CN117701487A - 一种高效表达淀粉酶基因的地衣芽孢杆菌工程菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本申请公开了一种高效表达淀粉酶基因的地衣芽孢杆菌工程菌及其应用，属于生物工程技术领域。该工程菌是以地衣芽胞杆菌BL10为出发菌株，将含有淀粉酶基因的表达载体转入至所述的出发菌株中获得的。首次采用基因工程技术以地衣芽胞杆菌BL10为宿主菌构建表达烟草专用淀粉酶的工程菌株，该工程菌表达的淀粉酶对烟草淀粉具有高效降解作用，应用于烟叶发酵，能够在降解烟叶淀粉的同时降低卷烟烟气中的焦糊气息，为烟叶品质的提升提供了一种新途径。

Description

一种高效表达淀粉酶基因的地衣芽孢杆菌工程菌及其应用

技术领域

本申请属于生物工程技术领域，涉及一种高效表达淀粉酶基因的地衣芽孢杆菌工程菌及其应用。

背景技术

烟草淀粉是烟叶中重要的碳水化合物，作为一种大分子物质，在燃烧时会形成大量对人体健康有害的化学物质，同时烟草淀粉等大分子物质的燃烧还会使烟气刺激性和焦糊气味增加，降低卷烟的感官评价。

淀粉酶可以降解烟草中的淀粉，使淀粉分解为糊精、麦芽糖等，它们再进一步被分解为还原糖，这不仅能降低烟草燃烧后产生的有害物质的种类和含量，同时烟草淀粉分解后产生的游离糖等物质在燃烧过程中会与氨基酸发生美拉德反应，提升烟草燃烧后香味物质的含量。由此可见，通过淀粉酶处理烟叶是提升烟叶质量、降低其健康危害的潜在方法。但目前的研究所采用的淀粉酶多来自于市售食品酶，由于烟草淀粉和常见食品淀粉结构和性质的差异，商业化食品级淀粉酶对烟草淀粉的降解活力仅为对食用淀粉的40%左右，影响生物酶处理技术在烟草行业的高效使用。

通过基于生物安全的工程菌有望获得表达淀粉酶的生物安全菌株，目前已在枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌的工程菌中表达了淀粉酶，但是在这些工程菌中表达的淀粉酶酶活力不高，且对烟草淀粉降解的专一性不强。因此开发淀粉酶酶活力较高并且对烟草淀粉降解具有专一性的工程菌具有十分广阔的应用前景，对推动生物酶处理技术在烟草行业的高效使用也具有重大意义。

因此，需要开发一种可针对烟草淀粉的，能够显著提高烟草淀粉降解活性的烟草专用淀粉酶工程菌。

发明内容

为了解决上述问题，本申请提供了一种高效表达淀粉酶基因的地衣芽孢杆菌工程菌，该工程菌是以地衣芽胞杆菌BL10为出发菌株，将含有淀粉酶基因的表达载体转入至所述的出发菌株中获得的。该工程菌表达的淀粉酶对烟草淀粉具有高效降解作用，应用于烟叶发酵，能够在降解烟叶淀粉的同时降低卷烟烟气中的焦糊气息，为烟叶品质的提升提供了一种新途径。

本申请具体的技术方案如下：

本申请提供了一种高效表达淀粉酶基因的地衣芽孢杆菌工程菌，该工程菌是以地衣芽胞杆菌BL10为出发菌株，将含有淀粉酶基因的表达载体转入至所述的出发菌株中获得的。其中，地衣芽孢杆菌BL10是以地衣芽孢杆菌WX-02为出发菌，敲除基因hag、mpr、vpr、aprX、epr、bpr、wprA、aprE、amyL和bpr后构建的。

可选的，所述淀粉酶基因为以下任意一种：

（1）来源于蜡样芽孢杆菌WHC-17的amyS，核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示；

（2）来源于枯草芽孢杆菌WHC-84的amyE，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

（3）来源于枯草芽孢杆菌WHC-108的amyE，核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示；

（4）来源于枯草芽孢杆菌WHC-115的amyE，核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示；

（5）来源于贝莱斯芽孢杆菌WHC-117的amyE，核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示；

（6）来源于解淀粉芽孢杆菌MK10163的amyA(LC)，核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。

优选的，所述淀粉酶基因为来源于解淀粉芽孢杆菌MK10163的淀粉酶基因amyA(LC)，核苷酸序列如 SEQ ID NO. 1 所示。

可选的，所述的含有淀粉酶基因的表达载体的信号肽为以下任意一种：

（1）SP001信号肽，核苷酸序列如 SEQ ID NO.9所示；

（2）SP002信号肽，核苷酸序列如 SEQ ID NO.10所示；

（3）SP003信号肽，核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。

优选的，所述的含有淀粉酶基因的表达载体的信号肽为SP003信号肽，核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。

本申请还提供了一种上述工程菌在制备淀粉酶中的应用。

本申请还提供了一种利用上述工程菌制备获得的淀粉酶。

本申请还提供了上述工程菌的构建方法，包括：

通过PCR技术获得解淀粉芽孢杆菌MK10163中的淀粉酶基因amyA(LC)，通过同源重组技术将SP003信号肽核苷酸片段和amyA(LC)基因连接成的同源重组序列插入到PT-17质粒中，获得重组表达载体；将获得的重组表达载体转入出发菌株地衣芽孢杆菌BL10中，构建得到表达淀粉酶的地衣芽胞杆菌工程菌BL10/PT-17SP003amyA(LC)；所述重组表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。

本申请还提供了一种生产上述淀粉酶的方法，包括：

向发酵培养基中接种地衣芽胞杆菌工程菌进行发酵，离心获得上清液，水相膜过滤，获得所述淀粉酶的粗酶液。

本申请还提供了上述地衣芽胞杆菌工程菌和/或上述淀粉酶在烟叶发酵中的应用，将所述地衣芽胞杆菌工程菌的发酵上清过滤液喷洒在烟草制品表面进行发酵。

本申请的有益效果包括但不限于：

1.本申请地衣芽孢杆菌工程菌是含有来源于解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens）MK10163的淀粉酶基因amyA(LC)的表达载体所构建的工程菌，相较于含有来源于蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）WHC-17、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）WHC-108、WHC-115、贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）WHC-117的淀粉酶基因的表达载体所构建的工程菌，其发酵上清液具有更强的淀粉酶活力。

2.本申请首次采用基因工程技术以地衣芽胞杆菌BL10为宿主菌构建表达淀粉酶的工程菌株。本申请在实验过程中发现，以地衣芽孢杆菌BL10为基础构建的重组菌株BL10/PT-17SP003amyA(LC)发酵上清液中检测到的酶活是以枯草芽孢杆菌B.subtilis168宿主菌、B.subtilis SCK6宿主菌和解淀粉芽孢杆菌B.amyloliquefaciens BAX-5宿主菌中的任意一种为基础构建的重组菌株的发酵上清液酶活的至少1.3倍。表明本申请获得的工程菌株BL10/PT-17SP003amyA(LC)可以高效分泌淀粉酶。

本申请工程菌株BL10/PT-17SP003amyA(LC)淀粉酶酶活能够达到170.39 U/mL，比amyA(LC)基因的来源菌株MK10163提高了1.34倍。本申请工程菌的构建为淀粉酶的高效表达提供了新方法，具有广阔的市场应用前景。

3.本申请工程菌表达的淀粉酶还能够降解烟草淀粉，应用于烟叶发酵中，能够降解烟叶淀粉含量（48 h内降幅可达到21.37%）的同时降低卷烟烟气中的焦糊气息，使得烟气香气量更加丰富，为烟叶品质的提升提供了一种新途径。另外，利用本申请工程菌株产的淀粉酶在烟草淀粉处理中具有较高的应用价值，对于工业领域中降解烟叶的生物酶处理具有一定的指导意义。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：

图1是实施例1中淀粉酶基因克隆的核酸电泳图，其中A为amyS(WHC-17)，B为amyE(WHC-84)，C为amyE(WHC-108)，D为amyE(WHC-115)，E为amyE(WHC-117），F为amyA(LC)；

图2是实施例1中所合成的三种信号肽核苷酸的核酸电泳图，其中红色箭头所指为SP003信号肽；

图3是实施例1中不同菌株来源的淀粉酶基因表达活性；

图4是实施例2中不同信号肽的重组表达菌株淀粉酶活性的比较；

图5是实施例3中PT-17SP003amyA(LC)在不同工程菌中的淀粉酶活性比较；

图6是实施例4中BL10/PT-17SP003amyA(LC)工程菌粗酶液在烟草淀粉平板上的透明圈。

具体实施方式

为了更清楚的阐释本申请的整体构思，下面结合说明书附图以实施例的方式进行详细说明。在下文的描述中，给出了大量具体的细节以便提供对本申请更为彻底的理解。然而，对于本领域技术人员来说显而易见的是，本申请可以无需一个或多个这些细节而得以实施。在其他的例子中，为了避免与本申请发生混淆，对于本领域公知的一些技术特征未进行描述。

