CN117701381A - 利用生理性电场调节细胞外泌体分泌的装置 - Google Patents
利用生理性电场调节细胞外泌体分泌的装置 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117701381A CN117701381A CN202311691995.6A CN202311691995A CN117701381A CN 117701381 A CN117701381 A CN 117701381A CN 202311691995 A CN202311691995 A CN 202311691995A CN 117701381 A CN117701381 A CN 117701381A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell culture
- channel
- microfluidic
- electric field
- cell
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 230000005684 electric field Effects 0.000 title claims abstract description 31
- 230000028327 secretion Effects 0.000 title claims abstract description 26
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 title claims abstract description 10
- 210000001808 exosome Anatomy 0.000 title abstract description 51
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims abstract description 99
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 claims abstract description 23
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 claims abstract description 19
- 238000001802 infusion Methods 0.000 claims abstract description 5
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 claims description 31
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 7
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 claims description 5
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 claims description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 claims description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 8
- 238000000429 assembly Methods 0.000 abstract description 2
- 230000000712 assembly Effects 0.000 abstract description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 48
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 12
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 9
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 8
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 6
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 5
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 5
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 4
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 4
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 3
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 3
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000914479 Homo sapiens CD81 antigen Proteins 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 2
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 2
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 2
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 2
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 description 2
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000003370 receptor cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012604 3D cell culture Methods 0.000 description 1
- 102100027221 CD81 antigen Human genes 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 108020005198 Long Noncoding RNA Proteins 0.000 description 1
- 229910021607 Silver chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 206010072170 Skin wound Diseases 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- WYTGDNHDOZPMIW-RCBQFDQVSA-N alstonine Natural products C1=CC2=C3C=CC=CC3=NC2=C2N1C[C@H]1[C@H](C)OC=C(C(=O)OC)[C@H]1C2 WYTGDNHDOZPMIW-RCBQFDQVSA-N 0.000 description 1
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- ICSSIKVYVJQJND-UHFFFAOYSA-N calcium nitrate tetrahydrate Chemical compound O.O.O.O.[Ca+2].[O-][N+]([O-])=O.[O-][N+]([O-])=O ICSSIKVYVJQJND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 230000007646 directional migration Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000002121 endocytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 230000020169 heat generation Effects 0.000 description 1
- 235000003642 hunger Nutrition 0.000 description 1
- 230000007954 hypoxia Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000034217 membrane fusion Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N methane Chemical compound C VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 1
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 description 1
- HKZLPVFGJNLROG-UHFFFAOYSA-M silver monochloride Chemical compound [Cl-].[Ag+] HKZLPVFGJNLROG-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 230000037351 starvation Effects 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 230000005740 tumor formation Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种利用生理性电场调节细胞外泌体分泌的装置。本发明包括微流体细胞培养组件、细胞培养基池、盐桥和电解液池。微流体细胞培养组件包括多个叠放的细胞培养芯片,细胞培养芯片内开有微流体通道,多个细胞培养芯片的微流体通道依次串联,形成细胞培养通道,通道两端连接电压表。两个细胞培养基池分别连通细胞培养通道的入口和出口,两个细胞培养基池之间通过管路连通,管路上设置有输液泵。两个细胞培养基池分别通过盐桥与两个电解液池连通,电解液内插有电极,两个电极通过电源和电压控制器连接。本发明装置结构简单,易于控制,能够提升外泌体的生产效率、增加外泌体产量,同时实现可控、标准化生产。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域,涉及一种细胞外泌体分泌装置,特别是利用生理性电场调节细胞外泌体分泌的装置。
背景技术
外泌体(Exosomes)是一类由细胞分泌,直径大约在40~150nm的纳米级囊泡样结构,能够通过胞吞、膜融合等方式将其携带的蛋白质、脂类、DNA、miRNA、lncRNA、mRNA等物质释放进受体细胞中,经过信号分子的传递变化来使受体细胞的功能发生改变,从而实现调控炎症反应、促进细胞增殖迁移、促进血管生成和调控基质重建等目的。作为干细胞发挥生物学效应的重要途径,与干细胞相比,外泌体性质更稳定,保存运输方便,且没有细胞移植带来的免疫排斥反应和肿瘤形成等风险。尽管应用外泌体治疗疾病具有巨大潜力,但是外泌体的产量低的问题却成为其临床转化面临的最大的挑战之一。目前,提高细胞分泌外泌体的方法主要有通过3D细胞培养,机械力、磁场、声波、饥饿、缺氧、化学物质刺激细胞,能提升外泌体分泌效率至原来的3~10倍,但仍无法满足干细胞外泌体临床实验的需求。进一步提升干细胞外泌体分泌效率,成为当前干细胞外泌体治疗急需攻克的难关。
中国专利CN116355742A公开了一种促进细胞外泌体分泌的培养设备,包括细胞培养装置、气体传输装置、电刺激装置、过滤装置以及控制装置,细胞培养装置内盛放有培养液,气体传输装置用于向细胞培养装置内通入气体或抽出细胞培养装置内的气体以改变细胞培养装置的瓶内压力,电刺激装置通过线缆向培养液施加电流以刺激培养液内的细胞产生外泌体,过滤装置与细胞培养装置相连接以过滤培养液,控制装置则分别与气体传输装置及电刺激装置电连接以控制二者的启动与停止。该培养设备通过增加气体压力和电刺激促进细胞加速分泌外泌体。该专利细胞加电设备设计无电解质缓冲体系,电解产物将直接与细胞接触,会对细胞活力造成直接损伤,同时该设备设计对装置内电流电场无控制,细胞培养槽中不同位置的细胞感受到的电场电流差异大,无法满足外泌体标准化安全生产的要求。专利US20210054359A1、US20210093567、CN111194210A则公开了利用纳米电穿孔和其他非内吞的细胞转染制备治疗性外泌体的方法,在外加150V~220V、10ms脉冲电刺激时能使细胞外泌体产量增加近50~100倍,这些方法施加到细胞上的电信号强,能引起细胞膜穿孔,同时短时间内产生大量热量,相关研究也表明强电压刺激产生的热效应是该装置发挥促进细胞外泌体分泌的关键机制。此外,长期超过安全电压范围的强电刺激会影响细胞活力,所以该方法不适合作为促进细胞外泌体生产的长期方案。
因此亟待开发一种新型的促进细胞分泌外泌体的装置,以达到保持细胞活力的情况下,增加外泌体产量、推进外泌体技术产业化的效果。皮肤伤口、胚胎生长发育等过程中能产生生理性电场,强度在0~200mV/mm之内,生理性电场能引导细胞定向迁移。目前,生理性电场对细胞外泌体分泌的影响还无相关报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足,提供一种利用生理性电场调节细胞外泌体分泌的装置。
本发明包括微流体细胞培养组件、细胞培养基池、盐桥和电解液池。
所述的微流体细胞培养组件包括多个叠放的细胞培养芯片,细胞培养芯片内开有微流体通道,微流体通道两端分别开口于细胞培养芯片的顶面和底面,其中顶面开口为通道入口,底面开口为通道出口;多个微流体通道通道依次串联,形成细胞培养通道,细胞培养通道的两端分别设置有导电引脚,两个导电引脚连接电压表。
每个细胞培养芯片结构相同,包括底板和盖板;底板的一面开有线槽,线槽为蛇形线槽或者螺旋线槽,线槽的一端底面开有通孔,形成微流体通道的出口;盖板上对应底板线槽另一端的位置开有通孔,形成微流体通道的入口;盖板固定覆盖在底板上,线槽和盖板构成微流体通道;多个细胞培养芯片叠放,相邻的一个细胞培养芯片的微流体通道出口对应另一个细胞培养芯片的微流体通道入口,多个细胞培养芯片的微流体通道依次串联,形成细胞培养通道,细胞培养通道开口于微流体细胞培养组件顶面,出口开口于底面。
两个细胞培养基池分别连通微流体细胞培养组件的细胞培养通道的入口和出口,两个细胞培养基池之间通过管路连通,管路上设置有输液泵;两个细胞培养基池分别通过盐桥与两个电解液池连通,电解液池内装有电解液,电解液内插有电极;两个电极通过电源和电压控制器连接,其中电源正极连接细胞培养通道入口一侧的电极,电源负极连接细胞培养通道出口一侧的电极。
本发明装置结构简单,易于控制,能够在保证外泌体效力的前提下,增加外泌体产量,提升外泌体的生产效率,同时实现可控、标准化生产。本发明能够保持细胞活力,细胞可传代,可持续生产,适合培养细胞、离体组织等,装置可重复利用。本发明培养装置的生产方式新颖可靠,提高了外泌体的产量,结构简单易于推广。
附图说明
图1为本发明装置的结构示意图;
图2为细胞培养芯片结构示意图;
图3为一实例中无电场组、100mV/mm直流电刺激组和200mV/mm直流电刺激组外泌体分泌量对比图;
图4为一实例中无电场组、100mV/mm直流电刺激组和200mV/mm直流电刺激组外泌体粒径分布对比图;
图5为一实例中无电场组和100mV/mm直流电刺激组等量细胞、等量培养基收集到的外泌体Western Bolt检测外泌体表面蛋白CD81、CD9信号;
图6为一实例中无电场组和100mV/mm直流电刺激组等量细胞、等量培养基收集到的外泌体对小鼠成纤维细胞迁移的影响对比图;
图7为另一实例中无电场组、200mV/mm直流电刺激组和200mV/mm、250Hz交流电刺激组外泌体分泌量对比图。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例并结合附图说明本发明的实施方式,本领域技术人员可由本说明书所揭示的内容轻易地了解本发明的其它优点与功效。本发明亦可通过其它不同的具体实例加以施行或应用,本说明书中的各项细节亦可基于不同观点与应用,在不背离本发明的精神下进行各种修饰与变更。
如图1所示,包括微流体细胞培养组件1、细胞培养基池2、盐桥3和电解液池4。
微流体细胞培养组件1包括多个叠放的细胞培养芯片,细胞培养芯片内开有微流体通道,微流体通道两端分别开口于细胞培养芯片的顶面和底面,其中顶面开口为通道入口,底面开口为通道出口。多个微流体通道依次串联,形成细胞培养通道,细胞培养通道的两端分别设置有导电引脚,两个导电引脚连接电压表5,通过电压表5测量入口与出口之间的电压。两个细胞培养基池2分别连通微流体细胞培养组件1的细胞培养通道的入口和出口,细胞培养基池2用于储存细胞培养液。两个细胞培养基池2之间通过管路连通,管路上设置有输液泵6。两个细胞培养基池2分别通过盐桥3与两个电解液池4连通,电解液池4内装有电解液(Steinber’s溶液或0.9%NaCl溶液等),电解液内插有电极7(铂电极、碳电极、银氯化银电极等)。两个电极7通过电源8和电压控制器9连接,其中电源正极连接细胞培养通道入口一侧的电极,电源负极连接细胞培养通道出口一侧的电极。
每升Steinberg’s溶液加入10~30g琼脂,加热摇匀后置于容器中,冷却至常温凝固,即为盐桥3。其中,Steinber’s溶液配方:3.4g NaCl、0.05g KCl、0.08g Ca(NO3)2·4H2O、0.1025g MgSO4、0.56g Tris-HCl(pH 7.4),溶于双蒸水中,用HCl将pH调整至7.8-8.0之间,再用双蒸水定容至1L。
如图2所示,每个细胞培养芯片结构相同,包括底板11和盖板12。底板11的一面开有线槽111,线槽111为蛇形线槽或者螺旋线槽,线槽111的一端底面开有通孔,形成微流体通道的出口112。盖板12上对应底板线槽111另一端的位置开有通孔,形成微流体通道的入口121。盖板12固定覆盖在底板11上,线槽111和盖板12构成微流体通道。多个细胞培养芯片叠放,相邻的一个细胞培养芯片的微流体通道出口对应另一个细胞培养芯片的微流体通道入口,多个细胞培养芯片的微流体通道依次串联,形成细胞培养通道,细胞培养通道开口于微流体细胞培养组件顶面,出口开口于底面。线槽111高度(即细胞培养通道高度)为100~1000μm,150~300μm最佳。通过限制微流体通道高度,能在不影响细胞贴壁细胞面积(长度×宽度)的情况下,提高单位长度细胞培养通道的电阻,能在设定的目标电场条件下,降低通过微流体的电流,渐少产热。细胞培养通道的宽度、长度根据细胞培养规模进行调整。
通过电压控制器9调整细胞电刺激电场强度,通过电压表5进行监控。细胞电刺激电场强度=细胞培养通道两端的电压/细胞培养通道的长度,控制细胞电刺激电场强度范围在50~500mV/mm。电刺激模式包括直流电刺激、交变电流刺激、脉冲刺激等,通过电源实现。
通过输液泵6驱动细胞培养通道与细胞培养基池内的培养液进行交换,加速细胞分泌的外泌体、代谢产物以及加电产生的热量的交换。细胞培养通道内设有传感器,用于监测通道内培养液的pH值、温度等细胞培养环境。微流体细胞培养组件1和细胞培养基池2置于符合细胞培养条件的环境中(如细胞培养箱中),如环境温度为37℃,湿度为90%,CO2浓度为5%。
以下结合实例作进一步详细说明。
试药:DMEM培养基(Gibco,美国);α-MEM(Gibco,美国)、RPMI 1640(Gibco,美国)澳洲胎牛血清(FBS,Gibco,美国);胰酶(含0.25%Trypsin+EDTA,Gibco,美国),青霉素-链霉素(P/S,100X)(麦克林,中国),1M HEPES溶液(生工,中国),超滤离心管(100KD,Millipore,德国),Total Exosome Isolation Kit(InvitrogenTM,美国)。人胚胎干细胞来源的间充质干细胞(原生生物,中国),A549细胞(中国细胞库,中国),小鼠胚胎成纤维细胞(中国细胞库,中国)。
仪器:二氧化碳细胞培养箱(Heal Force,中国)、直流电源(北京六一DYY-6C,中国),交流电源(永鹏YP4050(500VA(0-300V),中国)、显微镜(BioTek Lionheart FX,德国)、离心机(Eppendorf,德国)。
人胚胎干细胞来源的间充质干细胞培养于含有10%胎牛血清的DMEM培养液中,小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)培养于含有10%胎牛血清的α-MEM培养液中,A549细胞培养于含有10%胎牛血清的1640培养液中,三种细胞均培养在37℃和5%CO2的环境中,每隔一天换一次液。当细胞生长密度达到80%~90%时消化传代。人胚胎干细胞来源的间充质干细胞仅第4~10代的细胞用于实验。
无外泌体血清制备(EV-FREE FBS):将澳洲胎牛血清通过300g,4℃,10分钟;2000g,4℃,10分钟12000g,4℃,30分钟分别去除血清中的细胞、细胞碎片以及大囊泡。再通过100KD的超滤离心管离心,去除血清中的外泌体。
统计方法:所有实验都经过3次以上重复实验验证(N≥3),统计结果以平均值±标准误(mean±standard error of the mean)表示,统计结果由IBM SPSS22分析得出,采用Student-t检验比较两组间的差异,P<0.05时,差异有统计学意义。
实验一:实验分三组,每组分别将20万人胚胎干细胞来源的间充质干细胞悬液通过注射器注射进入微流体细胞培养通道,贴壁1小时后,将微流体细胞培养通道与细胞培养基池连接,继续添加完全培养基(DMEM+10%FBS+1%P/S),置于细胞培养箱中继续培养8小时。待细胞在微流体通道中长至80%时,换液为含无外泌体血清的完全培养基(DMEM+10%EV-FREE FBS+1%P/S+20mM HEPES)。然后将微流体细胞培养通道,细胞培养基池,电刺激装置、换液装置,控制系统如图组装。打开直流电源,调节外加电压,通过监测微流体细胞培养通道两端的电压,并通过计算公式,分别将各组的生理性电场调至0,100,200mV/mm。加电8小时,加电期间打开换液装置,同时监测培养基微环境,使其中PH为7.2-7.4,温度为37℃。加电结束后,通过换液装置收集条件培养基,进行后续外泌体分离实验。微流体细胞培养通道内干细胞可以通过胰酶消化后收集,继续传代培养。以上操作均需无菌操作。
