CN117701550A - 一种固定化转氨酶的制备方法及其应用 - Google Patents
一种固定化转氨酶的制备方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种固定化转氨酶的制备方法及其应用，涉及固定化酶领域。本发明以氨基修饰的多壁碳纳米管为载体，以戊二醛为交联剂活化氨基化多壁碳纳米管，将ω‑转氨酶固定在氨基化多壁碳纳米管上得到固定化转氨酶。在最佳固定条件下，酶活性回收率为78.7％。为了简化产物的分离和提取，以体积浓度为10％的甲醇作为助溶剂，构建了固定化转氨酶催化反应的非水相体系。固定化转氨酶用于催化1‑乙酰基萘反应生成(R)‑NEA，连续反应15个批次后，(R)‑NEA总产量为1.86g，e.e.p值(产物对映体过量)为99.5％，在非水体系中实现了(R)‑NEA的克级规模化生产。
Description
技术领域
本发明涉及固定化酶领域，具体涉及一种固定化转氨酶的制备方法及其应用。
背景技术
手性胺是各种药物的关键中间体，大约40％的手性药物含有手性胺官能团。(R)-(+)-1-(1-萘基)乙胺((R)-NEA)是用于合成治疗继发性甲状腺功能亢进和高钙血症药物—盐酸西那卡塞的重要手性胺成分。转氨酶合成(R)-NEA因其反应条件温和、原子经济性高、具有优异的化学选择性等而受到研究人员的青睐。转氨酶是5’-磷酸吡哆醛(PLP)依赖性酶，能够催化前手性酮生成手性胺，具有严格的立体选择性和100％的理论产率。ω-转氨酶(ω-ATAs)属于IV型超家族转氨酶类，尽管各种ω-ATAs在手性胺的合成中表现出潜在的性能，但它们的大规模生产应用仍然存在稳定性不足和可回收性差的问题。在ω-ATAs的催化应用中，经常加入有机溶剂来助溶非天然有机底物。然而，有机溶剂的使用很容易导致ω-ATAs失活，这将在一定程度上增加酶的成本。此外，如果酶和其他细胞杂质不能有效地从反应体系中分离出来，也会导致产品提取过程中出现严重的乳化现象，增加了产品分离、纯化的难度，降低了产品纯度。
随着材料科学的快速发展，固定化作为一种新兴的分子修饰方法引起了研究人员的关注。与游离酶相比，固定化酶在工业应用中具有良好的优势，如操作稳定性高，固定化酶的可回收性，加速后期分离和纯化。特别是对于有机溶剂存在的酶促反应，通过固定化提高酶对有机溶剂的耐受性尤为重要。公开号为CN115806967A的发明专利公开了一种以树脂经多聚羟基化合物或多聚氨基化合物修饰后醛基化所得为载体固定化转氨酶，提高了固定化转氨酶的酶活稳定性和单位催化能力。
多壁碳纳米管(MWCNTs)是一种新型的固定化纳米材料，由多层石墨片沿着中心轴以一定的角度旋转而形成的，具有吸附能力强、比表面积大、稳定性好、生物相容性良好、表面官能团可控等特性。MWCNTs可以保护酶免受恶劣条件的影响，同时由于其较高的化学和结构稳定性，允许小分子底物/产物的传递。以MWCNTs为载体的共价结合是主要的固定化方法，它利用MWCNTs表面的可控官能团与蛋白质表面的氨基酸残基，如氨基、羧基、羟基等形成共价键。公开号为CN104404027A的发明专利公开了一种通过等离子体处理多壁碳纳米管为载体固定化酶的方法，与未经处理的多壁碳纳米管相比，提高了酶活和酶蛋白负载量。
上述专利通过不同的方法对固定化载体进行修饰后用于酶的固定化，可提高酶活或酶蛋白负载量，但还是存在固定化步骤繁琐的问题，而且对于酶的固定条件和有机溶剂耐受性的研究较少，因此，迫切需要开发一种提高ω-ATAs有机溶剂耐受性和可重复使用性的策略。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种固定化转氨酶的制备方法，以氨基化修饰的多壁碳纳米管(MWCNTs-NH2)为载体，以戊二醛为交联剂活化氨基多壁碳纳米管，将ω-转氨酶固定在氨基化多壁碳纳米管上得到固定化转氨酶(AtATA@MWCNTs-NH2)，并优化确定了ω-转氨酶的最佳固定化条件。通过ω-转氨酶的有机溶剂耐受性研究，构建催化反应的非水相体系，催化1-乙酰基萘反应生成(R)-NEA。
