CN117701579A - 水稻氮高效优异等位基因nt1及其育种应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开水稻氮高效优异等位基因NT1及其育种应用。通过基因编辑技术，获得了NT1基因的敲除和过表达材料。敲除NT1提高了水稻的绿色氮高效特性；过表达NT1增加了水稻的无效分蘖并降低了产量；NT1优势单倍型启动子245bp的缺失降低了NT1表达水平。开发了NT1分子标记并应用于水稻氮高效品种的分子育种。NT1优异单倍型的NIL家系促进水稻有效分蘖的生长、提高氮利用效率和产量。NT1基因及其优异单倍型遗传材料为培育绿色氮高效水稻品种提供了基因资源、材料和技术支撑。

Description

水稻氮高效优异等位基因NT1及其育种应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及水稻氮高效优异等位基因NT1及其育种应用。

背景技术

水稻是世界主要粮食作物之一，全世界一半以上人口食用大米。然而随着人口的不断增加，可利用更低的减少以及环境污染的加剧，粮食安全受到了严重挑战。因此，提高水稻产量、保证粮食生产安全是最基本的任务。

氮素作为植物主要且需求量最大的营养元素，为粮食安全提供了重要保障。20世纪70年代以来，我国粮食产量的不断提高主要得益于氮肥的大量投入。然而，过量的氮肥投入不仅导致农业生产成本的提高，而且过量施用导致大量未被植物吸收的氮肥流入空气、土壤和水体中，导致空气污染、突然酸化和水体富营养化等一系列环境问题。因此，在不降低水稻产量的条件下，如何减少氮肥施用的同时提高水稻NUE(nitrogen use efficiency)是迫切需要解决的问题。

保证水稻不减产的同时减少氮肥的投入，需要提高水稻的氮高效特性，使水稻在低氮肥投入环境下也能保持高产。氮高效基因增加无效分蘖，发掘提高氮高效和控制无效分蘖的新基因并应用于分子育种，加速水稻氮高效品种的培育。

发明内容

本发明涉及一个控制水稻氮素吸收、产量和氮高效特性的基因及其利用。本发明还涉及该基因启动子序列和基因编码的多肽序列，以及通过基因编辑获得氮高效、高产水稻品种的方法。

本发明通过观察氮高效水平(即LN下水稻性状观测值/HN下水稻性状观测值)，鉴定一批极端氮高效品种资源。

具体操作步骤如下：测量来自不同地区的水稻品种的PHR(低氮田株高/高氮田株高)、EPNR(低氮田有效穗数/高氮田有效穗数)和YPPR(低氮田单株产/高氮田单株产)，筛选出具有高PHR和/或高EPNR和/或高YPPR的品种，作为极端氮高效品种。在此基础上，利用PHR、EPNR和YPPR数据，结合各品种SNP数据，利用全基因组关联分析(GWAS)的方法，分离和克隆了提高水稻氮高效能力和产量的基因NT1及其优异等位变异NT1-T和劣势等位变异NT1-S。鉴定了一批包含NT1-T的极端氮高效品种和CSSLs家系。

本发明目的提供一种基因NT1，核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，或者与SEQ IDNO:4限定的核苷酸序列具有90％以上同源性的DNA分子。

本发明所述的基因NT1，cDNA分子序列如SEQ ID NO:3所示，或者与SEQ ID NO:3限定的核苷酸序列具有90％以上同源性的DNA分子。

本发明还提供所述的基因NT1的启动子，在一些实施例中，所述基因的启动子序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示。本发明SEQ ID NO:2所示的启动子可以降低基因NT1的表达，从而获得极端氮高效能基因。

本发明还提供本发明所述基因NT1编码的蛋白质。在一些实施例中，所述的蛋白质，其氨基酸序列如下B1)和/或B2)所示：

B1)由SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

B2)在SEQ ID NO:5所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；

B3)与SEQ ID NO:5限定的核苷酸序列具80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质。

