CN117683929A - 一种鉴定棉花品种中棉113的引物和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及农作物鉴定领域，且公开了一种鉴定棉花品种中棉113的引物和方法，其包括收集单核苷酸多态性位点信息、KASP引物设计、棉花品种DNA准备、KASP反应体系及扩增程序以及结果和数据读取等五个步骤。本发明基于KASP技术用于中棉113与其它棉花品种的区别和鉴定的引物组包括9对，分别是P5‑1、P5‑2、P5‑3、P5‑6、P6‑4、P11‑1、P11‑2、P12‑3、P13‑1，并对P5‑1、P5‑2、P5‑3、P5‑6、P6‑4、P11‑1、P11‑2、P12‑3、P13‑1中碱基变异位点信息整理，针对变异位点设计特异性引物，获得的9对引物组可将同一位点的不同碱基变异明显分型，可用于中棉113品种鉴定。KASP能够利用通用荧光探针，根据引物末端不同SNP位点碱基的特异差异来对SNP分型，具有时间快、检测精度高、成本低、操作简单的优势。
Description
技术领域
本发明属于农作物鉴定领域，具体为一种鉴定棉花品种中棉113的引物和方法。
背景技术
棉花是一种天然纤维植物，主要用于制作纺织品和纺织品。它的纤维柔软而坚韧，吸湿性强，适合制作各种衣物和家居用品。棉花的种子有丰富的油脂含量，可以提取棉籽油用于食品加工和工业用途。
棉花是我国重要的经济作物和战略物资，而新疆是我国棉花主要的种植地。中棉113是中国农业科学院棉花研究所历经多年培育的西北内陆棉品种，生育期115天的早熟特性划时代推动北疆风险棉区宜棉化，扩大了北疆植棉北界，并于2022年和2023年连续两年入选农业农村部主导品种，有效提高了棉农的收益。好的品种往往受到棉农欢迎，而受利益驱使，不良商家会采用种子套牌的方式进行售卖，导致一些假冒伪劣棉种流入市场，造成产量损失与品质下降，坑害棉农的利益，所以棉花品种的真伪鉴定在生产、加工和销售过程中及其重要。
传统的种子鉴别包括人工鉴别、田间种植鉴别、电泳检测、生理和化学鉴定等方法，这些方法虽能有效鉴别棉花品种，但都存在着一些缺点，如人工鉴别往往存在着经验性，鉴别精度差，而田间种植则需要消耗大量的时间人力物力，成本较高，电泳检测操作繁琐等。
发明内容
要解决的技术问题：如何通过精度高、操作简便、节省成本的方法进行棉花品种中棉113的鉴别。
技术方案：本发明提供了一种鉴定棉花品种中棉113的引物和方法，所述方法包括以下步骤：步骤一，收集单核苷酸多态性位点(SNP)信息：从公共数据库中下载陆地棉基因组序列，借助Blsat+进行基因组序列的本地化比对，找到基因组中存在的SNP信息，随机从不同染色体上挑选SNP并整理其基本信息，包括所在染色体、染色体物理位置、碱基变异；根据这些信息，提取SNP位点上下游50bp的序列；步骤二，KASP引物设计：对步骤一中的每个SNP序列命名，并将该命名用于后续步骤的SNP引物名称，对上述每条序列在SNP位置处标记碱基变异位点，其中，[/]即为碱基变异位点；根据KASP引物设计原则，利用primer3软件基于上述每条序列碱基变异位点分别设计三条引物序列，包括两条正向PCR引物序列和一条通用反向引物序列；其中正向引物3’端为变异的碱基，在正向引物的5’端分别添加标签序列；具体而言，第一条正向引物(F1)5’端添加FAM标签的核苷酸序列：GAAGGTGACCAAGTTCATGCT，在第二条正向引物5’端添加HEX标签的核苷酸序列：GAAGGTCGGAGTCAACGGATT，同时，对每条序列的下游设计通用的反向引物(C1)；步骤三，棉花品种DNA准备：选取包括TM-1在内的来自西北内陆地区的棉花品种22份，具体包括陆地棉遗传标准系TM-1，其它所有的品种均来自西北内陆地区，具体包括八农212、吐71-113、库车96515、喀什736、库车T94-4、新陆早10号、莎陆1号、新陆中5号、新陆早36、博乐34、新陆早21、新陆早28、新陆中34、军棉1号、吐83-161、石河子913、科遗7号、红鸡脚叶白绒、新陆早31和新陆早7号；将以上22份棉花品种种植于营养钵中，待长出真叶后，剪取供试材料幼嫩叶片组织，采用CTAB法提取基因组DNA，将提取好的DNA稀释成最终浓度为40ng/μL，得到待检测模板；步骤四，KASP反应体系及扩增程序：在384孔荧光定量板上进行KASP反应，每孔的混合反应体系共计5.0μL；而扩增程序分不同温度和反应时间条件下进行；步骤五，结果和数据读取：利用荧光定量仪收集扩增产物的荧光信号，对产物分型检测；待反应完成后，同一位点不同等位变异通过不同颜色或者不同形状展示，相同等位变异类型的材料以相同颜色或者相同形状的图形通过二维聚类图展示，同时导出表格形式。
技术效果：本发明中，针对变异位点设计特异性引物，获得的9对引物组可有效区分等位变异位点，可用于中棉113品种鉴定。采用引物组对包括中棉113在内的22份棉花品种进行差异位点分型，结果能够明显区分中棉113和其它品种基因组位点差异的检测，为中棉113品种鉴定和保护提供了新思路。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为本发明SNP变异基本信息图；