实验二:实验分三组,每组分别将50万A549细胞悬液通过注射器注射进入微流体细胞培养通道,贴壁1小时后,将微流体细胞培养通道与细胞培养基池连接,继续添加完全培养基(RPMI 1640+10%FBS+1%P/S),置于细胞培养箱中继续培养8小时。待细胞在微流体通道中长至80%时,换液为含无外泌体血清的完全培养基(RPMI 1640+10%EV-FREE FBS+1%P/S+20mM HEPES)。然后将微流体细胞培养通道,细胞培养基池,电刺激装置、换液装置,控制系统如图1组装。不加电对照组(NO EF)不外加电刺激;直流电组(DC组),打开直流电源,调节外加电压,使生理性电场强度为200mV/mm;交流电组(AC组),打开交流电源,调节交流电频率为250Hz,调节外加电压,将生理性电场调至200mV/mm。加电8小时,加电期间打开换液装置,同时监测培养基微环境,使其中PH为7.2-7.4,温度为37℃。加电结束后,通过换液装置收集条件培养基,进行后续外泌体分离实验。以上操作均需无菌操作。
回收的条件培养通过300g,4℃,10分钟;2000g,4℃,10分钟;12000g,4℃,30分钟分别去除培养基中的细胞、细胞碎片以及大囊泡。然后将培养基的上清液通过TotalExosome Isolation Kit(InvitrogenTM)分析提纯出外泌体。外泌体通过纳米颗粒跟踪分析(NTA,Nanoparticle tracking analysis)技术进行定量和粒径分析,通过Western Blot进一步进行鉴定。通过细胞划痕实验验证加电刺激产生的外泌体的功效。
12孔板中,每孔种33万小鼠胚胎成纤维细胞细胞,待细胞生长铺满细胞培养皿时,用200微升枪头划痕,PBS冲洗细胞3次,除去划下的细胞,然后加入无血清培养基,分别加入不加电及加电100mV/mm条件下等量细胞等量培养基收集的间充质干细胞外泌体,在划痕后0小时和24小时用显微镜拍摄划痕愈合情况。
实验一结果如图3所示,100mV/mm直流电刺激8小时能提升外泌体分泌量至不加电组的10.3-34.9倍,200mV/mm直流电刺激8小时能提升外泌体分泌量至不加电组的35.5-84.8倍。如图4所示,加电组收集到的外泌体粒径分布与不加电组基本一致。图5所示,等量细胞等量培养基收集外泌体,Western Bolt检测外泌体表面蛋白CD81、CD9信号,100mV/mm直流电刺激组信号显著高于无电场组。图6所示,100mV/mm直流电刺激组的细胞迁移速度较不加电组快,提示加直流电刺激组收集到的外泌体更能促进细胞迁移,促进伤口愈合。
实验二结果如图7所示,200mV/mm的直流电刺激,200mV/mm、250Hz的交流电刺激均能显著提升A549细胞外泌体分泌量。
Claims (7)
1.利用生理性电场调节细胞外泌体分泌的装置,包括微流体细胞培养组件、细胞培养基池、盐桥和电解液池;其特征在于:
所述的微流体细胞培养组件包括多个叠放的细胞培养芯片,细胞培养芯片内开有微流体通道,微流体通道两端分别开口于细胞培养芯片的顶面和底面,其中顶面开口为通道入口,底面开口为通道出口;多个微流体通道依次串联,形成细胞培养通道,细胞培养通道的两端分别设置有导电引脚,两个导电引脚连接电压表;
两个细胞培养基池分别连通微流体细胞培养组件的细胞培养通道的入口和出口,两个细胞培养基池之间通过管路连通,管路上设置有输液泵;两个细胞培养基池分别通过盐桥与两个电解液池连通,电解液池内装有电解液,电解液内插有电极;两个电极通过电源和电压控制器连接,其中电源正极连接细胞培养通道入口一侧的电极,电源负极连接细胞培养通道出口一侧的电极。
2.如权利要求1所述的利用生理性电场调节细胞外泌体分泌的装置,其特征在于:
每个细胞培养芯片结构相同,包括底板和盖板;底板的一面开有线槽,线槽为蛇形线槽或者螺旋线槽,线槽的一端底面开有通孔,形成微流体通道的出口;盖板上对应底板线槽另一端的位置开有通孔,形成微流体通道的入口;盖板固定覆盖在底板上,线槽和盖板构成微流体通道;多个细胞培养芯片叠放,相邻的一个细胞培养芯片的微流体通道出口对应另一个细胞培养芯片的微流体通道入口,多个细胞培养芯片的微流体通道依次串联,形成细胞培养通道,细胞培养通道开口于微流体细胞培养组件顶面,出口开口于底面。
3.如权利要求1所述的利用生理性电场调节细胞外泌体分泌的装置,其特征在于:所述的微流体通道的高度为100~1000μm。
4.如权利要求1、2或3所述的利用生理性电场调节细胞外泌体分泌的装置,其特征在于:每升Steinberg’s溶液加入10~30g琼脂,加热摇匀后置于容器中,冷却至常温凝固,即为盐桥。
5.如权利要求1、2或3所述的利用生理性电场调节细胞外泌体分泌的装置,其特征在于:细胞培养通道内设有传感器,用于监测通道内培养液的pH值和温度。
6.如权利要求1、2或3所述的利用生理性电场调节细胞外泌体分泌的装置,其特征在于:通过电压控制器调整细胞电刺激电场强度为50~500mV/mm;
细胞电刺激电场强度=细胞培养通道两端的电压/细胞培养通道的长度。
7.如权利要求6所述的利用生理性电场调节细胞外泌体分泌的装置,其特征在于:电刺激为直流电刺激,交变电流刺激,或脉冲刺激。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202311691995.6A CN117701381A (zh) | 2023-12-11 | 2023-12-11 | 利用生理性电场调节细胞外泌体分泌的装置 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202311691995.6A CN117701381A (zh) | 2023-12-11 | 2023-12-11 | 利用生理性电场调节细胞外泌体分泌的装置 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN117701381A true CN117701381A (zh) | 2024-03-15 |
Family
ID=90149162