本发明提供的一种固定化转氨酶的制备方法，以氨基化修饰的多壁碳纳米管为载体，以戊二醛为交联剂活化氨基化多壁碳纳米管，将ω-转氨酶固定在氨基化多壁碳纳米管上得到固定化转氨酶，其中，ω-转氨酶与氨基化多壁碳纳米管的质量比为：每克氨基化多壁碳纳米管对应40～200mgω-转氨酶；戊二醛体积浓度为1～10％；固定化时pH为5～9，温度为4～64℃，时间为5～300min。
优选的，ω-转氨酶与氨基化多壁碳纳米管的质量比为：每克氨基化多壁碳纳米管对应120～200mgω-转氨酶；戊二醛体积浓度为2.5～5％；固定化时pH为6～8，温度为15～37℃，时间为5～30min。
更优选的，ω-转氨酶与氨基化多壁碳纳米管的质量比为：每克氨基化多壁碳纳米管对应160mgω-转氨酶；戊二醛体积浓度为3.3％；固定化时pH为8，温度为25℃，时间为10min。
在上述最佳固定条件下，固定化转氨酶在催化过程中的酶活性回收率最高。
优选的，固定化转氨酶的制备方法包括以下步骤：
(1)氨基化多壁碳纳米管与盐酸混合搅拌，离心用去离子水洗涤，通过离心收集并干燥得到盐酸处理过的多壁碳纳米管；将戊二醛与上述处理后的多壁碳纳米管混合搅拌，离心后用去离子水洗涤，收集后在干燥得到经戊二醛活化的多壁碳纳米管；
(2)称取ω-转氨酶和经戊二醛活化的氨基化多壁碳纳米管，将ω-转氨酶悬浮在缓冲液中，然后加入经戊二醛活化的氨基化多壁碳纳米管进行搅拌，再加入戊二醛，继续搅拌孵育固定，过滤回收即可得到固定化转氨酶。
一种固定化转氨酶，以氨基化修饰的多壁碳纳米管为载体，以戊二醛为交联剂活化氨基化多壁碳纳米管，将ω-转氨酶固定在氨基化多壁碳纳米管上得到固定化转氨酶，其中，ω-转氨酶与氨基化多壁碳纳米管的质量比为：每克氨基化多壁碳纳米管对应40～200mgω-转氨酶。
优选的，固定化转氨酶使用上述制备方法制备。
优选的，固定化转氨酶在催化1-乙酰基萘生成(R)-1-(1-萘基)乙胺中的应用。
更优选的，以1-乙酰基萘和苯乙胺为底物、以固定化转氨酶为催化剂、以体积浓度为10％的甲醇为助溶剂、以pH值为8的Tris-HCl体系为缓冲液进行催化反应，反应结束后对反应液进行分离纯化得到(R)-1-(1-萘基)乙胺。
重复上述催化反应，将每批次反应结束后收集的固定化转氨酶加入新的反应混合液中，进行继续催化，直到反应不能完成。采用高效液相色谱法分析产物产率和酶活。
本发明的有益效果：
本发明提供了一种固定化转氨酶的制备方法，以氨基化修饰的多壁碳纳米管为载体，以戊二醛为交联剂活化氨基化多壁碳纳米管，将ω-转氨酶固定在氨基化多壁碳纳米管上得到固定化转氨酶，AtATA@MWCNTs-NH2。
固定化转氨酶的最佳固定条件为ω-转氨酶与氨基化多壁碳纳米管的质量比为：每克氨基化多壁碳纳米管对应160mgω-转氨酶；戊二醛体积浓度为3.3％；固定化时pH为8，温度为25℃，时间为10min；缓冲液为Tris-HCl。在上述最佳固定条件下，固定化酶的酶活性回收率为78.7％。
以体积浓度为10％的甲醇为助溶剂，固定化转氨酶具有更高的活性。固定化转氨酶用于催化1-乙酰基萘反应生成(R)-NEA，连续反应15个批次后，(R)-NEA总产量为1.86g，e.e.p值(产物对映体过量)为99.5％，在非水体系中实现了(R)-NEA的克级规模化生产。
