CN117701458A - 适用于榨广椒发酵的复合菌剂及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物食品发酵技术领域，本发明涉及微生物食品发酵技术领域，具体涉及适用于榨广椒发酵的复合菌剂及应用。将这五种菌的发酵液按0.01%～0.1%（w/w）比例添加到榨广椒中，可明显提高榨广椒成品中的总酸含量，包括乳酸，乙酸，丙酸等，并能提高总酯含量，包括乙酸乙酯、己酸乙酯等，同时能缩短发酵时间得到品质更加稳定的产品。

Description

适用于榨广椒发酵的复合菌剂及应用

技术领域

本发明涉及微生物食品发酵技术领域，具体涉及适用于榨广椒发酵的复合菌剂及应用。

背景技术

榨广椒也称为鲊广椒，鲊尖椒，鲊金椒，酸面，面果子，是一种传统的发酵食品。

传统的榨广椒生产没有接种任何菌株，这也是传统发酵食品的一大弊端。榨广椒目前还是一种天然发酵的传统发酵食品，生产方式主要是人力手工制作，它的生产品和周期受到季节变化的强烈影响；并且由于榨广椒是自发发酵而成，榨广椒食品生产厂很难确保不同季节不同批次的产品品质完全一致。又因其发酵过程研究不够透彻，需要大量的人力投入按照当地传统的生产习惯进行人工制作，难以进行大规模的机械化生产。这样的生产模式，既不利于稳定榨广椒的品质，难以扩大榨广椒的生产规模，更不利于榨广椒在全国范围的广泛推广，我们迫切的需要解决这些问题。

菌株接种在发酵食品品质优化方面的应用科研工作者已经做了一些研究，接种菌株具有缩短发酵时间，增加产物风味，提高产品营养价值，减少原材料中的有害成分，保证食品安全性等优点。例如，曾宇伦等从白酒酒醅中分离得到了多株酵母菌，将它们再添加会白酒酒醅中进行发酵，提高白酒产品中总酯的含量。雷雨恬等的研究表明，在发酵麦麸中添加乳酸菌株可以显著提高最终产品的营养价值，并且提高产品的益生价值。

上述研究表明，从发酵环境中分离得到功能微生物，经过筛选培养再应用到发酵体系中，可以改善发酵产品的品质，为产物带来更大的价值。然而，每种菌株的功能都是单一或有限的，菌株之间也存在依赖或是协作等关系，为了能够使功能微生物稳定的发挥作用，构建合成微生物群落再进行接种发酵是一个可行的方法。

针对目前榨广椒发酵，大部分为自然发酵，产品性质不稳定的情况，申请人提供了复合菌剂可以缩短发酵总进程，并产生大量生长代谢物，包括酯类、醇类、有机酸等等，这些物质的增加可以明显提高榨广椒的品质。

发明内容

本发明的目的在于提供了适用于榨广椒发酵的复合菌剂，所述的复合菌剂中的菌株，由库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)Pichi-1，光滑假丝酵母(Candidaglabrata)Can-1，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Sac-1，副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei NJ)LAB-1和融合魏斯氏菌(Weissella confusa)Wess-1组成。

本发明的另一个目的在于提供了上述复合菌剂在制备榨广椒中的应用。

为了实现上述目的，本发明采取以下技术措施：

申请人利用三代高通量测序技术，对榨广椒发酵全过程的微生物群落相对丰度的变化做了充分的研究，榨广椒的发酵存在丰富的微生物菌群，申请人最终从这些菌群中，进行了有效菌种选择，最终确定了五株发酵菌株：库德里阿兹威毕赤酵母(Pichiakudriavzevii)Pichi-1，光滑假丝酵母(Candida glabrata)Can-1，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Sac-1，副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei NJ)LAB-1和融合魏斯氏菌(Weissella confusa)Wess-1。

本发明的保护内容包括：

一种适用于榨广椒发酵的复合菌剂，所述的复合菌剂中的菌株，由库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)Pichi-1，光滑假丝酵母(Candida glabrata)Can-1，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Sac-1，副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei NJ)LAB-1和融合魏斯氏菌(Weissella confusa)Wess-1组成。

以上所述的复合菌剂，其菌株的有效菌浓度为：1～2：1～2：1～2：1～2：1～2。

上述的复合菌剂，在发酵制备榨广椒中的应用。

以上所述的应用，优选的，是将玉米面和辣椒以质量比为8～4：6～2的比例混匀，按每500g接种1-10ml菌液(菌液的有效菌浓度是6亿cfu/ml)比例接种，厌氧发酵28-32天，即得。

