磁性微珠-免疫复合物，用清洗液清洗磁性微珠-免疫复合物，去除上清液，将底部试管放入测量室内。
D、泵入激发底物NaOH和H2O2，异鲁米诺衍生物与氢氧化物反应时生成双负离子，它可被过氧化氢分解出的氧气氧化，生成很不稳定的过氧化物，立即分解出氮气，生成激发态的3-氨基邻苯二甲酸。激发态至基态转化中，释放的能量以光子的形式存在，波长位于可见光的蓝光部分。
E、用光电倍增管计数试管内混合产物发出的光子数量，用分析仪分析得出待测物的结果。
实施例一
在该实施例中，比较清洗液中不同防腐剂种类对化学发光免疫检测的影响，其中，清洗液的组成如下：
基础组分：三羟甲基氨基甲烷3.03g/L、稀盐酸5.60mL/L、氯化钠5.5g/L。
表面活性剂：吐温20 0.55g/L。
清洗液的pH值为7.9。
根据下表防腐剂的组分分别配置清洗液。
表1清洗液组成
| 组别 | 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 实施例4 | 对比例1 | 对比例2 |
| 防腐剂 | BIT+MIT | BIT+MIT | BIT+MIT | BIT+MIT | Proclin300 | 氯乙酰胺 |
| 添加比例 | 3:1 | 2：1 | 1:1 | 1:2 | / | / |
| 添加量g/L | 0.15+0.05 | 0.1+0.05 | 0.07+0.07 | 0.05+0.1 | 0.76 | 1.0 |
将各组清洗液在室温、避光长期储存，在新产业生物自产的全自动化学发光仪Maglumi 4000P上采用PCT化学发光免疫试剂盒检测PCT试剂的重复性、准确性和信噪比。
信噪比：20.1ng/mL浓度的质控样本与空白试剂的光强信号比值，信噪比越高，清洗液的清洗能力越高。
重复性：将降钙素原(PCT)浓度为20.1ng/mL的样本分成十份上机检测，计算平均值M及变异系数CV；
准确性：将已知值的样本上机进行检测，比较检测结果与真实值的偏差；结果见下表：
表2重复性和信噪比结果
表3PCT项目的样本准确性结果
结果如表2-3所示，对比例清洗液在放置6、12、24个月后，严重影响了ABEI发光体系的发光性能，重复性和信噪比变差，而以实施例1-4的组分配置的清洗液，在长期放置的情况下试剂性能均没有出现明显的变化，表现出良好的稳定性，检测信噪比和重复性明显优于对比例。在准确度的实验中，针对PCT已知浓度样本L1：1.430ng/mL、L2：2.30ng/mL、L3:20.10ng/mL的检测，放置6、12、24个月后检测结果与真实值的偏差在±3.0％范围内，检测准确性远远优于对比例1和对比例2，说明实施例1-4的组分配置的清洗液在长期放置后也不会影响异鲁米诺及其衍生物的发光性能，保证发光体系的检测准确性。其中采用实施例1的清洗液进行检测，即BIT:MIT为3:1的重复性、信噪比和准确性更优，采用实施例2(BIT:MIT为2:1)的清洗液进行检测，重复性、信噪比和准确性也表现出良好的效果，优于其他实施例。
进一步通过模拟储运过程中的复杂环境以验证清洗液在含60℃高温处理情况下保存的稳定性，具体为，将实施例2和对比例2的清洗液置于烘箱中，60℃温育12小时，室温保存12小时，存储6个月。将处理后的清洗液进行PCT试剂盒检测，测定重复性、信噪比和准确度。
结果如表4和表5所示，在前述复杂环境处理下保存6个月，实施例2的清洗液相比于对比例2的清洗液具有更好的稳定性，并且仍能保证与其常规存储24个月接近的检测效果。
表4 60℃环境保存6个月检测PCT项目重复性和信噪比
表5 60℃环境保存6个月检测PCT项目准确性
| 编号 | 对比例2 | 实施例2 |
| 指标 | 偏差 | 偏差 |
| L1 | -92.31％ | -0.45％ |
| L2 | -95.23％ | -0.66％ |
| L3 | -98.79％ | -0.21％ |
以对比例2为对照，采用实施例2的清洗液放置24个月，用于乙肝病毒表面抗原(HBsAg Quant)、梅毒螺旋体抗体(Syphilis)、糖类抗原153(CA153)化学发光免疫检测过程的清洗，验证重复性和信噪比，每个样品每种试剂盒各检测10次，结果如表6所示。可以看出，采用实施例2组分配置的清洗液应用于其他试剂盒依然具有较好的重复性、信噪比和准确性。
表6 HBsAg Quant、Syphilis、CA153化学发光免疫试剂盒检测结果
实施例二
在该实施例中，比较清洗液中不同表面活性剂种类对化学发光免疫检测的影响，其中，清洗液的组成如下：
基础组分：三羟甲基氨基甲烷3.03g/L、稀盐酸5.60mL/L、氯化钠5.5g/L。
防腐剂：BIT 0.07g/L、MIT 0.07g/L。
清洗液的pH值为7.9。
固定以上组分，根据下表表面活性剂的组分分别配置清洗液。
表7清洗液组成
| 组别 | 1 | 2 | 3 | 4 |
| 表面活性剂 | T-20 | T-80 | X-100 | X-114 |
| 添加量g/L | 0.55 | 0.55 | 0.55 | 0.55 |
| 组别 | 5 | 6 | 7 | 8 |
| 表面活性剂 | NP10 | NP40 | Brij35 | AEO-9 |
| 添加量g/L | 0.55 | 0.55 | 0.55 | 0.55 |
(注：其中常温下为液态的表面活性剂通过密度ρ换算为相应体积V后进行添加)
以PCT化学发光免疫试剂盒为例，主要对比不同对比例和实施例在检验过程中的非特异性(信噪比：信号值与背景信号的比值，清洗能力越强，非特异性越低，信噪比越高)和样本的重复性(CV)，重复十次实验，结果如表7所示。
表8样本重复性和信噪比结果
除T-80外，可以很明显的看出，选用的上述表面活性剂在一定程度上可以提高试剂的信噪比并改善重复性(CV)，从中优选4、6、8进行进一步组合，具体如表8所示。
表9表面活性剂种类及添加量
仍以PCT化学发光免疫试剂盒为例，验证实施例在检验过程中的非特异性(信噪比：信号值与背景信号的比值，清洗能力越强，非特异性越低，信噪比越高)和样本的重复性(CV)，重复十次实验，结果如表10所示，将不同表面活性剂进行组合的方式，可以进一步提高检测的信噪比和重复性，降低非特异性。
表10样本重复性和信噪比结果
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (10)
1.一种用于化学发光免疫检测的清洗液，其特征在于，所述清洗液含有防腐剂，所述防腐剂选自甲基异噻唑啉酮和苯并异噻唑啉酮。
2.根据权利要求1所述的清洗液，其特征在于，所述甲基异噻唑啉酮和苯并异噻唑啉酮的质量比为1：(0.5～3)，优选1:2～1:3；
任选地，以所述清洗液的总体积计，所述防腐剂的含量为0.05～0.5g/L，优选0.1～0.3g/L。
3.根据权利要求2所述的清洗液，其特征在于，所述清洗液进一步含有非离子型表面活性剂，所述非离子型表面活性剂选自AEO-9、X-100、X-114、T-20、Brij35、NP40和NP10中的至少一种；
任选地，所述非离子型表面活性剂选自AEO-9、X-114和NP40中的至少一种；
任选地，以所述清洗液的总体积计，所述非离子型表面活性剂的含量为0.1～10g/L，优选0.1～2g/L；
任选地，任意两种所述非离子型表面活性剂的质量比为(0.5～1.5)：(0.5～1.5)，优选(0.8～1.2)：(0.8～1.2)；
任选地，所述清洗液进一步含有缓冲液和氯化钠，优选地，所述缓冲液选自三羟甲基氨基甲烷和盐酸；
任选地，以所述清洗液的总体积计，所述氯化钠的含量为1～10g/L；
任选地，所述用于化学发光免疫检测的清洗液的pH值为7.5～8.3。
4.一种用于化学发光免疫检测的系统，其特征在于，包括：权利要求1-3任一项所述用于化学发光免疫检测的清洗液以及下列至少一种：激发底物、标记有发光标记物的抗原或抗体和包被有抗原或抗体的固相载体；
任选地，所述发光标记物包括异鲁米诺衍生物；
任选地，所述异鲁米诺衍生物的基本结构为：
其中，R1选自C2H5、C3H7或C4H9，R2选自NH2-(CH2)4、NH2-(CH2)6、NH2-(CH2)8或NH2-(CH2)10；
任选地，所述异鲁米诺衍生物选自N-(4-氨丁基)-N-乙基异鲁米诺；
任选地，所述激发底物选自NaOH和H2O2。
5.权利要求1-3任一项所述用于化学发光免疫检测的清洗液或权利要求4所述用于化学发光免疫检测的系统在化学发光免疫检测中的应用。
6.一种化学发光免疫检测方法，其特征在于，包括：利用权利要求1-3任一项所述用于化学发光免疫检测的清洗液清洗固相载体-免疫复合物的过程。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，包括：
将待测样本、标记有发光标记的抗原或抗体、包被有抗原或抗体的固相载体进行混合和孵育，得到反应产物，所述反应产物中含有固相载体-免疫复合物；
分离出固相载体-免疫复合物，去除上清液，利用所述清洗液清洗所述固相载体-免疫复合物；
将清洗后的所述固相载体-免疫复合物与激发底物混合，检测发出的相对光强度；
基于所述相对光强度，对待测样本进行定量或者定性分析；
任选地，所述发光标记物包括异鲁米诺衍生物；
任选地，所述异鲁米诺衍生物选自N-(4-氨丁基)-N-乙基异鲁米诺；
任选地，所述激发底物选自NaOH和H2O2。
8.一种提高用于化学发光免疫检测的清洗液在储运过程中稳定性的方法，其特征在于，包括：使所述清洗液中含有防腐剂，所述防腐剂选自甲基异噻唑啉酮和苯并异噻唑啉酮。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述甲基异噻唑啉酮和苯并异噻唑啉酮的质量比为1：(0.5～3)，优选1:2～1:3；
任选地，以所述清洗液的总体积计，所述防腐剂的含量为0.05～0.5g/L，优选0.1～0.3g/L。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述清洗液中含有非离子型表面活性剂，所述非离子型表面活性剂包括AEO-9、X-100、X-114、NP40和NP10中的至少一种；
任选地，所述非离子型表面活性剂选自AEO-9、X-114和NP40中的至少一种；
任选地，以所述清洗液的总体积计，所述非离子型表面活性剂的含量为0.1～10g/L，优选0.1～2g/L；
任选地，任意两种所述非离子型表面活性剂的质量比为(0.5～1.5)：(0.5～1.5)，优选(0.8～1.2)：(0.8～1.2)；
任选地，所述清洗液进一步含有缓冲液和氯化钠，优选地，所述缓冲液选自三羟甲基氨基甲烷和盐酸；
任选地，以所述清洗液的总体积计，所述氯化钠的含量为1～10g/L；
