CN1176893C - 植物中贯叶金丝桃素类成分的提取纯化方法 - Google Patents
植物中贯叶金丝桃素类成分的提取纯化方法Info
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Abstract
本发明涉及从贯叶连翘(Hypericum perforatum L.)或其它含贯叶金丝桃素(Hyperforin)的植物中提取纯化贯叶金丝桃素类成分的方法。采用极性溶剂提取与两相萃取，或采用非极性有机溶剂提取，所得提取液经醇水除杂和酸碱处理后，得到贯叶金丝桃素类成分含量不低于65%的提取物。所得提取物再经硅胶柱层析和HPLC制备，可以得到纯度≥95%或98%以上的贯叶金丝桃素。
Description
技术领域
本发明涉及从贯叶连翘或其它含贯叶金丝桃素的植物中提取纯化贯叶金丝桃素类成分的方法。
背景技术
贯叶金丝桃素(Hyperforin)主要存在于金丝桃属贯叶连翘Hypericum perforatum L.及同属其它植物。该化合物具有抗抑郁和抗菌作用。Muller等证明贯叶金丝桃素在纳摩尔浓度(10-9mol/l)水平不但能抑制5-HT，NE，DA的再摄取，而且还能诱导皮质β-肾上腺素受体表达的负调控。Muller的研究表明，贯叶金丝桃素同传统的5-HT，NE抑制剂一样，能够抑制所有三种单胺的再摄取。Bhattacharya等研究表明，贯叶金丝桃素与抗抑郁药及抗焦虑药在动物抑郁的实验模型中的活性类似，贯叶金丝桃素能提高在强迫游泳实验和非帮助学习实验中动物抗抑郁的能力。含贯叶金丝桃素的提取物可用作抗抑郁的药品、功能食品或普通食品。
贯叶金丝桃素，分子量536.77，熔点79-80℃，对光、热和空气不稳定，易氧化。其结构如下：
贯叶金丝桃素(hyperforin)的结构式
已有的贯叶金丝桃素的提取方法，最常用的是取粉碎的干燥全草，用极性有机溶剂乙醇，丙酮或非极性有机溶剂正己烷，石油醚等浸提，尽管后者所得贯叶金丝桃素含量较高，但一般不超过2％。另有采用贯叶连翘的花进行提取，所得提取物中贯叶金丝桃素含量达到4-7％，但贯叶连翘的花难以大量得到。
发明内容
本发明的目的是提供从贯叶连翘或其它含贯叶金丝桃素的植物中提取纯化贯叶金丝桃素类成分的方法。通过本发明方法可得到贯叶金丝桃素含量不低于65％的稳定的提取物，并且所得提取物进一步经硅胶柱预处理、HPLC制备，可得到纯度≥95％的贯叶金丝桃素。
本发明包括采用极性溶剂提取与两相萃取(方法之一)，和采用非极性有机溶剂提取(方法之二)两种方法。
本发明方法之一的具体步骤是：
(1)取含贯叶金丝桃素植物地上部分，每次用药材干重4-10倍量含1-5％wt复合稳定剂的极性溶剂在室温并搅拌下浸提2-6小时，浸提2-3次；所说的极性溶剂为醇类(通常为甲醇、乙醇、丙醇或异丙醇)、酮类(通常为丙酮)、酮水混合溶剂或酮醇水以任意比例的混合溶剂；所说的复合稳定剂为VC或VC的衍生物和VE或VE的衍生物与有机酸的混合体，混合比例为VC或VC的衍生物∶VE或VE的衍生物∶有机酸＝20～200∶20～200∶1(质量比)；所说的有机酸通常为柠檬酸、苯甲酸、酒石酸中任一种或它们以任意比例的组合；所说的含贯叶金丝桃素植物最好是贯叶连翘(Hypericum perforatum L.)，也可以是金丝桃属的其它植物；
(2)将上述所得提取液浓缩至含生药量0.1-1克/毫升后加水至含水量10-60％，用含0.5-5％wt稳定剂的非极性溶剂萃取1-3次，萃取溶剂总体积为生药量的8-16倍，取非极性溶剂相；所说的非极性溶剂是石油醚、乙醚、烷烃类(通常为正戊烷、正己烷或正庚烷)或环烷烃类(通常为环戊烷或环己烷)，或它们的任意比混合溶剂；所说的稳定剂是VE或VE的衍生物。
(3)上述所得非极性溶剂相用40％-60％乙醇水溶液萃取(洗涤)除杂，以40％-60％乙醇水溶液相呈透明浅黄绿色为萃取终点；非极性溶剂相用pH≥8.5的含碱的40％-60％乙醇水溶液萃取，取碱醇相；所说的碱是指水可溶性碱(可以是KOH、NaOH、K2CO3、Na2CO3、KHCO3或NaHCO3)；
(4)将上述所得碱醇相调至pH＝0-4后，再用与步骤(2)相同的含0.5-5％wt稳定剂的非极性溶剂萃取1-3次，取非极性溶剂相，萃取溶剂总体积为生药量的5-10倍；
(5)在低于45℃下减压回收非极性溶剂，即得到贯叶金丝桃素的含量不低于65％的稳定的提取物。所得到的提取物为浅棕色粘状固体，有特殊气味。
本发明方法之二的具体步骤是：
(1)取含贯叶金丝桃素植物地上部分，每次用药材干重3-8倍量的含0.5-5％wt稳定剂的非极性溶剂，在室温并搅拌下浸提3-6小时，浸提2-3次；所说的非极性溶剂是石油醚、乙醚、烷烃类(通常为正戊烷、正己烷或正庚烷)或环烷烃类(通常为环戊烷或环己烷)，或它们的任意比混合溶剂；所说的稳定剂是VE或VE的衍生物；所说的含贯叶金丝桃素植物最好是贯叶连翘(Hypericum perforatumL.)，也可以是金丝桃属的其它植物；
其余步骤与方法之一中的步骤(3)至(5)相同。
将上述本发明方法之一或方法之二所得到的提取物再进一步经硅胶柱预处理、HPLC制备，可得到纯度≥95％的贯叶金丝桃素；具体方法如下：
(1)将所得到的贯叶金丝桃素含量不低于65％的稳定的提取物进行硅胶柱层析，洗脱液为非极性溶剂，薄层检测后合并相同组分，回收溶剂。所说的非极性溶剂为石油醚、烷烃类(通常为正戊烷、正己烷或正庚烷)或环烷烃类(通常为环戊烷或环己烷)，或它们的任意比混合溶剂。
(2)将上述回收溶剂后的组分用2倍量甲醇溶解，然后进行HPLC分离纯化。柱填料为C18；检测波长为270nm；
(3)洗脱液经非极性溶剂萃取，取非极性溶剂相，回收溶剂即后得含量≥95％的贯叶金丝桃素，立即充入惰性气体并于-20℃以下保存；所说的非极性溶剂是石油醚、乙醚、烷烃类(通常为正戊烷、正己烷或正庚烷)或环烷烃类(通常为环戊烷或环己烷)，或它们的任意比混合溶剂。
本发明所得提取物中贯叶金丝桃素的鉴别采用薄层色谱法(TLC)，含量测定采用高效液相色谱法(HPLC)。
本发明方法具有以下特点：
(1)利用贯叶金丝桃素分子中烯醇结构的强酸性，用碱处理使贯叶金丝桃素完全成盐而溶于水，再用酸中和提取浓缩，通过这步操作使贯叶金丝桃素与其他非酸性物质分开，进一步提高提取物中贯叶金丝桃素的含量。本发明方法所得提取物中贯叶金丝桃素的含量可达到65％以上，远远高于已有同类方法。
(2)提取物进一步采用HPLC分离前，先用硅胶柱预处理，可除掉大部分杂质，避免干扰，使上样量得到很大提高，并减少对高效液相柱的污染。
(3)经HPLC分离后的含贯叶金丝桃素溶液，由于是醇水溶液，沸点高，为避免加热浓缩时产品的降解，利用贯叶金丝桃素在非极性溶剂中溶解度极高的特点，采用低沸点的非极性溶剂提取醇水液，再回收溶剂，可减少贯叶金丝桃素的降解。
本发明方法所得的稳定提取物可作为以贯叶连翘或其它含贯叶金丝桃素的植物为药材生产抗抑郁药物制剂、功能食品或普通食品的原料，纯度≥95％的贯叶金丝桃素纯品可以为提取物和其制剂的含量测定提供对照品。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步说明。
实施例1：
取贯叶连翘药材粉末300g，每次用800毫升含1％wt复合稳定剂(稳定剂的组成为VC∶VE∶柠檬酸＝50∶100∶1)丙酮浸提，共提3次，每次1天，合并丙酮浸提液，回收丙酮至1000毫升后加入蒸馏水250毫升。再用1300毫升石油醚萃取，共萃取2次，合并石油醚相并加入维生素E至含量为1％。浓缩至600毫升后以50％乙醇500毫升萃取2次，弃去乙醇相。以800毫升1％NaOH的50％乙醇溶液碱化石油醚相，弃去石油醚相。用10％盐酸调节碱醇液至pH＝2，然后用含VE1％的石油醚萃取3次，每次用石油醚300毫升。合并石油醚相，低温减压浓缩得浅棕色提取物2.13g，贯叶金丝桃素含量71.6％。
实施例2：
取贯叶连翘药材粉末534g，每次用1200毫升丙酮(含1％wt复合稳定剂，稳定剂的组成为VC∶VE∶柠檬酸＝100∶50∶1)在不断搅拌下浸提，共提3次，每次2小时，合并丙酮浸提液，回收丙酮至930毫升后加入蒸馏水260毫升。再用900毫升含VE2％的正己烷萃取，共萃取2次，合并正己烷相。浓缩至860毫升后以50％乙醇400毫升萃取2次，弃去乙醇相。以1000毫升1％NaOH的50％乙醇溶液碱化石油醚相，弃去石油醚相。用10％盐酸调节碱醇液至pH＝2，然后用500毫升含VE2％的正己烷萃取，共萃取2次，合并正己烷相。低温减压浓缩得浅棕色提取物3.47g，贯叶金丝桃素含量75.3％。
实施例3：
取1100g贯叶连翘药材粉碎，在搅拌下每次用2200ml丙酮(含1％wt复合稳定剂，稳定剂的组成为VC的棕榈酸酯∶VE∶苯甲酸＝200∶50∶1)浸提，共提3次，每次2小时，合并浸提液。浸提液浓缩至3000毫升后加蒸馏水800毫升，用含VE0.5％的石油醚萃取。石油醚相浓缩至2100毫升，用700毫升60％乙醇萃取1次，弃去醇水相。2000毫升2％NaHCO3的50％乙醇溶液萃取，碱醇相以10％盐酸调至pH＝0，再用1000毫升含VE 0.5％的石油醚萃取，共萃取2次，合并石油醚相并在室温下减压浓缩得棕色提取物6.3g，贯叶金丝桃素含量68.2％。
实施例4：
取贯叶连翘药材粉末286g，每次用490毫升石油醚(含VE1％wt)在不断搅拌下浸提，共提2次，每次4小时，合并浸提液，以55％乙醇300毫升萃取2次，弃去乙醇相。以800毫升2.5％Na2CO3的50％乙醇溶液碱化石油醚相，弃去石油醚相。用5％盐酸调节碱醇液至pH＝1，然后用350毫升含VE2％的正己烷萃取，共萃取2次，合并正己烷相。低温减压浓缩得浅棕色提取物1.96g，贯叶金丝桃素含量79.1％。
实施例5：
取由实施例3得到的提取物0.9845g，经硅胶柱预处理(洗脱溶剂为正己烷)，高效液相分离，色谱柱为Supelcosil DDS(21.2×250mm，12μm)。洗脱条件是A∶D＝95∶5(A：CH3OH，D：0.1％H3PO4水溶液∶CH3OH＝100∶5)。收集贯叶金丝桃素部分，用正己烷萃取6次，每次约为甲醇量的1/5，合并正己烷，减压蒸除正己烷至干。得纯贯叶金丝桃素0.1792g，含量为98.05％。
实施例6：
取由实施例4得到的提取物0.8913g，经硅胶柱预处理(洗脱溶剂为石油醚)，高效液相分离，色谱柱为Supelcosil DDS(21.2×250m，12μm)。洗脱条件是A∶D＝95∶5(A：CH3OH，D：0.1％H3PO4水溶液∶CH3OH＝100∶5)。收集贯叶金丝桃素部分，用乙醚萃取6次，每次约为甲醇量的1/5，合并乙醚相，减压蒸去乙醚。得纯贯叶金丝桃素0.1443g，含量为96.89％。
Claims (10)
1.植物中贯叶金丝桃素类成分的提取纯化方法，具体步骤包括：
(1)取含贯叶金丝桃素植物地上部分，每次用药材干重4-10倍量含1-5％wt复合稳定剂的极性溶剂在室温并搅拌下浸提2-6小时，浸提2-3次；所说的极性溶剂为醇类、酮类、酮水混合溶剂或酮醇水以任意比例的混合溶剂；所说的复合稳定剂为VC或VC的衍生物、VE或VE的衍生物与有机酸的混合体，混合比例为VC或VC的衍生物∶VE或VE的衍生物∶有机酸＝20～200∶20～200∶1质量比；
(2)将上述所得提取液浓缩至含生药量0.1-1克/毫升后加水至含水量10-60％，用含0.5-5％wt稳定剂的非极性溶剂萃取1-3次，萃取溶剂总体积为生药量的8-16倍，取非极性溶剂相；所说的非极性溶剂是石油醚、乙醚、烷烃类或环烷烃类，或它们的任意比混合溶剂；所说的稳定剂是VE或VE的衍生物；
(3)上述所得非极性溶剂相用40％-60％乙醇水溶液萃取除杂，以40％-60％乙醇水溶液相呈透明浅黄绿色为萃取终点；非极性溶剂相用pH≥8.5的含碱的40％-60％乙醇水溶液萃取，取碱醇相；所说的碱是指水可溶性碱；
(4)将上述所得碱醇相调至pH＝0-4后，再用与步骤(2)相同的含0.5-5％wt稳定剂的非极性溶剂萃取1-3次，取非极性溶剂相，萃取溶剂总体积为生药量的5-10倍；
(5)在低于45℃下减压回收非极性溶剂，即得到贯叶金丝桃素的含量不低于65％的稳定的提取物。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征是步骤(1)所说的醇类为甲醇、乙醇、丙醇或异丙醇，所说的酮类为丙酮；所说的有机酸为柠檬酸、苯甲酸、酒石酸中任一种或它们以任意比例的组合。
3.按照权利要求1所述的方法，其特征是步骤(1)所说的含贯叶金丝桃素植物是贯叶连翘，或者是金丝桃属的其它植物。
4.按照权利要求1所述的方法，其特征是步骤(2)所说的烷烃类为正戊烷、正己烷或正庚烷，所说的环烷烃类为环戊烷或环己烷。
5.按照权利要求1所述的方法，其特征是步骤(3)所说的水可溶性碱为KOH、NaOH、K2CO3、Na2CO3、KHCO3或NaHCO3。
6.按照权利要求1至5之一所述的方法，其特征是将所得到的提取物再进一步进行纯化处理，具体方法如下：
(1)将所得到的贯叶金丝桃素含量不低于65％的稳定的提取物进行硅胶柱层析，洗脱液为非极性溶剂，薄层检测后合并相同组分，回收溶剂；所说的非极性溶剂为石油醚、烷烃类或环烷烃类，或它们的任意比混合溶剂；
(2)将上述回收溶剂后的组分用2倍量甲醇溶解，然后进行HPLC分离纯化；柱填料为C18；检测波长为270nm；
(3)洗脱液经非极性溶剂萃取，取非极性溶剂相，回收溶剂后得含量≥95％的贯叶金丝桃素，立即充入惰性气体并于-20℃以下保存；所说的非极性溶剂是石油醚、乙醚、烷烃类或环烷烃类，或它们的任意比混合溶剂。
7.按照权利要求6所述的方法，其特征是所说的烷烃类为正戊烷、正己烷或正庚烷，所说的环烷烃类为环戊烷或环己烷。
8.植物中贯叶金丝桃素类成分的提取纯化方法，具体步骤包括：
(1)取含贯叶金丝桃素植物地上部分，每次用药材干重3-8倍量的含0.5-5％wt稳定剂的非极性溶剂，在室温并搅拌下浸提3-6小时，浸提2-3次；所说的非极性溶剂是石油醚、乙醚、烷烃类或环烷烃类，或它们的任意比混合溶剂；所说的稳定剂是VE或VE的衍生物；
(2)上述所得非极性溶剂提取液用40％-60％乙醇水溶液萃取除杂，以40％-60％乙醇水溶液相呈透明浅黄绿色为萃取终点；非极性溶剂相用pH≥8.5的含碱的40％-60％乙醇水溶液萃取，取碱醇相；所说的碱是指水可溶性碱；
(3)将上述所得碱醇相调至pH＝0-4后，再用与步骤(2)相同的含0.5-5％wt稳定剂的非极性溶剂萃取1-3次，取非极性溶剂相，萃取溶剂总体积为生药量的5-10倍；
(4)在低于45℃下减压回收非极性溶剂，即得到贯叶金丝桃素的含量不低于65％的稳定的提取物。
9.按照权利要求8所述的方法，其特征是将所得到的提取物再进一步进行纯化处理，具体方法如下：
(1)将所得到的贯叶金丝桃素含量不低于65％的稳定的提取物进行硅胶柱层析，洗脱液为非极性溶剂，薄层检测后合并相同组分，回收溶剂；所说的非极性溶剂为石油醚、烷烃类或环烷烃类，或它们的任意比混合溶剂；
(2)将上述回收溶剂后的组分用2倍量甲醇溶解，然后进行HPLC分离纯化；柱填料为C18；检测波长为270nm；
(3)洗脱液经非极性溶剂萃取，取非极性溶剂相，回收溶剂即后得含量≥95％的贯叶金丝桃素，立即充入惰性气体并于-20℃以下保存；所说的非极性溶剂是石油醚、乙醚、烷烃类或环烷烃类，或它们的任意比混合溶剂。
10.按照权利要求8或9所述的方法，其特征是所说的烷烃类为正戊烷、正己烷或正庚烷，所说的环烷烃类为环戊烷或环己烷；所说的水可溶性碱通常为KOH、NaOH、K2CO3、Na2CO3、KHCO3或NaHCO3。
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