如未特殊说明，在以下实施方式中，所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。实例中所使用的质粒，内切酶，PCR酶，柱式DNA抽提试剂盒和DNA凝胶回收试剂盒等采用商用产品，具体操作按照试剂盒说明书进行。

除非另外说明，本申请中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。

实施例1 淀粉酶基因的筛选

1、淀粉酶基因的克隆

本申请所提供淀粉酶基因的供体菌株均为发明人所在实验室保存的具有较强淀粉酶分泌能力的菌株，包括蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）WHC-17、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）WHC-84、WHC-108、WHC-115、贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）WHC-117和解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）MK10163。以扩增MK10163的淀粉酶基因为例，使用amyA-F/R为引物克隆其基因组中的基因amyA(LC)，其PCR 体系如表1所示，PCR结束后通过核酸电泳检验条带大小(图1 F)，然后采用Gel Extraction Kit试剂盒回收片段。其核苷酸序列经武汉擎科生物公司测序，如SEQ ID NO. 1所示；按照如上方法依次获得其他淀粉酶基因amyS(WHC-17)（SEQ ID NO. 2）、amyE(WHC-84)（SEQ ID NO. 3）、amyE(WHC-108)（SEQ ID NO. 4）、amyE(WHC-115)（SEQ ID NO. 5）和amyE(WHC-117)（SEQ IDNO. 6）。amyS(WHC-17)、amyE(WHC-84)、amyE(WHC-108)、amyE(WHC-115)和amyE(WHC-117)核酸电泳检验条带大小依次如图1中的A、B、C、D、E所示。其中以amyE(WHC-84)和amyE(WHC-108)的核酸序列经测序，相似度为100%，所以采用amyE(WHC-108)作为后续实验基因。

上述的解淀粉芽孢杆菌MK10163分类命名为Bacillus amyloliquefaciensMK10163，保藏单位为中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏地址为中国.武汉.武汉大学，具体为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，保藏日期为2023年12月04日，保藏编号为CCTCC NO：M 20232452。

表 1PCR反应体系

其中，淀粉酶基因合成引物为：

amyA-F:GCTCTAGAATGTTTGAAAAACGATTCAAAAC

amyA-R:CGCGGATCCTTAATGCGGAAGATAACCGT

amyE-F:GCTCTAGAATGTTTGCAAAACGATTCAAAACC

amyE-R:CGCGGATCCTCAATGGGGAAGAGAACCG

amyS-F:GCTCTAGAATGTTTAAAAGAATAACAATAGTCGGATT

amyS-R:CGCGGATCCTTACTGCTGAACATATATGGAAACTGAT

2、构建不同淀粉酶基因的表达载体

将4个淀粉酶基因amyS(WHC-17)、amyE(WHC-108)、amyE(WHC-115)、amyE(WHC-117)和质粒PT-17分别用限制性核酸内切酶XbaⅠ和BamHⅠ进行酶切，使质粒PT-17在启动子与终止子之间断裂，露出粘性末端；去掉淀粉酶基因两端的保护碱基，露出与线性化质粒PT-17两端互补的粘性末端，酶切体系如表2所示，将配好的体系于37℃放置1 h，采用GelExtraction Kit试剂盒回收片段。

表 2 酶切反应体系

将酶切回收的片段和质粒进行酶连，其体系如表 3 所示，将配好的体系于 4℃静置6 h，然后以钙离子转化法转入大肠杆菌DH5α。

表3酶连体系

取出-80℃保存的大肠杆菌DH5α感受态细胞于冰盒中冰浴10 min解冻，用移液器吸取5-10 μL酶连产物加入感受态细胞中，轻轻打匀，继续冰浴25 min，然后42℃热激90 s后将感受态立即置于冰上再冰5 min，加入800 μL灭好菌的无抗性LB液体培养基，于200 r/min、37℃培养60 min，取出后通过离心机5000 r/min离心5 min收菌，吸去700 μL上清液，再将剩余菌液吹打均匀，涂布于带有四环素抗性的LB固体培养基平板，倒置放于37℃培养箱过夜，长出菌落后交由武汉擎科生物公司进行测序比对验证，取序列比对正确的菌转入含5 mL 带有四环素抗性的LB培养基中，在37℃、200 r/min摇床中过夜培养，采用质粒抽提试剂盒抽提，得到含有不同淀粉酶基因的表达载体PT-17amyS(WHC-17)、PT-17amyE(WHC-108)、PT-17amyE(WHC-115)和PT-17amyE(WHC-117)。

PT-17载体是在pHY300PLK载体骨架上进一步改造优化得到的，具体步骤如下：

（1）以枯草芽胞杆菌（市售）的总DNA为模板，采用PCR的方法扩增出P43启动子序列（SEQ ID NO.7），引物为P43-F/R(SOE)；以地衣芽胞杆菌WX-02的总DNA为模板，采用PCR的方法扩增出淀粉酶基因amyL的TamyL终止子序列（SEQ ID NO.8），引物为TamyL-F/R。

上述的地衣芽胞杆菌WX-02是本申请人从华中农业大学（与本申请人存在项目合作关系）处获得的，地衣芽胞杆菌WX-02已被华中农业大学于专利CN 101603015A中公开。

（2）以实验室保存的表达载体pHY300PLK为初始载体构建外源基因高效表达载体。先将P43启动子、TamyL终止子片段通过SOE-PCR的方法连到一起，构成P43-TamyL重组序列。通过EcoRI/XbaI双酶切，纯化回收后与同样经过EcoRI/XbaI双酶切的pHY300PLK空质粒酶连，酶连温度为16℃，时间为8 h，酶连产物随后转化DH5α，挑转化子进行菌落PCR验证，将PCR验证正确的转化子挑菌接至含有5 mL LB培养基的PA瓶中（50 ug/mL氨苄抗生素），抽质粒并测序，测序正确的则为构建成功的带有P43启动子和TamyL终止子的PT-17空载体。

P43-F/R(SOE)、TamyL-F/R引物序列如下所示：

P43-F(SOE):CGGAATTCTGATAGGTGGTATGTTTTCG

P43-R(SOE):CTTGAATCAGTCTCTTTTTCATTTCATGTGTACATTCCTCTC

TamyL-F:ATCAACGTACAAGCAGCTGCACAAAAGAGCAGAGAGGACGGAT

TamyL-R:GCTCTAGAGCCGCAATAATGCCGTCGCACTG

其中需要说明的是，在amyA(LC)基因表达载体的构建过程中，首先将P43启动子、amyA(LC)基因片段和TamyL终止子通过SOE-PCR技术连接成P43- amyA(LC)- TamyL重组序列，通过EcoRI/XbaI双酶切，去除5’端和3’端的保护碱基，纯化回收后与同样经过EcoRI/XbaI双酶切的pHY300PLK空质粒酶连，构成表达载体pHY300PamyA(LC)。这5个表达载体（PT-17amyS(WHC-17)、PT-17amyE(WHC-108)、PT-17和PT-17amyE(WHC-117)、pHY300PamyA(LC)）的载体骨架、启动子和终止子相同，区别在于构建流程不同。

换言之，PT-17与pHY300PLK实际上是同一个载体：若将启动子和终止子先加到了pHY300PLK上，此时载体称作PT-17；若将启动子、终止子和amyA(LC)先重组，后插入到了pHY300PLK上，此时载体称作pHY300PLK，只不过是构建流程不同。

不同淀粉酶基因的表达载体产酶能力比较

将5个不同的淀粉酶基因表达载体电转到实验室保存的解淀粉芽胞杆菌BAX-5工程菌（HZ-12野生菌敲除冗余蛋白基因，不会影响目的蛋白表达）感受态细胞中，具体操作为：取出-80℃保存的BAX-5感受态细胞冰浴10 min，吸取10 μL载体质粒加入感受态细胞液中，混匀后转入预先吹干并冰浴冷却的2 mm电转杯中，冰浴10 min，使用电转仪电转后用800 μL的恢复培养基(每100 mL的LB液体培养基中添加山梨醇9.11 g和甘露醇6.38 g)将菌液洗出，于120 r/min、37℃摇床培养3 h，取出后通过离心机5500 r/min离心5 min收菌，吸去700 μL上清液，再将剩余菌液打匀，涂布在带有四环素抗性的平板，37℃培养箱培养12h-14 h，挑取转化子进行菌落PRC验证，验证引物为P43-F/R，阳性菌落则为可用于发酵实验的菌株，保存于甘油管中，-80℃冻存。

其中，引物P43-F/R的序列如下所示：

P43-F：GCTCTAGATGATAGGTGGTATGTTTTCGC

P43-R：CGCGGATCCTTCATGTGTACATTCCTCTCTTAC

将构建好的工程菌从-80℃的冰箱中取出，解冻后蘸取少许菌液在四环素抗性的固体LB培养基上划线活化，在培养箱37℃培养12 h-24 h后，挑取单菌落转入5 mL的四环素抗性的液体LB培养基中进一步活化，在摇床140 r/min、37℃培养8 h-12 h至OD600达到1.5，然后以3%的接种量接种至50 mL四环素抗性的高密度培养基(胰蛋白胨80 g/L，酵母粉25 g/L，磷酸氢二钾5 g/L，氯化铵6 g/L)中，每个菌株做3个平行，在摇床140 r/min、37℃培养48 h，取发酵液2 mL于离心管中，10000 r/min离心10 min，取发酵上清液测酶活。

淀粉酶酶活力测定

（1）酶活性定义

该测定方法下淀粉酶酶活性单位定义为：在70℃，pH 6.0条件下，每分钟水解底物淀粉的毫克(mg)数。

（2）淀粉浓度-吸光度标准曲线的绘制

可溶性淀粉溶液(2 g/L)的配制：称取1.000 g(精确至0.001 g)可溶性淀粉 (应采用酶制剂分析专用淀粉)于烧杯中，加少量水调成浆状物，边搅拌边缓缓加入200 mL沸水中，然后用水分次冲洗装淀粉的烧杯，洗液倒入其中，搅拌加热至完全透明，冷却定容至500mL，溶液现配现用。

可溶性淀粉标准溶液：按表4进行配制。

表 4 标准淀粉溶液配置表

分别吸取上述溶液各1.00 mL(须做平行试验)，分别加入到盛有0.5 mL 0.1 mol/L盐酸溶液和5.00 mL稀碘液的离心管中，充分摇匀，以0.5 mL 0.1 mol/L盐酸溶液和5.00mL稀碘液的混合液为空白，在660 nm波长下，用分光光度计迅速测定其吸光度(A)，以吸光度(A)为横坐标(x)，可溶性淀粉标准溶液浓度为纵坐标(y)，绘制标准曲线，得到标准方程y=1.1986x-0.0006，R²=0.9998，并得到斜率K=1.1986。

（3）测定

吸取20.0 mL可溶性淀粉溶液(2 mg/mL)于50 mL离心管中，加入5.00 mL pH为6.0的磷酸缓冲液摇匀后置于70±0.2℃恒温水浴锅中预热8 min。

取发酵上清液1 mL，用pH为6.0的磷酸缓冲液稀释到合适的浓度。加入1.00 mL稀释好的酶液，立即计时，摇匀，保持70±0.2℃恒温准确反应10 min；立即用移液器吸取1.00mL反应液，加到预先盛有0.5 mL 0.1 mol/L盐酸溶液和5.00 mL稀碘液的离心管中，摇匀，并以0.5 mL盐酸溶液和5.00 mL稀碘液的混合液为空白，在660 nm波长下，用分光光度计迅速测定其吸光度(A)。

（4）结果计算淀粉酶的酶活力

淀粉酶的酶活力X，以U/mL或U/g计，按下式进行计算：

X=（2×20-26×AK）×n/10

式中：

2 ——可溶性淀粉溶液初始浓度；

20 ——测定时可溶性淀粉溶液的体积；

26 ——待测酶液的体积、pH为6.0磷酸缓冲液的体积以及测定时可溶性淀粉溶液的体积之和；

A ——所测酶液的吸光光度值；

K ——所得标准曲线的斜率；

n ——酶液的稀释倍数；

10 ——测定时酶液的反应时间。

试验结果以平行测定结果的算术平均值为准。在重复性条件下获得的两次独立测定结果的相对误差不得超过5%。

最终测得工程菌的发酵上清液中淀粉酶的活力如图3所示，其中工程菌BAX-5/pHY300PamyA(LC)为47.36 U/mL，远高于其他工程菌和BAX-5空白对照，因此选择amyA(LC)基因作为后续实验基因。

实施例2 信号肽的筛选

1、信号肽的合成

基于信号肽数据库SPSED(http://www.spsed.com)预测出三种信号肽对淀粉酶基因表达具有较强的促进作用。本研究将这三种信号肽命名为SP001、SP002和SP003，核苷酸由武汉擎科生物公司合成，合成引物为Singnal-F/R，信号肽核苷酸片段经核酸电泳检测后条带大小正确(图2)，SP001信号肽核苷酸序列如 SEQ ID NO.9所示，依次地，SP002信号肽（SEQ ID NO.10），SP003信号肽（SEQ ID NO.11）。

其中，信号肽的合成引物分别为：

Singnal1-F:GCTCTAGAGTGAAAGAAGTAAGGTTTTGGG

Singnal1-R:GCATCAGCGTGCCATTTACAGCCTTACTAACTAACGGTATCAC

Singnal2-F:GCTCTAGAATGCCTTATCTGAAACGAGTGT

Singnal2-R:GCATCAGCGTGCCATTTACAGCTGAGGCAGTAGCAGTGACTGCAAAC

Singnal3-F:GCTCTAGAATGCGCATTTTCAAAAAAG

Singnal3-R:GCATCAGCGTGCCATTTACAGCATGTGCTGTATTCACATTTAC

2、通过SOE-PCR将信号肽与amyA(LC)连接

通过重叠延伸拼接PCR技术(SOE-PCR)将三种信号肽核苷酸片段与基因amyA(LC)非信号肽翻译区的核苷酸片段连接。其反应体系如表5所示，扩增条件为：预变性94℃，5min（1个循环）；变性94℃ 45 s，退火55℃ 45 s，延伸72℃ 30 s（30个循环）；总延伸72℃10min（1个循环）。通过核酸电泳验证连接产物大小正确后采用Gel Extraction Kit试剂盒回收片段。

表 5PCR反应体系

其中，用于连接三个不同信号肽的amyA(LC)基因需要用到三组不同的引物扩增，所涉及到的引物有：

amy(LS-1)-F:GTGATACCGTTAGTTAGTAAGGCTGTAAATGGCACGCTGATGC

amy(LS-1)-R:TCCCCCGGGTTATTTCTGAACATAAATGGAGAC

amy(LS-2)-F:GTTTGCAGTCACTGCTACTGCCTCAGCTGTAAATGGCACGCTGATGC

amy(LS-2)-R:TCCCCCGGGTTATTTCTGAACATAAATGGAGAC

amy(LS-3)-F:GTAAATGTGAATACAGCACATGCTGTAAATGGCACGCTGATGC

amy(LS-3)-R:TCCCCCGGGTTATTTCTGAACATAAATGGAGAC

3、构建信号肽不同的淀粉酶重组表达载体

将上述得到的重组片段通过如实施例1所述的酶切（与实施例1的不同在于内切酶为XbaⅠ和SamⅠ）和连接方法构建信号肽不同的淀粉酶重组表达载体，分别为PT-17SP001amyA(LC)、PT-17SP002amyA(LC)和PT-17SP003amyA(LC)。

验证不同信号肽对淀粉酶基因表达的促进能力

将上述得到的重组表达载体按照实施例1所述的方法，电转入解淀粉芽胞杆菌BAX-5工程菌感受态细胞中，并进行发酵实验，最终测得工程菌的发酵上清液中淀粉酶的活力如图4所示，其中工程菌BAX-5/PT-17SP003amyA(LC)为67.20 U/mL，高于其他信号肽的工程菌和BAX-5空白对照，因此选择SP003信号肽作为介导amyA(LC)表达的最佳信号肽，PT-17SP003amyA(LC)表达载体经测序得到的最终序列如SEQ ID NO.12所示。

实施例3amyA (LC)表达宿主菌的对比分析

本实施例将质粒PT-17SP003amyA(LC)分别通过电转化的方法转入实验室保存的枯草芽孢杆菌B.subtilis168宿主菌、B.subtilis SCK6宿主菌、解淀粉芽孢杆菌B.amyloliquefaciens BAX-5宿主菌和地衣芽孢杆菌B.licheniformis BL10宿主菌中，通过实施例1的方法制备发酵上清液，并测定淀粉酶酶活，比较各重组菌株中淀粉酶的酶活，结果如图5所示，以地衣芽孢杆菌BL10宿主菌为基础构建的重组菌株BL10/PT-17SP003amyA(LC)的发酵液中检测到的淀粉酶酶活最高，达到了 170.39 U/mL，而BAX-5/PT-17SP003amyA(LC)、SCK6/PT-17SP003amyA(LC)和168/PT-17SP003amyA(LC)的淀粉酶酶活分别只有74.04 U/mL、116.09 U/mL和130.92 U/mL，因此BL10/PT-17SP003amyA(LC)工程菌株是淀粉酶活最高的菌株。

地衣芽胞杆菌BL10表达宿主（已在《Efficient expression of nattokinase inBacillus licheniformis：host strain construction and signal peptideoptimization》文章中公开），该菌株是以地衣芽孢杆菌WX-02为出发菌，敲除基因hag、mpr、vpr、aprX、epr、bpr、wprA、aprE、amyL和bpr，构建方法如下：

(1)构建敲除载体：以epr基因为例，根据B.licheniformisWX-02全基因组序列中的epr基因上下游序列约500bp，设计上下游同源臂引物epr-AF/R和epr-BF/R，以B.licheniformis WX-02的基因组DNA作为模板，分别扩增出epr上下同源臂序列A和B，PCR产物纯化后回收，通过SOE-PCR将同源臂序列A和B相连接在一起，产物回收纯化后与温敏型敲除质粒T2(2)-ori分别用限制性内切酶Xba I和Sac I进行双酶切，产物回收后，用T4连接酶将酶切后的PCR产物和质粒在25℃连接2小时，连接产物转化DH5α感受态细胞，采用T2-F/R引物对单菌落进行菌落PCR验证，初步确定为阳转化子后，抽取质粒进行双酶切和DNA测序验证，验证正确后得到基因epr的敲除载体(T2Δepr)。用同样的方法还构建了T2Δhag、T2Δmpr、T2Δvpr、T2ΔaprX、T2Δbpr、T2ΔwprA、T2ΔaprE、T2ΔamyL、T2ΔbprA。

(2)构建缺失突变株：将构建的敲除质粒T2Δepr电转化到地衣芽孢杆菌WX-02的感受态细胞中，涂布于Kan抗性平板上，37℃培养16-20小时，转化子用引物T2-F/R验证，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳进行检测。对正确的转化子进行单交换和双交换，从而得到WX-02Δepr。用同样的方法在WX-02Δepr的基础上，依次叠加敲除hag、mpr、vpr、aprX、bpr、wprA、aprE、amyL和bpr，最终获得缺失突变菌株地衣芽孢杆菌BL10。

上述地衣芽孢杆菌BL10在表达异源淀粉酶中的应用：BL10敲除了淀粉酶基因amyL，菌株中几乎无胞外残余淀粉酶活性，适于作为表达外源淀粉酶基因的工程宿主菌。

B.subtilis SCK6宿主菌是野生型宿主菌（市售/实验室保存）；枯草芽孢杆菌B.subtilis 168宿主菌是野生型宿主菌（市售/实验室保存）；枯草芽孢杆菌解淀粉芽孢杆菌B.amyloliquefaciens BAX-5宿主菌是以解淀粉芽孢杆菌HZ-12为出发菌株，依次敲除基因epr、nprE、aprE-a、aprX和mpr后得到的基因工程宿主菌（B.amyloliquefaciens BAX-5/和HZ-12已在《Efficient production of extracellular alkaline protease inBacillus amyloliquefaciens by host strain construction》文章中公开）。

实施例 4验证工程菌BL10/PT-17SP003amyA(LC)发酵的淀粉酶对烟草淀粉降解能力

1、制备烟草淀粉固体培养基

采用碱式提取法从烟叶中提取的烟草淀粉1 g/L，氯化钠5 g/L，酵母粉2 g/L，琼脂粉15 g/L，121℃高温高压灭菌20 min。

2、透明圈观察法

将待测菌株划线接种于四环素抗性的LB固体培养基上，37℃培养16 h。挑取单菌落，接种于四环素抗性的LB液体培养基中，37℃培养24 h。经10000 r/min高速离心10 min以及0.22 μm微滤膜过滤后，取上清液添加至已打孔(直径6 mm)的烟草淀粉筛选培养基上。37℃孵育12 h，滴加碘液，根据透明圈直径大小，判断该菌株对底物的降解能力。菌株BL10/PT-17SP003amyA(LC)上清发酵酶液在以烟草淀粉为底物的平板上显示巨大的透明圈，直径为32 mm(图6)，说明本申请菌株发酵得到的淀粉酶对烟草淀粉底物有很强的降解作用。

实施例5BL10/PT-17SP003amyA(LC)上清发酵酶液在烟叶发酵中的应用

按照实施例3的方法制备BL10/PT-17SP003amyA(LC)上清发酵酶液。

量取粗酶液20 mL，使用喷瓶将其均匀喷洒于50 g 2020重庆B4F烟叶表面，使其混合均匀，然后置于恒温恒湿(温度45℃，湿度75%)培养箱中处理，发酵48 h取样，每组3个平行。以2020重庆B4F烟叶接种与上清发酵酶液等体积的无菌水(20 mL)作为空白对照组。酶处理结束后，将烟叶置于80℃烘箱中20 min进行灭酶处理。然后置于40℃烘箱烘干2 h，测定水分。磨碎，过40目筛。采用YC/T 216-2013《烟草及烟草制品 淀粉的测定 连续流动法》中方法检测淀粉含量。采用YC/T 159-2019《烟草及烟草制品 水溶性糖的测定 连续流动法》检测烟丝中还原糖含量。

结果显示：

发酵结束后对照组烟叶中淀粉含量为6.13%，实验组烟叶中淀粉含量为4.82%，添加BL10/PT-17SP003amyA(LC)上清发酵酶液能够在48 h内降低1.31%的淀粉含量，降幅达到21.37%。淀粉含量的降低可有效降低烟草的焦糊味，从而改善烟草制品的品质。

发酵结束后空白对照组烟丝中还原糖含量为13.24%，实验组烟丝中还原糖含量为16.61%，还原糖含量在48 h增加了3.37%，增幅为25.45%。说明在淀粉酶的作用下，淀粉被水解成小分子还原糖，导致还原糖含量上升，因此能够明显改善烟草制品的品质。

另外一方面，取出灭酶处理后的烟丝，用切丝机切成烟丝，手工制作成卷烟，在平衡柜(温度22℃，湿度60%)中平衡48-72小时，根据国标GB5606.4-2005中的卷烟感官技术要求，经感官评吸后认为，BL10/PT-17SP003amyA(LC)上清发酵酶液处理后，烟气质量改善明显，刺激性和焦糊味减轻，烟气柔和，滞舌感减轻，烟气香气量更加丰富，品质显著提升。

以上所述，仅为本申请的实施例而已，本申请的保护范围并不受这些具体实施例的限制，而是由本申请的权利要求书来确定。对于本领域技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的技术思想和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (11)

1.一种高效表达淀粉酶基因的地衣芽孢杆菌工程菌，其特征在于，该工程菌是以地衣芽胞杆菌BL10为出发菌株，将含有淀粉酶基因的表达载体转入至所述的出发菌株中获得的。

2.根据权利要求1所述的工程菌，其特征在于，所述淀粉酶基因为以下任意一种：

（1）来源于蜡样芽孢杆菌WHC-17的amyS，核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示；

（2）来源于枯草芽孢杆菌WHC-84的amyE，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

（3）来源于枯草芽孢杆菌WHC-108的amyE，核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示；

（4）来源于枯草芽孢杆菌WHC-115的amyE，核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示；

（5）来源于贝莱斯芽孢杆菌WHC-117的amyE，核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示；

（6）来源于解淀粉芽孢杆菌MK10163的amyA(LC)，核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。

3. 根据权利要求2所述的工程菌，其特征在于，所述淀粉酶基因为来源于解淀粉芽孢杆菌MK10163的淀粉酶基因amyA(LC)，核苷酸序列如 SEQ ID NO. 1 所示。

4.根据权利要求1所述的工程菌，其特征在于，所述的含有淀粉酶基因的表达载体的信号肽为以下任意一种：

（1）SP001信号肽，核苷酸序列如 SEQ ID NO.9所示；

（2）SP002信号肽，核苷酸序列如 SEQ ID NO.10所示；

（3）SP003信号肽，核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。

5.根据权利要求4所述的工程菌，其特征在于，所述的含有淀粉酶基因的表达载体的信号肽为SP003信号肽，核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。

6.根据权利1所述的工程菌，其特征在于，地衣芽孢杆菌BL10是以地衣芽孢杆菌WX-02为出发菌，敲除基因hag、mpr、vpr、aprX、epr、bpr、wprA、aprE、amyL和bpr后构建的。

7.如权利要求1-6任一项中所述的工程菌在制备淀粉酶中的应用。

8.一种利用如权利要求1-6任一项中所述的工程菌制备获得的淀粉酶。

9.一种如权利要求1所述的工程菌的构建方法，其特征在于，包括：

通过PCR技术获得解淀粉芽孢杆菌MK10163中的淀粉酶基因amyA(LC)，通过同源重组技术将SP003信号肽核苷酸片段和amyA(LC)基因连接成的同源重组序列插入到PT-17质粒中，获得重组表达载体；将获得的重组表达载体转入出发菌株地衣芽孢杆菌BL10中，构建得到表达淀粉酶的地衣芽胞杆菌工程菌BL10/PT-17SP003amyA(LC)；

所述重组表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。

10.一种获得如权利要求8所述淀粉酶的方法，其特征在于，包括：

向发酵培养基中接种地衣芽胞杆菌工程菌进行发酵，离心获得上清液，水相膜过滤，获得所述淀粉酶的粗酶液。

11.如权利要求1所述的地衣芽胞杆菌工程菌和/或权利要求8所述的淀粉酶在烟叶发酵中的应用，其特征在于，将所述地衣芽胞杆菌工程菌的发酵上清过滤液喷洒在烟草制品表面进行发酵。