任选地，所述用于化学发光免疫检测的清洗液的pH值为7.5～8.3。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311442164.5A CN117720971A (zh) | 2023-11-01 | 2023-11-01 | 用于化学发光免疫检测的清洗液和化学发光免疫检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311442164.5A CN117720971A (zh) | 2023-11-01 | 2023-11-01 | 用于化学发光免疫检测的清洗液和化学发光免疫检测方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117720971A true CN117720971A (zh) | 2024-03-19 |
Family
ID=90207638
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311442164.5A Pending CN117720971A (zh) | 2023-11-01 | 2023-11-01 | 用于化学发光免疫检测的清洗液和化学发光免疫检测方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117720971A (zh) |
-
2023
- 2023-11-01 CN CN202311442164.5A patent/CN117720971A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3784072B2 (ja) | 電気化学発光酵素イムノアッセイ | |
| CN110862881B (zh) | 一种全自动化学发光测定仪专用的清洗液或其稀释液及其制备方法 | |
| EP0774011B1 (en) | Capture assays | |
| US20070059786A1 (en) | Chemiluminescence enhancer | |
| Kricka et al. | Automated bioluminescent assays for NADH, glucose 6-phosphate, primary bile acids, and ATP | |
| CN106990100B (zh) | 一种稳定的hrp酶促化学发光底物液 | |
| CN107449771B (zh) | 酶促化学发光底物 | |
| CN112525873B (zh) | 一种用于检测微囊藻毒素-lr的荧光化学传感器及制备方法 | |
| CN105759032A (zh) | 一种针对大肠杆菌o157：h7的检测方法 | |
| CN117720971A (zh) | 用于化学发光免疫检测的清洗液和化学发光免疫检测方法 | |
| KR100449216B1 (ko) | 화학발광량조절에의한피검물질의측정방법 | |
| WO1993011259A1 (en) | Method and reagent for determination of serum iron or unsaturated iron binding capacity | |
| CN110865182A (zh) | 一种阻断剂及其在免疫检测中的应用 | |
| Yu et al. | Employment of bromophenol red and bovine serum albumin as luminol signal co-enhancer in chemiluminescent detection of sequence-specific DNA | |
| CN114152740A (zh) | 一种酶促化学发光试剂盒、制备方法及检测方法 | |
| JP3228791B2 (ja) | 検体中の抗原又は抗体の測定法 | |
| Taniai et al. | Fluorometric determination of glucose by flow injection analysis using immobilized enzyme-reactor columns prepared by coupling glucose oxidase and peroxidase onto chitosan beads | |
| CN113484306B (zh) | 一种磁微粒化学发光清洗液及其制备方法和应用 | |
| CN113533735A (zh) | 吖啶酯类似物在制备吖啶酯类似物标记抗体中的应用 | |
| CN116103095A (zh) | 一种磁微粒化学发光清洗液及其制备方法 | |
| CN114755217A (zh) | 一种磁珠稀释液及其制备方法 | |
| Ivanov et al. | The use of auramine 0 to study ligand binding and subunit cooperativity of lactate dehydrogenase | |
| CN114324850A (zh) | 一种化学发光工作试剂保存液及其制备方法 | |
| CN116465876A (zh) | 一种大田软海绵酸的快速检测方法及其试剂盒 | |
| JP3113025B2 (ja) | 鉄の定量方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |