CN117701476A - 一株对病原真菌具有拮抗作用的贝莱斯芽孢杆菌及其应用 - Google Patents
一株对病原真菌具有拮抗作用的贝莱斯芽孢杆菌及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一株对病原真菌具有拮抗作用的贝莱斯芽孢杆菌及其应用。贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）f‑20保藏号为GDMCC NO.62716；其对植物病原细菌柑橘黄单胞杆菌、燕麦食酸菌西瓜亚种和青枯劳尔氏菌，以及植物病原真菌腐皮镰刀菌、拟茎点霉、尖孢镰刀菌、立枯丝核菌、盘长孢状刺盘孢和藤仓镰孢菌有明显的抑制作用；其含有常见的脂肽类活性物质和聚酮类化合物的基因簇，以及新环脂肽抗生素罗克霉素locillomycin的基因簇。贝莱斯芽孢杆菌f‑20广谱抑菌能力强，具有分泌多种次生抗菌代谢产物的潜力，在农业病害生物防治中具有极高的利用价值。
Description
技术领域
本发明属于植物保护及微生物农药技术领域，具体涉及一株对病原真菌具有拮抗作用的贝莱斯芽孢杆菌及其应用。
背景技术
生物防治因靶标明确、无污染、不易产生抗药性等特点，符合现代农业绿色生产需求。而芽孢杆菌属因广普高效、容易培养、耐逆境、耐储藏等特点是生物防治中最常用的菌株之一。有研究表明，芽孢杆菌不仅具有促进植物生长、防御病虫害、调节土壤微生态、改善、缓解化学肥料和农药造成的土壤板结、重金属富集现象等优点，还可替代化学农药进行病害的防治，从而减少农药残留造成的生态环境破坏。因此，芽孢杆菌在农业生产中具有极高的开发利用价值。
贝莱斯芽孢杆菌是芽孢杆菌属的一个新种，在促进植物生长、抗病虫害和诱导系统抗病性等方面表现突出。如专利CN116836877A公开的一株贝莱斯芽孢杆菌KZ，可用来防治禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）、假禾谷镰刀菌(Fusarium pseudograminearum)、黑曲霉（Aspergillus niger）、拟轮枝镰孢菌（Fusarium verticillioides）、尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种（Fusarium oxysporum f . sp .cubense4，Foc）和齐整小核菌(Sclerotium rolfsii)引起的植物真菌性病害；专利CN115851534A公开的一株贝莱斯芽孢杆菌可防治烟草黑胫病、根腐病、青枯病、赤星病、炭疽病和线虫危害；专利CN115873770 A公开的一株贝莱斯芽孢杆菌BF017002对番茄灰霉病的抑制率86.90%，但对黄瓜靶斑病的抑制率仅为67.03%。可见，贝莱斯芽孢杆菌不同菌株形态和功能不尽相同，产生的次生代谢产物及防治作物病害的种类、效果可能存在差异，其抗菌能力和抗菌作用没有预见性和启示性，而且有些贝莱斯芽孢杆菌功能单一、仅对细菌或真菌病原菌有抑菌/抗菌作用，产生的抑菌/抗菌活性的次生代谢产物也有限，在生产实际中往往存在应用效果不稳定、应用范围狭窄等缺陷。因此，还需筛选更多抗菌/抑菌能力强、抑菌/抗菌广谱、产丰富的次生代谢产物的贝莱斯芽孢杆菌菌种资源。
发明内容
针对现有技术存在的缺陷，本发明公开了一株对病原真菌具有拮抗作用的贝莱斯芽孢杆菌及其应用。
本发明的第一个目的是提供一株贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）f-20，其保藏号为GDMCC NO.62716。
贝莱斯芽孢杆菌f-20分离自番茄叶片患病组织中，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC NO.62716。贝莱斯芽孢杆菌f-20的16SrRNA基因序列如SEQ ID NO.1所示。基于16SrRNA基因的系统发育树，该菌株与暹罗芽孢杆菌（Bacillus siamensis）序列同源性最高，但gyrB基因序列（SEQ ID NO.2）与贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）序列相同，故将菌株f-20命名为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）f-20。
所述贝莱斯芽孢杆菌f-20在营养肉汤固体培养基上生长快速，菌落凸起、呈白色、表明褶皱干燥、不产黏液、不透明、菌落不整齐；革兰氏染色阳性，内生芽孢，显微镜下菌体呈长椭圆型。硝酸反应和明胶反应阳性，可水解α-葡萄糖苷酶，可产碱性磷酸盐酶、酯酶、类脂肪酶和苯酚-AS-BI-磷酸水解酶。
通过次级代谢产物基因簇分析，贝莱斯芽孢杆菌f-20含有3种通过非核糖体合成酶（NRPS）合成的脂肽类活性物质基因簇（丰原素fengycin、表面活性素surfactin和铁载体bacillibactin）和4种通过聚酮合成酶（transAT-PKS）合成的聚酮类化合物基因簇（大环素内酯H macrolactin H、杆菌素bacillaene、地非西丁difficidin和丁苷菌素A/BButirosin A/B）。
贝莱斯芽孢杆菌f-20还含有合成新环脂肽抗生素罗克霉素locillomycin的基因簇。
本发明的第二个目的是提供上述的贝莱斯芽孢杆菌f-20在防治植物细菌性病害和植物真菌性病害中的应用。
优选地，所述真菌为腐皮镰刀菌Fusarium solani、拟茎点霉Phomopsis sp.、尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum、立枯丝核菌Rhizoctonia solani、盘长孢状刺盘孢Colletotrichum gloeosporioides和藤仓镰孢菌Fusarium fujikuroi中的一种或多种。
优选地，所述细菌为柑橘黄单胞杆菌Xanthomonas citri subsp. citri,Xcc、燕麦食酸菌西瓜亚种Acidovorax avenae subsp. Citrulli和青枯劳尔氏菌Ralstonia solanacearum中的一种或多种。
优选地，所述贝莱斯芽孢杆菌f-20含有合成新环脂肽抗生素罗克霉素locillomycin的基因簇。
本发明的第三个目的是提供一种生防菌剂，其含上述的贝莱斯芽孢杆菌f-20、其培养物、其培养物分离的上清液、其代谢物和其发酵物中的一种或多种。
本发明的第四个目的是提供上述的贝莱斯芽孢杆菌f-20或上述的生防菌剂在制备预防或治疗植物病原菌性病害产品中的应用。
本发明的第五个目的是提供一种植物病害的防治方法，是用上述的贝莱斯芽孢杆菌f-20或上述的生防菌剂处理植物植株。
优选地，所述处理为将含上述的贝莱斯芽孢杆菌f-20的试剂或上述的生防菌剂喷施在植物叶片。
优选地，所述贝莱斯芽孢杆菌f-20为OD600=2.0。
优选地，所述植物病害为哈密瓜细菌性果斑病。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明成功分离获得一株对多种植物病原细菌和病原真菌有双重拮抗作用的芽孢杆菌，经鉴定为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis），并命名为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）f-20。
抑菌实验结果表明，该菌株菌体和/或发酵液对多种植物病原细菌（如：柑橘黄单胞杆菌Xanthomonas citri subsp. citri,Xcc、燕麦食酸菌西瓜亚种Acidovorax avenae subsp. Citrulli和青枯劳尔氏菌Ralstonia solanacearum）有明显的抑制作用，同时对多种植物病原真菌（如：腐皮镰刀菌Fusarium solani、拟茎点霉Phomopsis sp.、尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum、立枯丝核菌Rhizoctonia solani、盘长孢状刺盘孢Colletotrichum gloeosporioides）和藤仓镰孢菌Fusarium fujikuroi）也有明显的抑制作用。
经次级代谢产物基因簇分析发现，该菌株不仅包括贝莱斯芽孢杆菌常见的脂肽类活性物质和聚酮类化合物的基因簇，还包括新环脂肽抗生素罗克霉素locillomycin的基因簇。表明本发明所述菌株广谱抑菌能力强，具有分泌多种次生抗菌代谢产物的潜力，在农作物病害生物防治中具有极高的利用价值。
贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）f-20于2022 年8 月19 日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC），地址为：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，保藏编号为GDMCC NO.62716。
附图说明
图1为本发明实施例中的贝莱斯芽孢杆菌f-20在平板上的菌落形态图。
图2为本发明实施例中的贝莱斯芽孢杆菌f-20结晶紫染色后的菌体形态图。
图3为本发明实施例中的贝莱斯芽孢杆菌f-20对多种植物病原真菌的抑制作用效果图。
图4为本发明实施例中的贝莱斯芽孢杆菌f-20对多种植物病原细菌的抑制作用效果图。
图5为贝莱斯芽孢杆菌f-20对哈密瓜细菌性果斑病的治疗效果图。
图6为贝莱斯芽孢杆菌f-20基于看家基因的进化树。
具体实施方式
为了便于本领域技术人员的理解，下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不是对本发明的限制，仅作示例说明。
实施例1：贝莱斯芽孢杆菌f-20的分离、鉴定和保藏
贝莱斯芽孢杆菌f-20菌株的分离：贝莱斯芽孢杆菌f-20菌株分离自番茄叶片叶斑病发病严重的组织中。具体分离步骤如下：称取5 g患病叶片组织，将其剪碎后放入灭菌后的研钵中，加入3 mL无菌水，用研磨棒将叶片组织捣碎，取1 mL汁液样品于9 mL无菌水中，用漩涡震荡仪震荡3 min，用无菌水依次稀释样品为10-2-10-5，吸取不同浓度的样品100 μL，分别涂布于NA培养基（配方：10 g/L蛋白胨、3 g/L牛肉浸粉、5 g/L氯化钠、15 g/L琼脂粉，配制方法：取33 g上述培养基成分，加入1000 mL去离子水，加热搅拌至完全溶解，调节溶液pH为7.2，分装于三角瓶中，121℃高压灭菌15 min，完成后倒入一次性培养皿中备用）上，每个浓度梯度重复3次，置于30℃培养箱倒置避光培养观察，培养1~3天左右，挑取形态、颜色不同的单菌落划线进行纯化，纯化2~3次，获得纯的菌株。
贝莱斯芽孢杆菌f-20菌株的鉴定：根据菌落形态、菌体颜色、透明度、光泽度等对菌株进行表观鉴定。如图1所示，贝莱斯芽孢杆菌f-20在NA固体培养基上生长快速，菌落凸起、呈白色、表明褶皱干燥、不产黏液、不透明、菌落不整齐；革兰氏染色阳性，内生芽孢，显微镜下菌体呈长椭圆型（图2）。硝酸反应和明胶反应阳性，可水解α-葡萄糖苷酶，可产碱性磷酸盐酶、酯酶、类脂肪酶和苯酚-AS-BI-磷酸水解酶。基于16SrRNA（SEQ ID NO.1）基因的系统发育树，该菌株与暹罗芽孢杆菌（Bacillus siamensis）序列同源性最高，但gyrB基因序列（SEQ ID NO.2）与贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis)序列相同，看家基因进化树如图6所示，故将菌株f-20命名为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）f-20。
看家基因建树方法：通过与本地数据库对比，基于31个看家基因（dnaG, frr,infC, nusA, pgk, pyrG, rplA, rplB,rplC, rplD, rplE, rplF, rplK, rplL, rplM,rplN, rplP, rplS, rplT, rpmA, rpoB, rpsB, rpsC,rpsE, rpsI, rpsJ, rpsK, rpsM,rpsS, smpB, tsf）选择在种属水平上最接近的19株菌，通过MEGA 6.0软件选择NJ（Neighbor-Joining）法构建系统进化树。31个看家基因号如表1。
表1
；
。
贝莱斯芽孢杆菌f-20菌株的保藏：挑取鉴定过的单菌落转接于相应的试管斜面上，4℃冰箱保存备用。同时用50%的甘油蒸馏水溶液将菌体制成菌悬液，-80℃超低温冰箱冻存。
贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）f-20，于 2022年8 月19 日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC），地址为：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，保藏编号为GDMCC NO.62716。
实施例2：贝莱斯芽孢杆菌f-20对致病真菌的抑制作用
菌株活化培养：将病原菌腐皮镰刀菌（Fusarium solani）、拟茎点霉（Phomopsis sp.）、尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）、立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）、盘长孢状刺盘孢（Colletotrichum gloeosporioides）和藤仓镰孢菌（Fusarium fujikuroi）等菌株分别接种至PDA培养基（配方：300 g/L马铃薯提取浸出粉、20 g/L葡萄糖、15 g/L琼脂粉、0.1g/L氯霉素，配制方法同NA培养基）平板上活化，待菌丝长满平板后用灭菌的打孔器从菌落外边缘均匀的打成直径为8 mm的圆形菌饼备用。贝莱斯芽孢杆菌f-20划线接种至NA培养基（培养基配制方法同实施例1）平板上活化培养24 h后备用。
抑制作用评估：将活化好的病原菌菌饼分别接种于PDA培养基平板中心处，距离平板中心点25 mm处的4个点分别接种活化好的贝莱斯芽孢杆菌f-20菌体，以不接种贝莱斯芽孢杆菌f-20为对照，3次重复，置于28℃恒温培养箱中避光培养。腐皮镰刀菌培养2 d、尖孢镰刀菌培养3 d、拟茎点霉培养5 d、盘长孢状刺盘孢和藤仓镰孢菌培养7 d。培养完成后拍照记录平板上的病原菌生长情况。（立枯丝核菌的接种方法：将活化好的立枯丝核菌接种至距PDA培养基平板边缘25 mm处，在其对向约50 mm处接种活化好的贝莱斯芽孢杆菌f-20菌体，以不接种贝莱斯芽孢杆菌f-20菌体为对照，4次重复，置于28℃恒温培养箱中避光培养7d。培养完成后拍照记录平板上的病原菌生长情况。）
抑菌率测定：将活化好的病原菌菌饼分别接种至距PDA培养基平板边缘25 mm处，在其对向约50 mm处接种活化好的贝莱斯芽孢杆菌f-20菌体，以不接种贝莱斯芽孢杆菌f-20为对照，4次重复，置于28℃恒温培养箱中避光培养。7 d后测量菌饼边缘至贝莱斯芽孢杆菌f-20中心之间病原真菌的生长半径，记作处理组生长半径；对照组中病原真菌的生长半径，记作对照组生长半径。最后，依据下面公式，计算抑菌率。
抑制率（%）=（对照生长半径-处理生长半径）/对照生长半径×100%。
结果表明：由图3可知，贝莱斯芽孢杆菌f-20对腐皮镰刀菌、拟茎点霉、尖孢镰刀菌、立枯丝核菌、盘长孢状刺盘孢和藤仓镰孢菌均有明显的抑制作用，但抑制程度存在差异，其中对拟茎点霉的抑制作用最为明显，抑菌率达93.75%，其次为盘长孢状刺盘孢，抑菌率超过80%，对尖孢镰刀菌、立枯丝核菌和藤仓镰孢菌的抑菌率在50%以上，对腐皮镰刀菌的抑菌率在38.75%，相对较低，这可能与腐皮镰刀菌的生长速度快有关（表2）。
表2 贝莱斯芽孢杆菌f-20对病原真菌的抑制情况
实施例3：贝莱斯芽孢杆菌f-20对致病细菌的抑制作用
菌株活化培养：将柑橘黄单胞杆菌（Xanthomonas citri subsp. citri,Xcc）、燕麦食酸菌西瓜亚种（Acidovorax avenae subsp. Citrulli）、青枯劳尔氏菌（Ralstonia solanacearum）、贝莱斯芽孢杆菌f-20分别接种至NA平板上进行活化，用NB（不含琼脂粉的NA培养基）30℃，180 r﹒min-1发酵培养36 h。
病原菌稀释菌液及贝莱斯芽孢杆菌f-20发酵液制备：分别将病原菌柑橘黄单胞杆菌（Xanthomonas citri subsp. citri,Xcc）、燕麦食酸菌西瓜亚种（Acidovorax avenae subsp. Citrulli）、青枯劳尔氏菌（Ralstonia solanacearum）菌液稀释为OD600=1.0的母液，然后稀释成10-3备用；贝莱斯芽孢杆菌f-20发酵液制备方法为：挑取贝莱斯芽孢杆菌f-20单菌落，接种到NB液体培养基（去掉琼脂粉的NA培养基）中，30℃，180 r﹒min-1培养36 h后10000 r﹒min-1离心10 min，取上清液过0.22 μm微孔滤膜除菌2次，即得贝莱斯芽孢杆菌f-20发酵液。
菌体抑菌评估：取100 μL病原菌稀释菌液均匀涂布于NA固体培养基上，距离平板中心点25 mm处的4个点分别接种活化好的贝莱斯芽孢杆菌f-20菌体，置于30℃培养1~3 d，观察有无抑菌圈，测定抑菌直径并拍照记录结果。
贝莱斯芽孢杆菌f-20发酵液抑菌评估：取100 μL病原菌稀释菌液均匀涂布于NA固体培养基上，用蓝色枪头（1000 uL）在平板上打孔，然后取30 μL贝莱斯芽孢杆菌f-20发酵液于孔中，30℃避光培养1~3 d，观察记录抑菌圈大小，并拍照记录结果。
结果统计：由图4可知，贝莱斯芽孢杆菌f-20菌体对柑橘黄单胞杆菌、燕麦食酸菌西瓜亚种和青枯劳尔氏菌均表现出良好的抑制效果，在每个抑菌平板上均形成了明显的抑菌圈；贝莱斯芽孢杆菌f-20发酵液对柑橘黄单胞杆菌、燕麦食酸菌西瓜亚种和青枯劳尔氏菌也表现出良好的抑制效果。测定抑菌直径（表3），贝莱斯芽孢杆菌f-20对三种病原菌的抑菌直径均超过20 mm。
表3 贝莱斯芽孢杆菌f-20对病原细菌的抑制情况
实施例4：贝莱斯芽孢杆菌f-20次级代谢产物合成分析
贝莱斯芽孢杆菌f-20在NB液体培养基中（30℃ 200 r/min）培养12 h后，10000 r﹒min-1、10 min离心收集菌体，提取基因组总DNA，DNA纯度检测合格后，委托上海美吉生物医药科技有限公司进行测序。测序结果通过antiSMASH软件进行次级代谢产物合成基因簇分析。
结果表明：由表4可知，通过antiSMASH软件，贝莱斯芽孢杆菌f-20基因组中共包含14个次生代谢产物合成相关的基因簇，其中包括3种通过非核糖体合成酶（NRPS）合成的脂肽类活性物质基因簇（丰原素fengycin、表面活性素surfactin和铁载体bacillibactin）和4种通过聚酮合成酶（transAT-PKS）合成的聚酮类化合物基因簇（大环素内酯 Hmacrolactin H、杆菌素bacillaene、地非西丁difficidin和丁苷菌素 A/B Butirosin A/B）。此外还包括新环脂肽抗生素罗克霉素locillomycin合成基因簇以及一些未知功能的化合物。
表4 贝莱斯芽孢杆菌f-20的次生代谢产物合成区域鉴定结果
实施例5：贝莱斯芽孢杆菌f-20在治疗哈密瓜细菌性果斑病中的应用
燕麦食酸菌西瓜亚种病原菌和贝莱斯芽孢杆菌f-20菌悬液的制备：将燕麦食酸菌西瓜亚种病（Acidovorax avenae subsp. Citrulli）原菌接种于R2A液体培养基中，贝莱斯芽孢杆菌f-20接种于NB液体培养基中，置于30℃，200 r﹒min-1摇床中培养16 h后8000 r﹒min-1离心10 min，弃去上清液，将菌体用无菌水重悬至OD600=2.0备用。R2A液体培养基配方：酵母浸出粉0.5 g/L、蛋白胨0.5 g/L 、酪蛋白水解物0.5 g/L、葡萄糖0.5 g/L、可溶性淀粉0.5 g/L、磷酸二氢钾0.3 g/L、无水硫酸镁0.024 g/L、丙酮酸钠0.3 g/L。配制方法：取3.124 g上述培养基成分，加入1000 mL去离子水，加热搅拌至完全溶解，调节溶液pH为7.2，分装于三角瓶中，121℃高压灭菌15 min，完成后备用。
盆栽接菌试验：盆栽试验在温室大棚内进行，哈密瓜苗生长到3叶一心时移栽至装有120 g/盆栽培基质的花盆中，花盆直径大小为11 cm，高9 cm，移栽后每盆浇水100 mL，以后每天浇水30 mL。待哈密瓜苗成活后（大约3 d）接种燕麦食酸菌西瓜亚种病原菌和贝莱斯芽孢杆菌f-20菌悬液。接种方法是将等体积的菌悬液装入喷壶中，然后均匀喷施在哈密瓜叶片的正面和背面，以水滴铺满叶表面不滴落为宜。接菌后继续放入温室大棚培养，培养方法同哈密瓜正常栽培管理方法进行，培养一周后统计哈密瓜叶片的发病情况。具体试验处理如表5，每个处理设置5个重复。
表5 盆栽试验处理情况
哈密瓜细菌性果斑病的分级：0级 无病斑；1级 病斑占整片叶子的5%以下；3级 病斑占整片叶子的5%~25%；5级 病斑占整片叶子的26%~50%；7级 病斑占整片叶子的51%~75%；9级 病斑占整片叶子的76%~100%。
发病率=发病株数/调查总株数×100%；病情指数=[Σ（各级病叶数×各级代表值）]/（调查总叶数×最高级数）×100%；相对治疗效果=（T1病情指数-T2病情指数）/T1病情指数×100%。
结果表明，由表6和图5可知，与不接种病原菌处理（CK、T3）相比，接种病原菌后哈密瓜叶片发病率达到100%，但接种病原菌24h后再接种贝莱斯芽孢杆菌f-20菌悬液（T2），哈密瓜叶片的病情指数则显著低于接种无菌水处理（T1），统计其治疗效果能达到50.85%，说明使用贝莱斯芽孢杆菌f-20菌悬液能较好的治疗哈密瓜细菌性果斑病。
表6 贝莱斯芽孢杆菌f-20对哈密瓜细菌性果斑病的治疗效果
SEQ ID NO.1（贝莱斯芽孢杆菌f-20的16SrRNA基因序列）
CTATACATGCAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAGACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTATGGAGCCAGCCGCCGAAG
SEQ ID NO.2（贝莱斯芽孢杆菌f-20的gyrB基因序列）
TTTAGAAGACAGTCCGCCAGTTTGCCCGGCAGATTGGAAATCTCAAGCGCACTTTTGCGCCGGGTCAATTCCCGGGCTTTTTTCGCCGCCATCCGCGCTCTTGCGGCCATTAAACCTTTTTCAACGATTTTGCGGGCTGAGTCCGGATTTTCAAGAAGGAATGTTTCCAGCGCAGAAGAAAACAGCGTATCAGTGATCGTTCTCGCTTCGGAGTTGCCGAGCTTGGTTTTCGTCTGCCCTTCGAATTGCGGATCAGGGTGCTTAATTGAAATAATGGCAGTCAGCCCTTCTCTCACATCATCCCCGCTTAAATTCGGATCATTTTCTTTGAAAATCCCTTTTCTTCTTGCATAGTCGTTTATGACACGGGTCAGACCGGTTTTAAATCCGGCCTCGTGCGTGCCGCCTTCGTATGTGTTGATATTATTTGTGAAAGAATAAATATTGCTTGTATAGCTGTCGTTGTATTGCAATGCAACTTCAACCGTTATGCCGTCTTTCTCGCCTTCGATATAAATCGGCTCTTCATGAACGACTTCTTTGGAACGGTTTAAGTACTCAACATAGCTTTTGATTCCGCCTTCGTAGTGGTACTCGTTTTTCCGTTCTTGTCCTTCACGTTTGTCTTCAATCGTGATGTTTACGCCTTTTGTCAGGAAGGCCAATTCCCGGACACGGTTTGAAAGCAGATCATAGTCATATACGGTTGTTTCTTTGAAAATTTCCGGATCCGGAACGAAGTGCGTAATCGTTCCGGTCTTATCAGTTTCGCCGATCACTTCAAGATCAGCCACAGGTACACCGCGCTCGTACGCCTGATAGTGGATTTTCCCGTCACGATGAACCGTAACGTCAAGAGTGGTCGACAAGGCGTTTACGACGGACGCCCCTACACCGTGAAGACCGCCGGATACTTTATATCCGCTTCCGTCAAATTTACCGCCGGCGTGGAGAACGGTCATGATGACTCAC
Claims (10)
1.一株贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）f-20，其特征在于，保藏号为GDMCCNO.62716。
2.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌f-20在防治植物细菌性病害和植物真菌性病害中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述真菌为腐皮镰刀菌Fusarium solani、拟茎点霉Phomopsis sp.、尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum、立枯丝核菌Rhizoctonia solani、盘长孢状刺盘孢Colletotrichum gloeosporioides和藤仓镰孢菌Fusarium fujikuroi中的一种或多种。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述细菌为柑橘黄单胞杆菌Xanthomonas citri subsp. citri,Xcc、燕麦食酸菌西瓜亚种Acidovorax avenae subsp. Citrulli和青枯劳尔氏菌Ralstonia solanacearum中的一种或多种。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述贝莱斯芽孢杆菌f-20含有合成新环脂肽抗生素罗克霉素locillomycin的基因簇。
6.一种生防菌剂，其特征在于，含权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌f-20、其培养物、其培养物分离的上清液、其代谢物和其发酵物中的一种或多种。
7.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌f-20或权利要求6所述的生防菌剂在制备预防或治疗植物病原菌性病害产品中的应用。
8.一种植物病害的防治方法，其特征在于，用权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌f-20或权利要求6所述的生防菌剂处理植物植株。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述处理为将含权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌f-20的试剂或权利要求6所述的生防菌剂喷施在植物叶片，所述贝莱斯芽孢杆菌f-20为OD600=2.0。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述植物病害为哈密瓜细菌性果斑病。
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