本发明还提供扩增本发明所述基因NT1的引物，所述引物如下：

NT1-CDS-F：cggagctagctctagaATGGGCTCCACCGATCGGAA

NT1-CDS-R：tgctcaccatggatccGCCATGTAGCAATGTGGATG。

本发明还提供本发明所述基因NT1的sgRNA，所述sgRNA如下：

NT1-sgRNA-F:ggcAGCACGCACGCACCTTCCGAT

NT1-sgRNA-R:aaacATCGGAAGGTGCGTGCGTGC。

本发明所述基因NT1、所述的启动子、所述的蛋白质、所述的引物或所述的sgRNA在如下C1)-C3)任一种中的应用：

C1)培育增加分蘖数和/或增加产量和/或提高氮素利用率的转基因植物；

C2)培育减少分蘖数和/或减少产量和/或降低氮素利用率的转基因植物；

C3)植物分子育种。

本发明所述的应用中，培育增加分蘖数和/或增加产量和/或提高氮素利用率的转基因植物具体为干扰、敲除、沉默或抑制本发明所述基因NT1的表达。

本发明所述的干扰、敲除、沉默或抑制本发明所述基因NT1的表达可以为本领域的常规方法，例如通过降低NT1蛋白表达和/或利用NT1优异单倍型基因分子育种和/或利用基因编辑技术，敲除245bp核苷酸序列，获得转基因或分子育种材料，在一些实施例中，通过构建干扰NT1蛋白质编码基因表达的载体或敲除NT1蛋白质编码基因的载体，在一些实施例中，所述载体为CRISPR-Cas9载体，所述CRISPR-Cas9载体包括Cas9蛋白质和sgRNA，所述sgRNA的靶序列可以为SEQ ID NO:1～4任一所示的DNA分子。

本发明还提供一种具体的构建水稻启动子大片段敲除的方法和生物材料，包括如下步骤：向受体水稻导入包含sgRNAs的基因编辑载体，sgRNAs的靶序列为SEQ ID NO:1所示的DNA分子，使得NT1启动子序列受到编辑，敲除受体水稻中NT1启动子245bp核苷酸序列，得到转基因水稻。

本发明所述的应用中，培育减少分蘖数和/或减少产量和/或降低氮素利用率的转基因植物为提高或促进本发明所述基因NT1的表达。

本发明所述的提高或促进本发明所述基因NT1的表达可以为本领域的常规方法，利用通过常规方法进行转基因过表达。

本发明还可以开发辅助分子标记，在两种单倍型启动序列上设计indel引物，用于种质资源筛选和分子育种。引物序列为两种单倍型启动子共同序列，两种单倍型扩增片段存在大小差异，引物类型为indel引物，所述引物序列靶序列和启动子序列为SEQ ID NO:1-2所示。

本发明在植物分子育种中的应用，可以通过培育包含NT1两种单倍型启动子的转基因植株，比较两种单倍型功能差异。具体操作步骤如下：分别使用SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2中启动子序列连接标签载体和SEQ ID NO:3中序列，获得融合载体，通过农杆菌侵染获得转基因阳性植株。

本发明相对于现有技术的优势：

本发明提供了一种与水稻产量和氮高效性状高度相关的基因NT1，并通过转基因技术和分子育种技术获得了转基因水稻和近等基因系材料，证明了NT1负调水稻产量和氮高效性状。与野生型相比包含NT1优异单倍型的近等基因系在低氮条件下具有更高的产量和分蘖，表现出明显的氮高效表型。为培育绿色高产水稻奠定了基础。

附图说明

图1氮高效极端群体表型鉴定。a为氮高效品种的表型。b为低氮敏感品种的表型；

图2 NT1敲除和过表达转基因家系氮高效水平。a为高低氮下野生型表型。b为高低氮下敲除家系表型表型。c为高低氮下过表达家系表型。HN为高氮，LN为低氮。d为过表达家系中NT1表达水平检测。e为野生型、NT1敲除家系和NT1过表达家系有效穗数比统计(低氮下有效穗数/高氮下有效穗数)。f为野生型、NT1敲除家系和NT1过表达家系株高比统计(低氮下株高/高氮下株高)；

图3 NT1两种单倍型启动子驱动的转基因植株在高低氮下的表型比较。a为野生型高低氮下表型。b为NT1劣势单倍型NT1-S的转基因表型。c为NT1优异单倍型NT1-T的转基因表型。d为NT1两种单倍型转基因植株中NT1的表达水平检测；

图4两种NT1两种单倍型转基因植株氮高效性状调查。a为NT1两种单倍型转基因植株的无效分蘖数统计。b为NT1两种单倍型转基因植株单株产统计。c为NT1两种单倍型转基因植株有效穗数比统计(低氮下有效穗数/高氮下有效穗数)。d为NT1两种单倍型转基因植株株高比统计(低氮下株高/高氮下株高)；