以上所述的应用，优选的，菌液的接种量是5ml；玉米面和辣酱的质量比为6:4；厌氧发酵30天。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明提供的接种合成微生物群落的发酵工艺，这是生产方式和传统的自然发酵法相比优点在于：

1.在相同的发酵时间内(30day)，接种合成微生物群落的实验组比对照组产生的风味物质跟多。代表性的酯乳酸乙酯和乙酸乙酯产量提高8％，其它高级醇沉香醇、橙花醇、香叶醇的产量均提高10％以上。

2.降低不利的化合物的产量，例如己酸和丁酸等化合物具有难闻的气味，接种了合成微生物群落的实验组在发酵终点的这两种酸度含量仅为对照组的50％。

3.缩短发酵时间，实验组的多种风味物质含量，例如乳酸、乙酸、乙酸乙酯、沉香醇和橙花醇等都在30day达到最高值，而对照组则在45day，说明接种合成微生物群落的实验组需要的发酵周期更短。

4.虽然不接种菌的自然发酵组，在30d时物种甚至更加丰富，然而丰度的物种组成并不能产生更多的代谢产物，表明接种本发明提供的关键的与风味产生相关的微生物菌株更有价值。

附图说明

图1为核心微生物群落分析确定图。

图2菌落照片和菌体显微照片。

图3为实施例3中的单菌发酵过程中的理化因子变化示意图。

图4为实施例3中合成微生物群落接种发酵过程的理化因子变化示意图。

图5为发酵30天时CK1组和Lpscw组的物种alpha多样性图。

具体实施方式

本发明实施例中实验方法及条件如无特别说明，均为常规方法，所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。

实施例1：

榨广椒发酵的菌群分析及菌种的选择：

申请人利用三代高通量测序技术，对榨广椒发酵全过程的微生物群落相对丰度的变化做了充分的研究，榨广椒的发酵存在丰富的微生物菌群，申请人最终从这些菌群中，进行了有效菌种选择，如图1所示。利用主要微生物群落和多种风味物质的相关性分析，微生物网络结过寻找和风味产生有关的微生物。最终确定了五株发酵菌株：

库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)Pichi-1(CCTCC M2021172)：以下简称为Pichi-1；

一株光滑假丝酵母(Candida glabrata)Can-1(安琪酵母)：以下简称为Can-1；

一种酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Sac-1(潘丽娜，黄酒糟固态发酵生产酵母培养物的研究)：以下简称为Sac-1；

一种副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei NJ)LAB-1(蔡玉缘，副干酪乳杆菌NJ利用菊芋粉同步糖化发酵生产乳酸的研究)：以下简称为LAB-1；

一种融合魏斯氏菌(Weissella confusa)Wess-1(北纳创联生物BNCC195013)：以下简称为Wess-1。

将这些菌株按照有效菌浓度比为1：1：1：1：1进行混合，最终制得本发明的适用于榨广椒发酵的复合菌剂(五株菌的菌株形态如图2所示)。

实施例2：

实施例1中选择的五株发酵菌株的生理生化性质的测定：

库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)、光滑假丝酵母(Candidaglabrata)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)使用YPD培养基活化培养，副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei NJ)和融合魏斯氏菌使用MRS培养基活化培养。并利用16SrDNA测序技术鉴定这五株菌，以确保菌株没有被污染，活化好的菌株，用于以下实施例。

MRS培养基：蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母浸粉5.0g，柠檬酸氢二铵2.0g，葡萄糖5.0g，吐温80 1.0mL，乙酸钠(CH₃COONa·3H₂O)5.0g，磷酸氢二钾(K₂HPO₄·3H₂O)2.0gMgSO₄·7H₂O 0.2g，MnSO₄·H₂O 0.05g，pH＝6.5-6.8。

YPD培养基的配方(1L)：胰蛋白胨20g，酵母抽提物10g，葡萄糖20g，pH自然；固体培养基再加琼脂15g。

1)五株菌的生长曲线和稳定期活菌数：

在静置培养的条件下，酵母菌在30℃，乳酸菌和魏氏菌在37℃下，分别测定五株菌株的生长曲线。并通过平板涂布计数法，得到了五株菌株达到稳定期的活菌数，结果如表1所示。

表1菌株到达稳定期的时间和活菌数

2)五株菌的最适生长温度测定：

将供试菌株按照2％接种量，接种于150ml灭菌的YPD/MRS液体培养基中静置培养，以不接种试管作空白对照，设置25℃、30℃、37℃、40℃、45℃、50℃培养24h，测定OD600值，真菌以30℃OD600值为100％计算相对菌体浓度，细菌37℃OD600值为100％计算相对菌体浓度得到菌株的最适生长温度。菌株最适生长温度为30-37℃，但在25℃和45℃大多数菌株仍有30％以上的菌数，表现了这些菌株良好的温度耐受能力。

真菌存活率(％)＝不同培养温度下的OD600值/30℃培养温度下的OD600值

细菌存活率(％)＝不同培养温度下的OD600值/37℃培养温度下的OD600值

表1菌株在不同温度下的生长情况

3)菌株最适生长pH值测定：

将供试菌株按照2％接种量，接种于150ml灭菌YPD/MRS液体培养基中静置培养，将培养基的pH值用盐酸分别调节至0％(对照组)、2％(体积比，其余同)、5％、8％、9％、10％、12％、16％，，真菌在30℃培养24h，细菌37℃下培养12h，测定OD600值，作为依据分析比较每组生长情况，得到菌株的pH耐受情况如下：

存活率(％)＝在培养基不同pH下培养后的OD600值/培养基pH为6.7下培养后的OD600值。

表2菌株在不同pH值下的生长情况

4)菌株耐受耐盐性质测定：

将供试菌株按照2％接种量，接种于150ml灭菌YPD/MRS培养基中静置培养，使用NaCl将培养基调至成：0％(对照组)、2％(质量比，其余同)、4％、6％、8％、10％、12％、14％，真菌在30℃培养24h，细菌37℃下培养12h，测定OD600值，作为依据比较每组生长情况，得到菌株的酸耐受情况如表3。这些菌株在NaCl浓度0％～4％的范围内都表现出较好的生长性能，说明这些菌株对NaCl有一定的耐受性。

存活率(％)＝在培养基不同NaCl浓度下培养后的OD600值/培养基NaCl浓度为0条件下下培养后的OD600值。

表3菌株在NaCl浓度下的生长情况

实施例3：

适用于榨广椒发酵的复合菌剂在制备榨广椒中的应用：

榨广椒的发酵方法为：将干辣椒泡发，再与玉米以4：6的比例混匀，充分搅拌均匀。接种组按每500g样本接种5ml菌液的比例进行接种(菌液的有效菌浓度是6亿cfu/ml)，若是混合菌液，则混合菌液中各菌有效菌浓度相同。对照组不接种菌液。最后将玉米辣椒混合物装入厌氧呼吸袋中进行发酵实验，每份500g。发酵全程在28℃的恒温培养箱中培养。

上述发酵全程在28℃的恒温培养箱中培养。

本实施例分为以下几组：

1)CK1组(无接种)：不额外添加混合菌液的玉米面和辣酱；

2)Lw组(LAB-1和Wess-1)：LAB-1和Wess-1的有效菌浓度混合比例是1：1；

3)Scp组(Sac-1，Can-1和Pichi-1)：有效菌浓度混合比例是1：1：1；

4)Lpw组(LAB-1，Pichi-1和Wess-1)：有效菌浓度混合比例是1：1：1；

5)Pscw组(Wess-1，Sac-1，Can-1和Pichi-1)：有效菌浓度混合比例是1：1：1：1；

6)Lpsc组(LAB-1，Pichi-1，Sac-1和Can-1)：有效菌浓度混合比例是1：1：1：1；

7)Lpscw组(LAB-1，Pichi-1，Sac-1，Can-1和Wess-1)：有效菌浓度混合比例是1：1：1：1：1；

8)CK2组(无接种)：不额外添加混合菌液的玉米面和辣酱；(由于混菌实验和单菌实验是两批进行，所以单菌组有独立的对照)；

9)LAB组(LAB-1：单菌接种；

10)WESS组(LAB-1：单菌接种；

11)PICHI组(LAB-1：单菌接种；

12)CAN组(LAB-1：单菌接种；

13)SAC组(LAB-1：单菌接种。

并分别检测各实验组榨广椒发酵过程中的挥发性香味物质包括酯、醇、酚、不挥发的风味酸和和挥发性的风味物质，测定了不同组合发酵榨广椒效果，结果如下：

(1)如图3所示，在榨广椒的发酵过程中，5组接种单菌的实验组(即上述的9)

～13)组)和未接种菌株自然发酵的对照组的理化因子变化过程大体相似，但在这六个组别理化因子的细微变化之中我们依然可以找到一些规律。首先，接种的组别的pH在0～3day的下降速率，因为实验组的起始pH值高于对照组，第三天的pH值又稍低于对照组。在酸度变化上，接种Wess-1、Sac-1和Can-1的实验组在第10day就接近达到最大值。还原糖方面，接种Pichi-1和Sac-1的初始还原糖低至少说明这两株菌在榨广椒发酵初期能够迅速增长。

(2)顶空固相微萃取-气质联用检测单菌发酵产物的挥发性香味物质含量：

取各个实验组发酵30天的样品，每个阶段取三个平行样本进行风味物质分析。

精准吸取8)～13)组的发酵产物5g，溶解于20ml超纯水在，冰浴超声后离心取上清液8ml过膜和20μL二烯丙基二硫醚稀释液(20μg/mL)一起加到15mL顶空瓶中，用盖子密封好，放入60℃水浴锅中平衡5min，将已经老化的萃取头置于瓶子的顶空部分，萃取30min。GC条件：用DB－5MS型弹性石英毛细色谱柱(30m×0.25mm×0.25μm)进行分离；升温程序为初始温度40℃，以3℃/min的速度升至120℃，并保持2min；以10℃/min的速度升温至250℃，并保持3min；以15℃/min的速度升温至300℃；并保持2min。载气为高纯氦气(1.0mL/min)，不分流进样。

各个单菌发酵实验组相比于CK2组并没有表现出明显的优势，在一些风物物质的含量上低于对照的CK2组。

表4顶空固相微萃取-气质联用检测菌株挥发性香味物质(μg/kg)

(3)混菌发酵的理化因子变化过程测定：

如图4所示，混菌实验组和对照组榨广椒发酵阶段的理化因子变化呈现出相似性，接种的实验组和未接种菌株自然发酵的对照组的理化因子变化趋势大体上是一致的，但在部分时间段还是有一定区别。本研究重点关注Lpscw组和CK1组，Lpscw组别在0～3day的理化因子的变化程度总是大于CK1组；在pH和酸度的变化上实验组Lpscw总体的酸度是低于对照组CK1的；还原糖方面，Lpscw组发酵初期还原糖的迅速可以反映实验组发酵的起步是高于对照组的。总之，添加了合成微生物群落实验组的发酵过程中的理化因子变化优于对照组，这意味在本研究的合成微生物群落对榨广椒的发酵进程造成了正面影响。其它的混菌组和Lpscw组以及CK1组的理化因子变化过程基本一致。

(4)顶空固相微萃取-气质联用检测混菌发酵挥发性香味物质含量测定：

提取的方法和检测的条件和步骤(2)中实验的样品检测的条件相同。每个时间点取三个平行，结果如表5所示。结果显示，Lpscw实验组在挥发性风味物质的产量上明显高于未接种的CK1组，相比于其它接种组，各种风味物质的综合含量也是最优的。

表5顶空固相微萃取-气质联用检测菌株挥发性香味物质(μg/kg

(5)发酵结束的产品的微生物组成：

本研究对Lpscw组和CK1组进行了高通量测序分析，在发酵结束时CK1组的物种多样性高于Lpscw组(图5)。这说明虽然没有接种，但CK1组的在30d时物种甚至更加丰富，然而丰度的物种组成并不能产生更多的代谢产物，接种关键的与风味产生相关的微生物菌株更有价值。

Claims (7)

1. 一种适用于榨广椒发酵的复合菌剂，所述的复合菌剂中的菌株，由库德里阿兹威毕赤酵母（Pichia kudriavzevii）Pichi-1，光滑假丝酵母（Candida glabrata）Can-1，酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Sac-1，副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei NJ）LAB-1和融合魏斯氏菌（Weissella confusa）Wess-1组成。

2.根据权利要求1所述的复合菌剂，其特征在于，所述菌株的有效菌浓度为：1~2：1~2：1~2：1~2：1~2。

3.权利要求1所述的复合菌剂在发酵制备榨广椒中的应用。

4. 根据权利要求3所述的应用，应用过程包括：将玉米面和辣椒以质量比为8~4：6~2的比例混匀，按每500 g接种1-10 ml权利要求1所述的复合菌剂的菌液，厌氧发酵28-32天，即得；所述菌液的有效菌浓度是6亿cfu/ml。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：菌液的接种量是5ml。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：玉米面和辣酱的质量比为6:4。

7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：厌氧发酵30天。