CN113862253A - 复合载体制备方法、复合载体及其对外消旋体的拆分方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物催化技术领域，为了解决目前使用脂肪酶对外消旋体的拆分时存在脂肪酶不稳定的技术问题，提供了复合载体制备方法、复合载体及其对外消旋体的拆分方法，所述复合载体制备方法，包括以下步骤：将NH2‑MOF‑5分散在恒温的有机溶剂中，再添加1,3‑二异丙基碳二亚胺盐进行活化反应后，离心去除上清液，得到沉淀物并洗涤。本发明将洋葱假单胞菌脂肪酶固定在复合载体的表面上，制得固定化酶，该固定化酶展现了优异的催化性能，与游离状态的脂肪酶相比，固定化后提高了脂肪酶的稳定性，强化了游离酶的对映体选择性，提高了催化活性。
Description
技术领域
本发明涉及生物催化技术领域，尤其涉及复合载体制备方法、复合载体及其对外消旋体的拆分方法。
背景技术
制备光学纯化合物的方法主要包括以下两类：1)通过立体选择性反应直接合成所需对映体；2)从外消旋体中分离所需对映体。对映体分离常用方法包括结晶、色谱、膜和液-液萃取等，其中由于酶催化剂无毒且可生物降解性，在工业应用上具有显著的优势，但是目前通过脂肪酶对外消旋体的拆分时存在脂肪酶不稳定的技术问题。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的复合载体制备方法、复合载体及其对外消旋体的拆分方法。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
复合载体制备方法，包括以下步骤：
步骤1：将NH2-MOF-5分散在恒温的有机溶剂中，再添加1,3-二异丙基碳二亚胺盐进行活化反应后，离心去除上清液，得到沉淀物并洗涤；
步骤2：将步骤1中活化后的NH2-MOF-5重新分散在有机溶剂中，并加入交联化PEI，于恒温下搅拌后，过滤出沉淀物并洗涤，再经冷冻干燥后，即得复合载体。
所述步骤1中NH2-MOF-5在有机溶剂中的浓度为0mg/mL-100mg/mL，且步骤1中活化反应的时间为20min-300min，活化反应的温度为1℃-30℃；
步骤1中添加的1,3-二异丙基碳二亚胺盐在有机溶剂中的浓度为0.01μL/mL-5μL/mL。
所述步骤2中交联化PEI在有机溶剂中的浓度为0mg/mL-200mg/mL；
步骤2中活化后的NH2-MOF-5在有机溶剂中的浓度为0mg/mL-300mg/mL；
步骤2中活化后的NH2-MOF-5与交联化PEI反应温度为1℃-30℃，反应时间为1h-24h。
所述步骤1中NH2-MOF-5分散在有机溶剂中用到的分散剂为DMF、DMSO、二氯甲烷、乙醚、三氯甲烷、四氯化碳、甲基叔丁基醚中的一种或几种溶剂的混合溶剂；
步骤2中活化的NH2-MOF-5分散在有机溶剂中用到的分散剂为DMF、DMSO、二氯甲烷、乙醚、三氯甲烷、四氯化碳、甲基叔丁基醚中的一种或几种溶剂的混合溶剂。
上述复合载体制备方法所制备的复合载体。
上述复合载体对外消旋体的拆分方法，包括以下步骤：
S1：将复合载体分散在有机溶剂中，搅拌后加入洋葱假单胞菌脂肪酶，恒温下充分搅拌后，过滤并冷冻干燥得到固定化酶；
S2：将外消旋1-(4-甲氧基苯基)-乙醇溶解于溶剂中，并加入酰基供体一同溶解，得到混合溶液，向混合溶液中加入S1中制备得到的固定化酶，充分反应后取样分析检测。
所述步骤S1中复合载体分散在有机溶剂中用到的分散剂为正己烷、环己烷、甲苯、正庚烷、异辛烷、二氯甲烷、乙醚、三氯甲烷、四氯化碳、甲基叔丁基醚中的一种或几种溶剂的混合溶剂；
步骤S2中外消旋1-(4-甲氧基苯基)-乙醇溶解于溶剂中用到的分散剂为正己烷、环己烷、甲苯、正庚烷、异辛烷、二氯甲烷、乙醚、三氯甲烷、四氯化碳、甲基叔丁基醚中的一种或几种溶剂的混合溶剂。
所述1-(4-甲氧基苯基)-乙醇的浓度为1mmol/L-500mmol/L，酰基供体浓度为1mmol/L-500mmol/L。
所述酰基供体是乙酸乙烯酯、乙酸酐、乙酸丙烯酯、乙酸异丁烯酯、丁酸乙烯酯、辛酸乙烯酯、月桂酸乙烯酯中的一种。
所述步骤S2中反应温度为5℃-60℃，时间为1h-36h。