图5 NT1优异单倍型促进分蘖和产量的表型。a为高氮下近等基因系表型。b为低氮下近等基因系表型；

图6 NT1优异单倍型近等基因系促进分蘖、产量和氮高效特性的统计。a为高低氮条件下近等基因系的有效分蘖数统计。b为高低氮条件下近等基因系的单株产统计。c为近等基因系的有效穗数比统计。d为近等基因系的株高比统计。

具体实施方法

结合实例详细说明本发明的实施方式(不限于此)。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1、氮高效极端材料的鉴定和氮高效基因NT1的挖掘。

一、氮高效极端材料的筛选

1、核心种质资源的种植

挑选分布于世界各地区的水稻种质资源，包括农家种和育成品种，并分别种植于高氮田(施肥量300kg/h)和低氮田(施肥量0kg/h)中，每个品种分单株种植4×10小区，每个品种三个重复，分布于田块不同区域。连续种植三年，测量数据

2、核心种质资源氮高效数据的收集

待植株灌浆成熟，测量高低氮田中每个品种单株的株高、有效穗数(有效分蘖数)以及单株产，每个品种每个重复各测量10个单株，并记录数据用于下一步处理。连续测量三年。

3、氮高效指标的计算和极端材料的筛选

将高低氮田每个品种不同重复数据去除极端值后计算平均值，用低氮下数据除以高氮下数据得到每个品种的株高比(PHR)、有效穗数比(EPNR)和单株产比(YPPR)。对三组数据进行正太分布分析，连续三年，三组数据中至少有两组数据位于各数据前30％的品种为氮高效品种，位于后30％的品种为低氮敏感品种。代表性品种如附图1所示。

二、氮高效基因NT1的挖掘

1、核心种质资源分子数据的收集

通过简化基因组测序(GBS)的方法获得各品种SNP数据，流程如下：

(1)将不同样本和含不同barcode接头成对放在平板里；

(2)使用ApeKI限制酶进行酶解；

(3)使用T4连接酶，将接头连接到片段两端因酶切产生的粘末端(stcky end)；

(4)将含不同barcode的样本混池，随后过片段长度筛选柱，过滤尚未反应的接头；

(5)加入PCR引物，进行PCR扩增；

(6)通过二代测序获得分子数据。

2、NT1基因的发掘

1)采用全基因组关联分析(GWAS)的方法，使用Tassels 5软件，采用MLM模型，定位氮高效区间。选取至少两种性状同时关联到的区间，定为氮高效候选区间。我们通过2016年PHR和2014年EPNR同时定位到Chr1 13.54-13.57M附近24K的连锁区间，将其定为氮高效位点。

2)该区间内共有三个候选基因，对这些候选基因进行氮素诱导实验，检测这三个基因的表达是否受氮素诱导，发现只有一个基因受氮素诱导，将其命名为NT1(Nitrogen-modulated effective tiller1)并将其定位氮高效基因。其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，cDNA分子序列如SEQ ID NO.3所示，编码的蛋白质氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

实施例2、NT1敲除家系的获得和表型调查

一、NT1敲除家系的获得

1、sgRNA的设计

以SEQ ID NO:4作为参考序列，在NT1编码区设计一对sgRNA引物，引物序列如下：

NT1-sgRNA-F:ggcAGCACGCACGCACCTTCCGAT

NT1-sgRNA-R:aaacATCGGAAGGTGCGTGCGTGC

为便于后续连接，前引物NT1-sgRNA-F的5’端加上ggc接头，后引物NT1-sgRNA-R的5’端加上aaac接头。

2、敲除载体的构建

1)将合成的引物NT1-sgRNA-F和NT1-sgRNA-R变性、退火得到引物二聚体产物。

2)使用T4连接酶将获得的引物二聚体产物连入载体pCAMBIA1305，获得构建完成的中间载体pCAMBIA-NT1。

3、转基因植株的获得

将步骤2中的中间载体，通过热激法转入农杆菌感受态EHA105中，通过菌落PCR获得含有pCAMBIA-NT1载体的阳性单克隆菌株。用含有pCAMBIA-NT1的农杆菌单克隆菌株侵染日本晴(Nip)愈伤。获得阳性T0代植株，通过单株提DNA，使用检测引物扩增PCR，扩增片段送公司二代测序，与日本晴参考序列比对，获得阳性单株(包括纯合与杂合植株)，单株收种，继续繁种，调查表型。

以SEQ ID NO:4作为参考序列，PCR鉴定引物如下：

NT1-detect-F:TCCTCCACAACTACTCTCTC

NT1-detect-R:ACGATGATGAACACAGTAAC

二、敲除家系氮高效表型鉴定

将获得的转基因纯合植株，按照实施例1中“氮高效极端材料的筛选”的方法种植并收集表型数据。结果如附图2所示，与野生型表型数据相比，发现NT1敲除家系提高了PHR和EPNR，说明NT1敲除家系耐低氮能力得到提高。

实施例3、NT1过表达家系与不同单倍型转基因材料获得与氮高效表型鉴定

一、NT1过表达转基因植株的获得

1、过表达载体构建

(1)NT1基因克隆

以日本晴(Nip)基因组为模板，提取RNA，通过反转录获得cDNA，以SEQ ID NO:3作为参考序列，设计NT1-CDS-F/R引物，通过PCR扩增获得NT1的编码区核苷酸序列，为方便下一步重组，在NT1-CDS-F的5’端加上cggagctagctctaga接头序列，NT1-CDS-F的5端加上tgctcaccatggatcc接头序列。

引物序列如下：

NT1-CDS-F：cggagctagctctagaATGGGCTCCACCGATCGGAA

NT1-CDS-R：tgctcaccatggatccGCCATGTAGCAATGTGGATG

(2)构建表达载体

将步骤(1)扩增所得的CDS片段连入载体pCAMBIA1305，获得重组表达载体pCAMBIA1305-NT1。

1、NT1过表达家系的获得

将步骤1所得的pCAMBIA1305-NT1表达载体，通过热激法转入农杆菌感受态EHA105中，通过菌落PCR获得含有pCAMBIA1305-NT1载体的阳性单克隆菌株。用含有pCAMBIA1305-NT1的农杆菌单克隆菌株侵染日本晴(Nip)愈伤。获得阳性T0代植株NT1-OE，通过单株提DNA，使用检测引物扩增PCR，通过琼脂糖凝胶电泳法鉴定阳性单株。获得阳性单株(包括纯合与杂合植株)，单株收种，继续繁种，直至纯合。PCR鉴定引物如下：

NT1-CDS-F：cggagctagctctagaATGGGCTCCACCGATCGGAA

NT1-CDS-R：tgctcaccatggatccGCCATGTAGCAATGTGGATG

二、NT1两种单倍型转基因植株的获得

1、NT1两种单倍型片段克隆

NT1的遗传变异只存在于启动子区域，因此使用引物NT1-S-F/R和NT1-T-F/R扩增两种单倍型启动子，获得重组片段NT1-S和NT1-T，NT1-S和NT1-T分别为NT1在不同水稻品种中的两种启动子单倍型。其中NT1-S，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；NT1-T，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。为方便重组，在NT1-S/T-F的5’端加上接头序列ttacgaattcgagctc，在NT1-S/T-R的5’端加上接头序列cggacttaagactagt；具体引物序列如下：

NT1-S-F：ttacgaattcgagctc TTCAAGGGCTTCAACGCAA

NT1-S-R：cggacttaagactagtCCGGATTAACACAGCGTTGG

NT1-T-F：ttacgaattcgagctcTTTCAAGGGCTTCAACGCAA

NT1-T-R：cggacttaagactagt CCGGATTAACACGGGCGTTG

2、构建表达载体

使用限制性内切酶SacI和XbaI酶切步骤一中获得的pCAMBIA1305-NT1质粒，获得去除了35s启动子的线性载体pCAMBIA-NT1，将步骤1获得的NT1-S和NT1-T片段通过同源重组方法连入载体pCAMBIA-NT1。获得最终包含NT1两种单倍型启动子的融合载体pCAMBIA-S-NT1和pCAMBIA-T-NT1(基因NT1缺失245bp)。

3、包含NT1两种单倍型转基因植株的获得

将步骤2所得的pCAMBIA-S-NT1和pCAMBIA-T-NT1表达载体，通过热激法转入农杆菌感受态EHA105中，通过菌落PCR获得含有pCAMBIA-S-NT1和pCAMBIA-T-NT1载体的阳性单克隆菌株。用含有pCAMBIA-S-NT1和pCAMBIA-T-NT1的农杆菌单克隆菌株侵染日本晴(Nip)愈伤。获得阳性T0代植株pHapS::NT1和pHapT::NT1。通过单株提DNA，使用检测引物扩增PCR，通过琼脂糖凝胶电泳法鉴定阳性单株。获得阳性单株(包括纯合与杂合植株)，单株收种，继续繁种，直至纯合。以SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:1作为参考序列，PCR鉴定引物如下：