附图说明
图1为固定化转氨酶催化合成(R)-NEA的反应进程图。
图2为固定化转氨酶反应15批次后的剩余活性图。
具体实施方式
本发明提供一种固定化转氨酶的制备方法，包括以下步骤：
(1)氨基化多壁碳纳米管与盐酸混合搅拌，离心用去离子水洗涤，收集并干燥后得到盐酸处理过的多壁碳纳米管；将戊二醛与上述处理后的多壁碳纳米管混合搅拌，离心后用去离子水洗涤，收集并干燥后得到经戊二醛活化的多壁碳纳米管；
(2)称取ω-转氨酶和经戊二醛活化的氨基化多壁碳纳米管，将ω-转氨酶悬浮在缓冲液中，然后加入经戊二醛活化的氨基化多壁碳纳米管进行搅拌，再加入戊二醛，继续搅拌孵育固定，过滤回收即可得到固定化转氨酶。
通过固定化条件的优化，确定固定化转氨酶的最佳固定条件；通过固定化转氨酶的有机溶剂耐受性测定，确定助溶剂，构建非水相体系，并催化1-乙酰基萘反应生成(R)-NEA；采用高效液相色谱法测定(R)-NEA的产率和e.e.p值，评估固定化转氨酶循环批次使用能力。
实施例1
本发明公开一种固定化转氨酶的方法，具体步骤为：
(1)酶的表达与纯化
取E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-AtATA-D224K/V149A/L182F/L187F(制备过程参考申请号202210371099.0的专利，转氨酶突变体AtATA-D224K/V149A/L182F/L187F的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示)单菌落接种于5mL含有终浓度为50μg/mL硫酸卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃、230rpm下培养12h。菌液以2％的接种量(v/v)转接至200mL含有终浓度为50μg/mL硫酸卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃、230rpm下继续培养2～3h。当OD600(溶液在波长为600nm处的吸光值)达到0.8时，加入终浓度为0.5mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，并在25℃、150rpm条件下诱导蛋白表达。诱导20h后，在6000rpm，4℃条件下离心收集菌体。
菌体细胞用PBS缓冲液(20mM，pH 8.0)洗涤2次去除残留培养基，随后将菌体悬浮于50mL缓冲液(50mM磷酸二氢钠，300mM氯化钠，20mM咪唑，pH 8.0)中，冰浴条件下对菌体细胞进行均质机破碎细胞。细胞破碎液在8000rpm，4℃条件下离心10min，收集得到的上清液即为含有ω-转氨酶的粗酶液。随后采用Ni-NTA亲和层析法对粗酶液进行分离纯化，粗酶经上样、清洗、洗脱后得到纯酶液，操作步骤参照说明书进行。
(2)MWCNTs-NH2的活化
取20mL HCl(10mM)与1.0g的MWCNTs-NH2混合，在50℃下搅拌1h，将所得产物在6000rpm离心10min后，用去离子水洗涤至pH为中性，通过离心收集MWCNTs-NH2，并在60℃下干燥。将10mL体积浓度为5％的戊二醛与1.0g经HCl处理的MWCNTs-NH2混合，在25℃下搅拌1h，通过在6000rpm离心10min，收取MWCNTs-NH2。用去离子水洗涤3次，收集制备经戊二醛活化的MWCNTs-NH2，并在60℃下干燥。
(3)固定化ω-转氨酶的制备
用13mL PBS(50mM，pH 8.0)悬浮适量质量纯化的ω-转氨酶，并用PBS(50mM，pH8.0)定容至14mL，然后加入0.05g经戊二醛活化的MWCNTs-NH2，搅拌20min后加入1mL体积浓度为5％的戊二醛，在25℃，250r·min-1下继续搅拌15min，制备的固定化酶经过滤回收，并于4℃下保存。
实施例2
酶上样量的固定化条件优化。
分别取ω-转氨酶与MWCNTs-NH2比例为40、80、120、160、200mg/g的MWCNTs-NH2酶液，即固定化体系中分别加入2mg、4mg、6mg、8mg、10mg的ω-转氨酶，50mg的MWCNTs-NH2，1mL体积浓度为5％的戊二醛溶液，用PBS(50mM，pH 8.0)定容至15mL。在25℃，250rpm条件下的恒温振荡器中孵育1h，离心后用PBS(50mM，pH 8.0)清洗两次，即获得固定化ω-转氨酶，取适量固定化酶检测并计算酶活回收。
酶活性检测：在1mL总体系中，取适量的固定化酶加入含有20mM的1-乙酰基萘、20mM的1-(R)-苯乙胺、0.1mM PLP，体积浓度为10％甲醇和PBS(50mM，pH 8.0)的混合液中，在30℃、500rpm反应条件下反应30min，取100μL最终反应液，用50％乙腈∶水溶液(v/v)稀释后进行液相分析。
分析方法：采用1220Infinity II高效液相色谱系统(Agilent Technologies)、C-18色谱柱(4.6×150mm，4μm)检测底物1-乙酰萘和产物(R)-NEA的含量。检测器波长设置为210nm，流动相为体积比为1:39:60的0.15％乙醇胺、乙腈和超纯水的混合液，流速为1.0mL/min，柱温保持在30℃。
产物衍生：参照文献(R.Bhushan and H.Bruckner.Marfey’s reagent forchiral amino acid analysis:A review.Amino Acids,2004,27(3):231-247.)的方法进行衍生反应。将50μL反应液与100μL 1％marfey丙酮稀释液(m/v)混合，加入20μL NaHCO3溶液(pH 9.8)，置于40℃、400rpm反应2h，用20μL HCl(2M)淬灭反应。用3倍体积的二氯甲烷进行萃取，常温挥发之后，溶解于50％乙腈(v/v)：水溶液并稀释，进行液相分析。
高效液相色谱检测(用于手性检测)：色谱柱为Agilent InfinityLab Poroshell120(2.1×100mm，1.8μm)，柱温为30℃，进样量为10μL，流动相为A相(水+0.1％甲酸)，B相(乙腈)。流动相采用等度洗脱程序：0-8min，A相的比例为30％。
由表1可以看出，当比例为160mg/g时酶活回收达到最大，故酶与固定化载体的最佳比例为160mg/g。
表1不同酶与固定化载体的比例对固定化酶活性的影响
实施例3
戊二醛浓度的固定化条件优化。
取50mg的MWCNTs-NH2，加入5.34mL 1.5g/L的酶液，分别加入1mL体积浓度为1.0％、2.5％、3.3％、5％、10％的戊二醛溶液，用PBS(50mM，pH 8.0)定容至15mL，在25℃，250rpm下的恒温振荡器中孵育1h，离心后用PBS(50mM，pH 8.0)清洗两次，即获得固定化酶，取样检测并计算酶活回收。由表2可以看出，当戊二醛浓度为3.3％时固定化效果最好。
表2不同戊二醛浓度对固定化转氨酶酶活性的影响
| 戊二醛浓度(v/v，％) | 相对酶活(％) |
| 1 | 6.2 |
| 2.5 | 11.96 |
| 3.3 | 12.6 |
| 5 | 7.48 |
| 10 | 3.68 |
实施例4
固定化时间的条件优化。
取50mg的MWCNTs-NH2，加入5.34mL 1.5g/L的酶液，1mL体积浓度为3.3％的戊二醛溶液，用PBS(50mM，pH 8.0)定容至15mL，在25℃，250rpm下的恒温振荡器中分别孵育5、10、30、60、180、300min，离心后用PBS(50mM，pH 8.0)清洗两次，即获得固定化酶，取样检测并计算酶活回收。由表3可以看出，固定化时间为10min时固定化效果最好。
表3不同固定化时间对固定化转氨酶活性的影响
实施例5
pH值的固定化条件优化。
分别配制50 mM pH 5.0与pH 6.0的柠檬酸磷酸盐缓冲液、pH 7.0与pH 8.0的PBS缓冲液和pH 9.0的Tris-HCl缓冲液，取不同pH值缓冲液下的酶液5.34 mL(酶的浓度为1.5g/L)，加入50 mg的MWCNTs-NH2，加入1 mL体积浓度为3.3％的戊二醛，再分别用对应的缓冲液定容至15mL。在25℃、250 rpm下的恒温振荡器中孵育10 min，离心后即获得固定化酶，取样检测并计算酶活回收。由表4可以看出，当pH为8.0时固定化效果最好。
表4不同pH值对固定化转氨酶活性的影响
| pH值 | 相对酶活(％) |
| 5.0 | 8.22 |
| 6.0 | 35.28 |
| 7.0 | 41.62 |
| 8.0 | 53.32 |
| 9.0 | 12.00 |
实施例6
固定化温度的条件优化。
取50 mg的MWCNTs-NH2，加入5.34 mL 1.5 g/L的酶液和1 mL体积浓度为3.3％的戊二醛溶液，用PBS(50 mM，pH 8.0)定容至15 mL，分别在4℃、16℃、25℃、37℃、64℃，250r/min下的恒温振荡器中孵育10 min，离心后用PBS(50 mM，pH 8.0)清洗两次，即获得固定化酶，取样检测并计算酶活回收。由表5可以看出，当温度为25℃时固定化效果最好。
表5不同温度对固定化转氨酶酶活性的影响
实施例7
缓冲液类型的固定化条件优化。
分别配制50 mM、pH 8.0的Tris-HCl、PBS、磷酸氢二钠-柠檬酸、磷酸二氢钾-氢氧化钠、巴比妥钠-HCl缓冲液。取50 mg的MWCNTs-NH2，加入5.34 mL 1.5 g/L的酶液和1 mL体积浓度为3.3％的戊二醛溶液，分别用上述配制的不同类型的缓冲液定容至15 mL，在25℃，250 r/min下的恒温振荡器中孵育10 min，离心后清洗两次，即获得固定化酶，取样检测并计算酶活回收。由表6可以看出，使用Tris-HCL缓冲液时酶活达到最高，故最佳缓冲液为Tris-HCl缓冲液。
表6不同缓冲液对固定化转氨酶酶活性的影响
| 缓冲液 | 相对酶活(％) |
| Tris-HCl | 78.74 |
| PBS | 53.28 |
| 磷酸氢二钠-柠檬酸 | 30.28 |
| 磷酸二氢钾-氢氧化钠 | 17.94 |
| 巴比妥钠-HCl | 19.36 |
实施例8
AtATA@MWCNTs-NH2有机溶剂耐受性测定。
根据油水分配系数(log P值)，本研究选择甲醇(MeOH)、二甲基亚砜(DMSO)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)三种有机溶剂作为共溶剂。将纯酶和固定化转氨酶在3种不同的有机溶剂(浓度范围为5～50％，v/v)中孵育30 min，然后在最佳条件下测定残余活性，各组酶活性最高为100％。结果如表7所示，固定化转氨酶在DMSO和MeOH作为助溶剂的时候，具有较好的稳定性，为了便于后期的分离纯化过程，我们选择MeOH作为助溶剂。固定化酶在体积浓度为10％的MeOH可以维持较高的活性，且相较于5％体积浓度的MeOH可以溶解更多的底物，因此我们选择10％体积浓度的MeOH作为助溶剂。
表7纯酶和固定化酶的有机溶剂耐受性
实施例9
固定化转氨酶循环批次使用能力评估。
在50mL体系中，加入5.0g干重的固定化转氨酶、20mM 1-(R)-苯乙胺、20mM 1-乙酰萘和体积浓度为10％ MeOH为原料，在30℃、500rpm条件下进行反应，反应时间设置为9h。每批次结束后，固定化转氨酶在5000rpm，4℃下离心5min，并用50mM pH 8.0的Tris-HCl缓冲液洗涤2次。在30℃、pH 8.0、500rpm的标准转化条件下，将回收的固定化转氨酶悬浮在新鲜的反应混合液中进行下一批转化。这个过程不断重复，直到反应不能完成。
采用高效液相色谱法测定(R)-NEA的产率和e.e.p值。结果如图1和图2所示，反应总共进行15个批次，第1批次到第11批次的产率均>75％，第12批次到第15批次的产率均<75％，总共生成1.86g(R)-NEA，固定化转氨酶的相对活性均>80％，e.e.p值为99.5％，在非水体系中实现了(R)-NEA的克级规模化生产。
Claims (8)
1.一种固定化转氨酶的制备方法，其特征在于，以氨基化修饰的多壁碳纳米管为载体，以戊二醛为交联剂活化氨基化多壁碳纳米管，将ω-转氨酶固定在氨基化多壁碳纳米管上得到固定化转氨酶，其中，ω-转氨酶与氨基化多壁碳纳米管的质量比为：每克氨基化多壁碳纳米管对应40～200mgω-转氨酶；戊二醛体积浓度为1～10％；固定化时pH为5～9，温度为4～64℃，时间为5～300min。
2.根据权利要求1所述固定化转氨酶的制备方法，其特征在于，ω-转氨酶与氨基化多壁碳纳米管的质量比为：每克氨基化多壁碳纳米管对应120～200mgω-转氨酶；戊二醛体积浓度为2.5～5％；固定化时pH为6～8，温度为15～37℃，时间为5～30min。
3.根据权利要求2所述固定化转氨酶的制备方法，其特征在于，ω-转氨酶与氨基化多壁碳纳米管的质量比为：每克氨基化多壁碳纳米管对应160mgω-转氨酶；戊二醛体积浓度为3.3％；固定化时pH为8，温度为25℃，时间为10min。
4.根据权利要求1所述固定化转氨酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)氨基化多壁碳纳米管与盐酸混合搅拌，离心用去离子水洗涤，收集并干燥后得到盐酸处理过的多壁碳纳米管；将戊二醛与上述处理后的多壁碳纳米管混合搅拌，离心后用去离子水洗涤，收集并干燥后得到经戊二醛活化的多壁碳纳米管；
(2)称取ω-转氨酶和经戊二醛活化的氨基化多壁碳纳米管，将ω-转氨酶悬浮在缓冲液中，然后加入经戊二醛活化的氨基化多壁碳纳米管进行搅拌，再加入戊二醛，继续搅拌孵育固定，过滤回收即可得到所述固定化转氨酶。
5.一种固定化转氨酶，其特征在于，以氨基化修饰的多壁碳纳米管为载体，以戊二醛为交联剂活化氨基化多壁碳纳米管，将ω-转氨酶固定在氨基化多壁碳纳米管上得到固定化转氨酶，其中，ω-转氨酶与氨基化多壁碳纳米管的质量比为：每克氨基化多壁碳纳米管对应40～200mgω-转氨酶。
6.根据权利要求5所述固定化转氨酶，其特征在于，使用权利要求1～4任一所述制备方法制备。
7.权利要求5所述固定化转氨酶在催化1-乙酰基萘生成(R)-1-(1-萘基)乙胺中的应用。
8.据权利要求8所述固定化转氨酶的应用，其特征在于，以1-乙酰基萘和苯乙胺为底物、以固定化转氨酶为催化剂、以体积浓度为10％的甲醇为助溶剂、以pH值为8的Tris-HCl体系为缓冲液进行催化反应，反应结束后对反应液进行分离纯化得到(R)-1-(1-萘基)乙胺。
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