本发明使用1,3-二异丙基碳二亚胺活化NH2-MOF-5表面的羧基获得活化的NH2-MOF-5，并通过活化的NH2-MOF-5表面的活化羧基与交联化PEI上氨基反应生成酰胺键，使NH2-MOF-5枝接在交联化PEI上得到复合载体，再通过物理吸附的方法，将洋葱假单胞菌脂肪酶固定在复合载体的表面上，制得固定化酶，该固定化酶展现了优异的催化性能，与游离状态的脂肪酶相比，固定化后提高了脂肪酶的稳定性，强化了游离酶的对映体选择性，提高了催化活性。采用本发明开发的复合载体制备的固定化酶稳定性和重复性好，在工业应用中还具有操作简便，易于与产物分离等优势，可以有效降低手性药物的生产成本。
采用固定化酶催化1-(4-甲氧基苯基)-乙醇对映体动力学拆分时，以有机溶剂作为反应介质，与水溶液体系比较，酶与有机介质不相溶，进一步强化了酶的回收和重复利用。同时所用溶剂是底物的良溶剂，这在实际应用中可以有效提高生产过程的处理能力。本发明一方面利用了NH2-MOF-5对洋葱假单胞菌脂肪酶的稳定能力和活化能力，对比实验表明，固载于NH2-MOF-5上的洋葱假单胞菌脂肪酶其催化活性和立体选择性较游离状态的葱假单胞菌脂肪酶显著提高；另一方面，通过枝接于交联PEI表面解决了单纯MOF载体稳定性差，在使用过程中结构易于坍塌的问题。
本发明解决了一般拆分技术所存在的光学纯度低和产率低的问题，同时该方法反应条件温和、绿色环保、操作简便。
附图说明
图1为本发明实施例提出的复合载体电镜图。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
实施例1
将200mg聚乙烯亚胺溶解于8mL的DMF中，在50mL反应管中，控温40℃，搅拌30min，随后加入2mL的戊二醛，在40℃下反应4h，过滤并用DMF洗涤三次，接着用去离子水洗涤三次，冷冻干燥得到交联化的PEI；
将1.19g六水合硝酸锌和0.322g 2-氨基对苯二甲酸溶解在30mL的DMF中，加入833μL三乙胺，室温下搅拌2h，过滤出沉淀物并用DMF洗涤三次后，在二氯甲烷浸泡24h，70℃下真空干燥12h，得NH2-MOF-5粉末；
将100mg的NH2-MOF-5分散于5mL二氯甲烷，加入300μL的1,3-二异丙基碳二亚胺盐，在5℃下搅拌2h，离心去除上清液，沉淀物分别用二氯甲烷、丙酮、冰水各洗涤三次，得到活化处理的NH2-MOF-5；在16mL DMF中，加入上述经活化处理的NH2-MOF-5，并加入100mg交联化的PEI，5℃下搅拌12h，过滤出沉淀物并用DMF洗涤，冷冻干燥得到棕褐色固体即为复合载体，产量192mg；
取100mg上述所得复合载体，100mg洋葱假单胞菌脂肪酶，25℃下在16mL的正己烷中充分搅拌12h，过滤出沉淀物并用正己烷洗涤三次，冷冻干燥得到固定化酶。
实施例2
同实施例1制备方法得到交联化的PEI；
同实施例1制备方法得到NH2-MOF-5粉末；
将500mg的NH2-MOF-5分散于5mL二氯甲烷，加入25μL的1,3-二异丙基碳二亚胺盐，在1℃下搅拌20min，离心去除上清液，沉淀物分别用二氯甲烷、丙酮、冰水各洗涤三次，得到活化处理的NH2-MOF-5；在16mL DMF中，加入上述经活化处理的NH2-MOF-5，并加入200mg交联化的PEI，1℃下搅拌1h，过滤出沉淀物并用DMF洗涤，冷冻干燥得到棕褐色固体即为复合载体；
取100mg上述所得复合载体，100mg洋葱假单胞菌脂肪酶，25℃下在16mL的正己烷中充分搅拌12h，过滤出沉淀物并用正己烷洗涤三次，冷冻干燥得到固定化酶。
实施例3
同实施例1制备方法得到交联化的PEI；
同实施例1制备方法得到NH2-MOF-5粉末；
将5mg的NH2-MOF-5分散于5mL二氯甲烷，加入0.05μL的1,3-二异丙基碳二亚胺盐，在30℃下搅拌5h，离心去除上清液，沉淀物分别用二氯甲烷、丙酮、冰水各洗涤三次，得到活化处理的NH2-MOF-5；在16mL DMF中，加入上述经活化处理的NH2-MOF-5，并加入16mg交联化的PEI，30℃下搅拌24h，过滤出沉淀物并用DMF洗涤，冷冻干燥得到棕褐色固体即为复合载体；
取100mg上述所得复合载体，100mg洋葱假单胞菌脂肪酶，25℃下在16mL的正己烷中充分搅拌12h，过滤出沉淀物并用正己烷洗涤三次，冷冻干燥得到固定化酶。
实施例4
取5mmol的外消旋1-(4-甲氧基苯基)-乙醇和30mmol乙酸乙烯酯加入至25mL容量瓶中，并加入正己烷定容；于25mL的反应管中，用移液管移取2mL反应液，加入20mg实施例1制备所得的固定化酶，在600rpm、35℃下加热反应12h；反应结束后，利用高效液相色谱仪对底物转化率和产物的光学纯度进行分析。
分析结果表明：洋葱假单胞菌脂肪酶优先识别(R)-1-(4-甲氧基苯基)乙醇，其(R)-1-(4-甲氧基苯基)乙醇的转化率为99.26％，剩余底物的光学纯度为98.48％。
实施例5
取5mmol的外消旋1-(4-甲氧基苯基)-乙醇和30mmol乙酸乙烯酯加入至25mL容量瓶中，并加入正己烷定容；于25mL的反应管中，用移液管移取2mL反应液，加入20mg实施例1制备所得的固定化酶，在600rpm、35℃下加热反应12h；反应结束后，利用高效液相色谱仪对底物转化率和产物的光学纯度进行分析。
对反应完后混合溶液固液分离，将反应体系固体部分用溶剂洗涤再冷冻干燥后回收固定化酶，在相同条件下进行催化实验，并重复反应六次后，分析结果表明：其(R)-1-(4-甲氧基苯基)乙醇的转化率经三次循环使用后基本不变，四次循环使用下降7.8％，剩余底物的光学纯度基本不变，六次循环后转化率下降17.2％，剩余底物的光学纯度基本不变。
针对脂肪酶的固定化情况设置对比例1-3：
对比例1
5mmol的外消旋1-(4-甲氧基苯基)乙醇对映体和30mmol乙酸乙烯酯加入至25mL容量瓶中，并加入正己烷定容；于25mL的反应管中，用移液管移取2mL反应液，并分别加入20mg洋葱假单胞菌脂肪酶，在600rpm、35℃下加热反应12h；反应结束后，利用高效液相色谱仪对底物转化率和产物的光学纯度进行分析。
分析结果表明：洋葱假单胞菌脂肪酶优先识别(R)-1-(4-甲氧基苯基)乙醇，其(R)-1-(4-甲氧基苯基)乙醇的转化率为63.38％，底物的光学纯度为45.44％。
对比例2
取100mg NH2-MOF-5，100mg洋葱假单胞菌脂肪酶，分散在16mL pH＝6.5的磷酸缓冲溶液中，25℃下充分搅拌12h，离心后用磷酸缓冲溶液洗涤三次，冷冻干燥12h得PS@NH2-MOF-5。
将5mmol外消旋1-(4-甲氧基苯基)-乙醇和30mmol乙酸乙烯酯溶解于25mL正己烷制得反应溶液；于25mL的反应管中，用移液管移取2mL反应液，并分别加入20mg PS@NH2-MOF-5，在600rpm、35℃下加热反应12h；反应结束后，利用高效液相色谱仪对底物转化率和产物的光学纯度进行分析。
分析结果表明：PS@NH2-MOF-5优先识别(R)-1-(4-甲氧基苯基)乙醇，其(R)-1-(4-甲氧基苯基)-乙醇的转化率为100％，底物的光学纯度为100％。对反应完后混合溶液固液分离，对反应体系固体部分进行回收，发现固定化酶PS@NH2-MOF-5回收率较低，经一次反应后仅收回约46.33％的PS@NH2-MOF-5。
对比例3
取100mg交联化的PEI，100mg洋葱假单胞菌脂肪酶，分散在16mL正己烷中，25℃下充分搅拌12h，使洋葱假单胞菌脂肪酶吸附固定在交联化的PEI上，用正己烷洗涤三次，冷冻干燥得到交联化PEI固定化的洋葱假单胞菌脂肪酶PS@PEI-GA。
将5mmol外消旋1-(4-甲氧基苯基)-乙醇和30mmol乙酸乙烯酯溶解于25mL正己烷制得反应溶液；于25mL的反应管中，用移液管移取2mL反应液，并分别加入20mg PS@PEI-GA，在600rpm、35℃下加热反应12h；反应结束后，利用高效液相色谱仪对底物转化率和产物的光学纯度进行分析。
分析结果表明：PS@PEI-GA优先识别(R)-1-(4-甲氧基苯基)-乙醇，其(R)-1-(4-甲氧基苯基)-乙醇的转化率为26.12％，底物的光学纯度为14.65％。
通过对比实施例4-5与对比例1-3可知，游离酶在相同条件下催化活性和选择性都较低；采用NH2-MOF-5固定化后，酶的选择性和活性均显著提高，但其回收性能差，回收过程损失加大，不利于其循环使用；使用交联化PEI直接固定洋葱假单胞菌脂肪酶，获得的固定化酶选择性和活性均下降，是由于PEI表面大量的氨基存在造成碱性微环境，抑制了酶的活性；而采用NH2-MOF-5枝接于交联化PEI上获得的复合载体，再固定化洋葱假单胞菌脂肪酶，获得的固定化酶选择性和活性均较高，是因为共价连接两种载体时PEI表面部分氨基被反应掉，同时表面枝接NH2-MOF-5后，酶与PEI表面氨基接触的机会减少；复合载体固定化的洋葱假单胞菌脂肪酶除了选择性和活性较高外，其循环使用性能也明显高于单纯NH2-MOF-5固定化的洋葱假单胞菌脂肪酶。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.复合载体制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：将NH2-MOF-5分散在恒温的有机溶剂中，再添加1,3-二异丙基碳二亚胺盐进行活化反应后，离心去除上清液，得到沉淀物并洗涤；
步骤2：将步骤1中活化后的NH2-MOF-5重新分散在有机溶剂中，并加入交联化PEI，于恒温下搅拌后，过滤出沉淀物并洗涤，再经冷冻干燥后，即得复合载体。
2.根据权利要求1所述的复合载体制备方法，其特征在于，所述步骤1中NH2-MOF-5在有机溶剂中的浓度为0mg/mL-100mg/mL，且步骤1中活化反应的时间为20min-300min，活化反应的温度为1℃-30℃；
步骤1中添加的1,3-二异丙基碳二亚胺盐在有机溶剂中的浓度为0.01μL/mL-5μL/mL。
3.根据权利要求1所述的复合载体制备方法，其特征在于，所述步骤2中交联化PEI在有机溶剂中的浓度为0mg/mL-200mg/mL；
步骤2中活化后的NH2-MOF-5在有机溶剂中的浓度为0mg/mL-300mg/mL；
步骤2中活化后的NH2-MOF-5与交联化PEI反应温度为1℃-30℃，反应时间为1h-24h。
4.如权利要求1所述的复合载体制备方法，其特征在于，所述步骤1中NH2-MOF-5分散在有机溶剂中用到的分散剂为DMF、DMSO、二氯甲烷、乙醚、三氯甲烷、四氯化碳、甲基叔丁基醚中的一种或几种溶剂的混合溶剂；
步骤2中活化的NH2-MOF-5分散在有机溶剂中用到的分散剂为DMF、DMSO、二氯甲烷、乙醚、三氯甲烷、四氯化碳、甲基叔丁基醚中的一种或几种溶剂的混合溶剂。
5.根据权利要求1-4任一所述的复合载体制备方法所制备的复合载体。
6.如权利要求5所述的复合载体对外消旋体的拆分方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：将复合载体分散在有机溶剂中，搅拌后加入洋葱假单胞菌脂肪酶，恒温下充分搅拌后，过滤并冷冻干燥得到固定化酶；
S2：将外消旋1-(4-甲氧基苯基)-乙醇溶解于溶剂中，并加入酰基供体一同溶解，得到混合溶液，向混合溶液中加入S1中制备得到的固定化酶，充分反应后取样分析检测。
7.根据权利要求6所述的复合载体对外消旋体的拆分方法，其特征在于，所述步骤S1中复合载体分散在有机溶剂中用到的分散剂为正己烷、环己烷、甲苯、正庚烷、异辛烷、二氯甲烷、乙醚、三氯甲烷、四氯化碳、甲基叔丁基醚中的一种或几种溶剂的混合溶剂；
步骤S2中外消旋1-(4-甲氧基苯基)-乙醇溶解于溶剂中用到的分散剂为正己烷、环己烷、甲苯、正庚烷、异辛烷、二氯甲烷、乙醚、三氯甲烷、四氯化碳、甲基叔丁基醚中的一种或几种溶剂的混合溶剂。
8.根据权利要求6所述的复合载体对外消旋体的拆分方法，其特征在于，所述1-(4-甲氧基苯基)-乙醇的浓度为1mmol/L-500mmol/L，酰基供体浓度为1mmol/L-500mmol/L。
9.根据权利要求6所述的复合载体对外消旋体的拆分方法，其特征在于，所述酰基供体是乙酸乙烯酯、乙酸酐、乙酸丙烯酯、乙酸异丁烯酯、丁酸乙烯酯、辛酸乙烯酯、月桂酸乙烯酯中的一种。
10.根据权利要求6所述的复合载体对外消旋体的拆分方法，其特征在于，所述步骤S2中反应温度为5℃-60℃，时间为1h-36h。
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