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202311691995.6A Pending CN117701381A (zh) | 2023-12-11 | 2023-12-11 | 利用生理性电场调节细胞外泌体分泌的装置 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN117701381A (zh) |
-
2023
- 2023-12-11 CN CN202311691995.6A patent/CN117701381A/zh active Pending
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Alexander et al. | Electric field-induced astrocyte alignment directs neurite outgrowth | |
US7109034B2 (en) | Method for electro-permeabilization of individual cellular and organellar structures and use thereof | |
CN103097512B (zh) | 处理粘壁细胞的方法和电极组件 | |
Ziv et al. | Micro-electroporation of mesenchymal stem cells with alternating electrical current pulses | |
CN100344960C (zh) | 刺激动物细胞并记录其生理信号的装置及其生产使用方法 | |
Lim et al. | Alternating current electric fields of varying frequencies: effects on proliferation and differentiation of porcine neural progenitor cells | |
Liu et al. | Regulation of C2C12 differentiation and control of the beating dynamics of contractile cells for a muscle-driven biosyncretic crawler by electrical stimulation | |
CN109988746A (zh) | 一种间充质干细胞成脂诱导分化方法 | |
CN117004559A (zh) | 一种人多能干细胞来源的脑和心肌复合模型的构建方法 | |
CN109852578A (zh) | 一种人毛囊毛乳头细胞来源的外泌体提取方法 | |
EP3715447B1 (en) | Cell culture device and electromagnetic stimulation cell culturing system having the same | |
CN117701381A (zh) | 利用生理性电场调节细胞外泌体分泌的装置 | |
CN111849770A (zh) | 一种建立体外神经网络的方法、体外神经网络及其应用 | |
CN102277297B (zh) | 植入式在体电转染装置 | |
CN113801848B (zh) | 电刺激诱导小鼠海马神经元细胞系氧化应激模型的建立方法 | |
Jacobs IV et al. | Engineering high post-electroporation viabilities and transfection efficiencies for elongated cells on suspended nanofiber networks | |
KR101875271B1 (ko) | 마찰전기를 이용한 체세포로부터 신경세포로의 직접교차분화방법 | |
US20070155011A1 (en) | Method of producing stable collagen producing mesenchymal cells from adult adipose stem cells via transfection | |
WO2013167185A1 (en) | Electrode assembly for generating electric field pulses to perform electroporation to a biological sample | |
CN111944761B (zh) | 促进表皮干细胞分化和生长的方法 | |
Sefton | The Effect of Electrical Stimulation on Endogenous Neural Stem and Progenitor Cell Behavior | |
Sánchez | Development of devices and techniques for electroporation and electrical impedance spectroscopy analysis of adherent cells | |
Bruno | Multifunctional nanostructures for intracellular delivery and sensing in electrogenic cells | |
CN118185919A (zh) | 一种无线微电极细胞贴片的批量制备方法及其在远程诱导干细胞神经分化中的应用 | |
Nakajima et al. | Effect of pulsatile electric field on cultured muscle cells in vitro |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication |