CN117701708A - 一种用于辅助判断前列腺癌恶性程度的检测方法及试剂 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于辅助判断前列腺癌恶性程度的血清外泌体核酸标志物的检测方法及试剂，所述检测方法包括如下步骤：采用商用试剂盒提取血清外泌体的核酸并合成cDNA；对每个样本检测使用2个反应孔（A、B），构建不同的反应体系；设置荧光PCR程序检测linc02203的表达量（CT值）。本发明的有益效果是：通过将血清外泌体linc02203的拷贝数作为预测前列腺癌危险度的标志物，并以其作为前列腺癌恶性程度诊断的依据，具有稳定、无创、实时、可重复的特点，避免了前列腺炎、前列腺增生和低危程度前列腺癌患者的穿刺活检，解决现有技术对前列腺癌的检测手段较为复杂与繁琐的问题。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于辅助判断前列腺癌恶性程度的检测方法及试剂。
背景技术
前列腺癌是男性最常见的恶性肿瘤之一，在全球男性肿瘤发病率排在第三位，在全球所有肿瘤发病率排在第七位，约10%的男性肿瘤患者是前列腺癌。一个患者的前列腺内可能包含多种不同恶性程度的癌灶，判断一个患者前列腺癌整体的恶性程度，临床上最常用的是格里森评分(Gleason评分：1分至10分的评分体系)，如果评分大于7分，患者即可被认定为高危前列腺癌，如果评分为6甚至更低，患者不需要进一步进行医疗干预。越来越多的证据表明，前列腺癌是一种致病因素复杂的肿瘤，大多数患者的前列腺癌都属于低危且非致命性，临床上定义为惰性。如何有效地鉴别前列腺癌高危患者，同时避免前列腺炎、前列腺增生和低危程度前列腺癌患者的穿刺活检日渐成为前列腺癌早期鉴别诊断的重要研究方向。
由于前列腺癌本身的特性，Gleason评分依赖于前列腺穿刺病理，在前列腺癌诊疗过程中，该方法有相当的局限性。由于前列腺癌的异质性以及前列腺穿刺位置的不同，导致Gleason评分不能完全反映患者前列腺癌恶性程度，临床上寄希望于更多的液体活检方法来辅助Gleason评分。外泌体RNA检测为前列腺癌风险评估提供了一种新的可能。外泌体是直径在40-150nm的囊泡，由细胞内形成并释放到细胞外环境，在人体内的循环系统中存在大量的外泌体。越来越多的研究表明，外泌体可以选择性富集RNA，美国的ExosomeDx公司开发了检测尿液外泌体核酸检测的试剂盒，通过检测尿液外泌体中PCA3和ERG基因的表达量，可以预测Gleason评分。通过收集PSA在2-10ng/μL患者直肠指检后的尿液并对其中的外泌体核酸进行检测，从而预测检验样本是否为高危前列腺癌。但是该试剂盒的使用过程中，需要医生对患者预先进行直肠指检，指检的效果依赖于医生的经验，同时检测的样本必须是指检后的晨尿，而尿液分为头段、中段和尾端，从而造成尿液的外泌体来源不够稳定，并且该方法的AUC仅为0.71，尚未达到0.8以上。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种用于辅助判断前列腺癌恶性程度的血清外泌体核酸标志物的检测方法，以解决上述背景技术对前列腺癌的检测手段较为复杂与繁琐的问题。
本发明的第二个目的在于提供一种用于辅助判断前列腺癌恶性程度的试剂。
为实现上述目的，本发明第一方面提供一种用于辅助判断前列腺癌恶性程度的血清外泌体核酸标志物的检测方法，包括如下步骤：
采用商用试剂盒提取血清外泌体的核酸并合成cDNA；
对每个样本检测使用2个反应孔（A、B），构建不同的反应体系；
设置荧光PCR程序检测linc02203的表达量（CT值）。
优选的，所述设置荧光PCR程序检测lnc02203的表达量（CT值），包括：
将血清外泌体linc02203的拷贝数作为预测前列腺癌危险度的标志物。
其中，所述血清外泌体中linc02203表达量在高危前列腺癌中随着Gleason评分增加而升高，并且在高Gleason评分（≥7）患者中的表达量显著高于Gleason评分为6的患者。
优选的，所述的Linc02203其标准品序列为：GGCCTATCATCTTCTTGGGAGCTGCAGCTATTTCTCTTATTACTATTTTTGTTTTTTTACATTGCTATTGTCCTGGGAAACCTCTTGATAGTGGTAACAGTGCAAGCCCATGCTCATCTGCTCCAATCTCCTATGTATTATTTTTTAGGTCATCTCTCTTTCATTGACCTATGCCTAAGCTGTGTTACTCTGCCAAAGAT。
优选的，所有序列均是从5’端到3’端的顺序。
优选的，上述的检测方法用于诊断受试者前列腺癌的早期筛查以及受试者前列腺癌的恶性程度评估。
本发明第二方面提供了一种用于辅助判断前列腺癌恶性程度的试剂，所述试剂包括检测如上述的血清外泌体核酸标志物的检测试剂；
所述检测试剂包括外泌体提取试剂、cDNA合成试剂、上下游引物、探针、以及荧光PCR反应液。
优选的，所述上下游引物、探针的序列为：
上游引物linc02203-F：CTATTGTCCTGGGAAACCTCTTGA
下游引物linc02203-R：CCCCTAACATCTTTGGCAGAGTAA
探针linc02203-P：CAGTGCAAGCCCATGCTCATCT
与现有技术相比，本发明的有益效果是：通过将血清外泌体linc02203的拷贝数作为预测前列腺癌危险度的标志物，并以其作为前列腺癌恶性程度诊断的依据，具有稳定、无创、实时、可重复的特点，避免了前列腺炎、前列腺增生和低危程度前列腺癌患者的穿刺活检，解决现有技术对前列腺癌的检测手段较为复杂与繁琐的问题。
附图说明
图1为本发明实施例中得到的前列腺癌患者血清外泌体中长片段非编码RNA(lncRNA)表达谱；
图2为本发明实施例中得到的外泌体表达稳定性示意图；
图3为本发明实施例中得到的血清外泌体linc02203在不同Gleason评分中的表达量柱状图；
图4为本发明实施例中中得到的血清外泌体lnc02203作为判断高低危前列腺癌标志物的价值曲线图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例提供一种用于辅助判断前列腺癌恶性程度的血清外泌体核酸标志物的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
采用商用试剂盒提取血清外泌体的核酸并合成cDNA；
对每个样本检测使用2个反应孔（A、B），构建不同的反应体系；
设置荧光PCR程序检测linc02203的表达量（CT值）。
优选的，所述设置荧光PCR程序检测linc02203的表达量（CT值），包括：
将血清外泌体linc02203的拷贝数作为预测前列腺癌危险度的标志物。
其中，所述血清外泌体中linc02203表达量在高危前列腺癌中随着Gleason评分增加而升高，并且在高Gleason评分（≥7）患者中的表达量显著高于Gleason评分为6的患者。
优选的，所述的Linc02203其标准品序列为：GGCCTATCATCTTCTTGGGAGCTGCAGCTATTTCTCTTATTACTATTTTTGTTTTTTTACATTGCTATTGTCCTGGGAAACCTCTTGATAGTGGTAACAGTGCAAGCCCATGCTCATCTGCTCCAATCTCCTATGTATTATTTTTTAGGTCATCTCTCTTTCATTGACCTATGCCTAAGCTGTGTTACTCTGCCAAAGAT。
优选的，所有序列均是从5’端到3’端的顺序。
优选的，上述的检测方法用于诊断受试者前列腺癌的早期筛查以及受试者前列腺癌的恶性程度评估。
本实施例还提供了一种用于辅助判断前列腺癌恶性程度的试剂，所述试剂包括检测如上述的血清外泌体核酸标志物的检测试剂；
所述检测试剂包括外泌体提取试剂、cDNA合成试剂、上下游引物、探针、以及荧光PCR反应液。
优选的，所述上下游引物、探针的序列为：
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实施例2
本实施例的主要目的在于建立一种用于判断前列腺癌恶性程度的血清外泌体linc02203的检测实验方法，所述检测实验方法至少包括：
1.准备空腹全血1毫升(促凝管收集)；
2.在4°C条件下，离心力3000g，10分钟吸取上层血清；
3.将500微升血清在4°C条件下，离心力10000g，10分钟去除血清中杂质；
4.用QIAGEN公司的exoRNeasy Serum Plasma Kits提取血清外泌体的核酸；
5.用TAKARA公司的PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit合成cDNA；
6.每个样本检测使用两个反应孔，反应孔A：20微升体系中加入10微升荧光PCRMix，4微升cDNA，1微升5微摩尔浓度的上游引物，1微升5微摩尔浓度的下游引物，1微升10微摩尔浓度的linc02203探针以及3微升RNase-free水；反应孔B：20微升体系中加入10微升荧光PCR Mix，1微升linc02203标准品(1μM)，1微升5微摩尔浓度的上游引物，1微升5微摩尔浓度的下游引物，1微升10微摩尔浓度的linc02203探针以及6微升RNase-free水；
7.设置荧光PCR程序37°C 5分钟，95°C 10分钟，95°C 15秒，60°C 45秒，其中最后两步循环数为40；
8.根据荧光PCR仪器的运行结果统计反应孔A和B的CT值以及反应孔A样本的拷贝数(阈值设置为自动)。
实验结果包括：
请参考图1，图1提供了前列腺癌患者血清外泌体中长片段非编码RNA(lncRNA)表达谱，通过收集术前前列腺癌患者血清，比较了25例Gleason评分为6与40例Gleason评分大于7外泌体中长片段非编码RNA(lncRNA)表达谱，发现非编码RNA名称为linc02203(转录本ENST00000625989.2)在Gleason评分大于7的前列腺癌患者中具有高表达，且Gleason评分越高，该非编码RNA的表达量越高，呈现正相关性，而Gleason评分为6的前列腺癌患者血清外泌体中linc02203的表达量很低。
请参考图2，图2提供了外泌体表达稳定性示意图，通过进一步比较外泌体中PCA3、ERG和LINC02203在10例高危前列腺癌患者直肠指检后尿液和血清中的稳定性；检测样品放置0小时、4小时和8小时三个不同时间点后外泌体中PCA3、ERG和LINC02203的表达量，发现尿液外泌体中这三个基因的表达量并不稳定，随时间变化而波动；ERG在血清中的稳定程度高于尿液，血清外泌体中PCA3和ERG的表达量显著低于LINC02203，且LINC02203在血清外泌体中的表达相当稳定，几乎不随放置时间而显著变化。
请参考图3，图3提供了血清外泌体linc02203在不同Gleason评分中的表达量柱状图，进一步，通过Gleason评分将前列腺癌患者分为惰性低危(Gleason评分为6)，Gleason评分为7，Gleason评分为8，Gleason评分为9，Gleason评分为10五组，其中Gleason评分大于等于7均为高危前列腺癌。血清外泌体中linc02203表达量在高危前列腺癌中随着Gleason评分增加而升高，并且在与Gleason评分为6的比较中具有显著统计学差异(GS，GleasonScore；GS6 vs GS7，p＜0.05；GS6 vs GS8，p＜0.001；GS6 vs GS9或GS10，p＜0.0001)。
请参考图4，图4提供了血清外泌体linc02203作为判断高低危前列腺癌标志物的价值曲线图，通过用50例患者(患者前列腺癌血清标志物PSA浓度均在4-10ng/mL范围)的空腹血清样本检测linc02203的拷贝数用于预测前列腺癌低危与高危而得出，其ROC曲线的AUC为0.893，特异性为0.875，灵敏性为0.794，cutoff值为1.95×108/毫升血清，其AUC高于尿液外泌体PCA3和ERG的AUC值0.71。
本发明实施例通过定量地检测血清外泌体linc02203，将血清外泌体linc02203的拷贝数作为预测前列腺癌危险度的标志物，并以其作为前列腺癌恶性程度诊断的依据，具有稳定、无创、实时、可重复的特点，避免了前列腺炎、前列腺增生和低危程度前列腺癌患者的穿刺活检，解决现有技术对前列腺癌的检测手段较为复杂与繁琐的问题。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (7)
1.一种用于辅助判断前列腺癌恶性程度的血清外泌体核酸标志物的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
采用商用试剂盒提取血清外泌体的核酸并合成cDNA；
对每个样本检测使用2个反应孔（A、B），构建不同的反应体系；
设置荧光PCR程序检测linc02203的表达量（CT值）。
2.根据权利要求1所述的用于辅助判断前列腺癌恶性程度的血清外泌体核酸标志物的检测方法，其特征在于，所述设置荧光PCR程序检测linc02203的表达量（CT值），包括：
将血清外泌体linc02203的拷贝数作为预测前列腺癌危险度的标志物。
3.根据权利要求1所述的用于辅助判断前列腺癌恶性程度的血清外泌体核酸标志物的检测方法，其特征在于，所述的Linc02203其标准品序列为：GGCCTATCATCTTCTTGGGAGCTGCAGCTATTTCTCTTATTACTATTTTTGTTTTTTTACATTGCTATTGTCCTGGGAAACCTCTTGATAGTGGTAACAGTGCAAGCCCATGCTCATCTGCTCCAATCTCCTATGTATTATTTTTTAGGTCATCTCTCTTTCATTGACCTATGCCTAAGCTGTGTTACTCTGCCAAAGAT。
4.根据权利要求3 所述的用于辅助判断前列腺癌恶性程度的血清外泌体核酸标志物的检测方法，其特征在于，所有序列均是从5’端到3’端的顺序。
5.根据权利要求1-4任一所述的用于辅助判断前列腺癌恶性程度的血清外泌体核酸标志物的检测方法，其特征在于，所述检测方法用于诊断受试者前列腺癌的早期筛查以及受试者前列腺癌的恶性程度评估。
6.一种用于辅助判断前列腺癌恶性程度的试剂，其特征在于，所述试剂包括检测如权利要求1-4任一所述的血清外泌体核酸标志物的检测试剂；
所述检测试剂包括外泌体提取试剂、cDNA合成试剂、上下游引物、探针、以及荧光PCR反应液。
7.根据权利要求6所述的用于辅助判断前列腺癌恶性程度的试剂，其特征在于，所述上下游引物、探针的序列为：
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