NT1-S-F：ttacgaattcgagctc TTTCAAGGGCTTCAACGCAA

NT1-CDS-R：tgctcaccatggatccGCCATGTAGCAATGTGGATG

三、NT1过表达家系与不同单倍型转基因材料氮高效表型鉴定

将获得的转基因纯合植株，按照实施例1中“氮高效极端材料的筛选”的方法种植并收集表型数据。结果如附图2-4所示，与野生型表型数据相比，发现NT1过表达家系降低了PHR和EPNR，说明NT1过表达家系耐低氮能力降低；包含NT1劣势单倍型启动子转基因植株pHapS：：NT1同样降低了植株的耐低氮能力和单株产，说明NT1负调控水稻产量和氮利用效率。

实施例4、NT1近等基因系的获得和表型数据的调查

一、近等基因系(NIL)的构建

以包含NT1劣势单倍型的粳稻Aso为受体，包含NT1优异单倍型的籼稻IR24为供体，首先通过杂交，获得了染色体片段置换系(CSSL)，通过标记筛选获得包含NT1优异单倍型的CSSL，通过与Aso的回交，最终获得包含NT1单一置换片段的NIL家系。

回交总代数为5。筛选标记为：

NIL-F:CTCTGATTCTCTGCTTATGT

NIL-R:TCGTGTGGATGCTCAAATGG。

二、近等基因系(NIL)表型调查

将获得的NIL家系，按照实施例1中“氮高效极端材料的筛选”的方法种植并收集表型数据。结果如附图5-6所示，与受体亲本相比，包含NT1优异单倍型的NIL家系，表现出更高的PHR和EPNR，表明NT1优异单倍型有助于提高水稻氮高效性，同时NIL家系拥有更高的单株产与有效分蘖，说明NT1优异单倍型在改良水稻农艺性状提高水稻耐低性中发挥重要作用。

三、开发分子标记选育NIL家系和培育耐低氮品种

利用优异单倍型启动子245bp缺失片段的两侧序列，设计indel引物作为分子标记，筛选含有245bp缺失的种质资源和NIL家系。

引物如下：

NT1-indel-F：TTTCGGTGGTTGCTTATGTG

NT1-indel-R：AGAAGGAAGCGTAATAGGGC。

以上所述的是本发明的实例，方案中公知的具体技术方案和/或特性等在此未作过多描述。对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术方案的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。

Claims (10)

1.基因NT1，核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，或者与SEQ ID NO:4限定的核苷酸序列具有90％以上同源性的DNA分子。

2.基因NT1，cDNA分子序列如SEQ ID NO:3所示，或者与SEQ ID NO:3限定的核苷酸序列具有90％以上同源性的DNA分子。

3.权利要求1或2所述基因NT1的启动子，序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示。

4.权利要求1或2所述基因NT1编码的蛋白质；优选的，所述的蛋白质，其氨基酸序列如下B1)和/或B2)所示：

B1)由SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

B2)在SEQ ID NO:5所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；

B3)与SEQ ID NO:5限定的核苷酸序列具80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质。

5.扩增权利要求1或2所述基因NT1的引物，优选的，所述引物如下：

NT1-CDS-F：cggagctagctctagaATGGGCTCCACCGATCGGAA

NT1-CDS-R：tgctcaccatggatccGCCATGTAGCAATGTGGATG。

6.权利要求1或2所述基因NT1的sgRNA，优选的，所述sgRNA如下

NT1-sgRNA-F:ggcAGCACGCACGCACCTTCCGAT

NT1-sgRNA-R:aaacATCGGAAGGTGCGTGCGTGC。

7.权利要求1或2所述基因NT1、权利要求3所述的启动子、权利要求4所述的蛋白质、权利要求5所述引物或权利要求6所述sgRNA在如下C1)-C3)任一种中的应用：

C1)培育增加分蘖数和/或增加产量和/或提高氮素利用率的转基因植物；

C2)培育减少分蘖数和/或减少产量和/或降低氮素利用率的转基因植物；

C3)植物分子育种。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，培育增加分蘖数和/或增加产量和/或提高氮素利用率的转基因植物具体为干扰、敲除、沉默或抑制权利要求1或2所述基因NT1的表达。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，培育减少分蘖数和/或减少产量和/或降低氮素利用率的转基因植物为提高或促进权利要求1或2所述基因NT1的表达。

10.耐低氮水稻品种的分子标记引物，其特征在于，引物如下：

NT1-indel-F：TTTCGGTGGTTGCTTATGTG

NT1-indel-R：AGAAGGAAGCGTAATAGGGC。