图2为本发明整理后的9个SNP位点序列信息图；
图3为本发明SNP位点的引物信息图；
图4为本发明的KASP检测结果P5-1图；
图5为本发明的KASP检测结果P5-2图；
图6为本发明的KASP检测结果P5-3图；
图7为本发明的KASP检测结果P5-6图；
图8为本发明的KASP检测结果P6-4图；
图9为本发明的KASP检测结果P11-1图；
图10为本发明的KASP检测结果P11-2图；
图11为本发明的KASP检测结果P12-3图；
图12为本发明的KASP检测结果P13-1图；
图13为本发明9个SNP位点的KASP基因分型结果图；
图14为本发明方法的步骤流程图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例；基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明具体实施方式提供的基于KASP技术鉴定棉花品种中棉113的方法，如图14所示，包括以下步骤：
一，收集单核苷酸多态性位点(SNP)信息：从公共数据库(https://cottonfgd.net/about/download.html)中下载陆地棉基因组序列，借助Blsat+进行基因组序列的本地化比对，找到基因组中存在的SNP信息，随机从不同染色体上挑选SNP并整理其基本信息，包括所在染色体、染色体物理位置、碱基变异。根据这些信息，提取SNP位点上下游50bp的序列。考虑到引物设计时，需要注意引物特异性、GC含量在40-60％以及序列中重复序列低的原则，因此筛选了9个SNP，其具体信息如图1所示。
二，KASP引物设计：由于引物是针对碱基变异位点设计，所以对上述每条序列在SNP位置处标记碱基变异，分别整理成如下所示，为方便起见，将图1中的每个SNP引物名称对应于相应SNP的序列，并采用相同命名，其中[/]即为碱基变异位点，具体信息如图2所示。根据KASP引物设计原则，利用primer3软件基于上述每条序列碱基变异位点分别设计三条引物序列，包括两条正向PCR引物序列和一条通用反向引物序列。其中，正向引物3’端为变异的碱基，在正向引物的5’端分别添加标签序列，在本发明中，第一条正向引物(F1)5’端添加FAM标签的核苷酸序列：GAAGGTGACCAAGTTCATGCT，在第二条正向引物5’端添加HEX标签的核苷酸序列：GAAGGTCGGAGTCAACGGATT。同时，对每条序列的下游设计通用的反向引物(C1)，其引物信息如图3所示。另外，值得一提的是，本发明对所述引物组的各引物的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的引物来源即可。在本发明实施例中，所述引物组委托北京六合华大基因科技有限公司合成。引物合成后将其稀释成100μM，引物体系包括两条正向引物各12μL，通用反向引物30μL，dd H2O 46μL共计100μL。
三，棉花品种DNA准备：为了对中棉113进行品种鉴定，选取了包括TM-1在内的来自西北内陆地区的棉花品种22份，具体包括陆地棉遗传标准系TM-1，其它所有的品种均来自西北内陆地区，具体包括八农212、吐71-113、库车96515、喀什736、库车T94-4、新陆早10号、莎陆1号、新陆中5号、新陆早36、博乐34、新陆早21、新陆早28、新陆中34、军棉1号、吐83-161、石河子913、科遗7号、红鸡脚叶白绒、新陆早31、新陆早7号，这些品种育成年代不同，其代表西北内陆尤其新疆地区棉花品种的遗传多样性。借助遗传多样性高的棉花品种为对照来鉴别中棉113品种，将大大提高检测的准确性。以上这些棉花品种均为公开的棉花品种，可通过市售或其他手段容易获得。将以上22份棉花品种种植于营养钵中，待长出真叶后，剪取供试材料幼嫩叶片组织，采用CTAB法提取基因组DNA。将提取好的DNA稀释成最终浓度为40ng/μL，得到待检测模板。
四，KASP反应体系及扩增程序：KASP反应在384孔荧光定量板上进行，每孔的混合反应体系共计5.0μL。根据罗氏LightCycler480荧光定量仪(Roche)要求从北京嘉程生物科技有限公司订购HiGeno2Xprobe Mix A kasp试剂。反应的混合体系如下：DNA模板2.2μL、kasp试剂2.5μL、引物0.056μL、灭菌超纯水0.244μL。KASP扩增程序：(1)94℃，15min；(2)95℃，20s；61-55℃，25s(10个循环，每个循环下降0.6℃)；(3)95℃，10s；57℃，1min，35个循环；(4)4℃保存。
五，结果和数据读取：利用罗氏LightCycler480荧光定量仪收集扩增产物的荧光信号，对产物分型检测；待反应完成后，同一位点不同等位变异通过不同颜色或者不同形状展示，相同等位变异类型的材料以相同颜色或者相同形状的图形通过二维聚类图展示，同时导出表格形式。KASP检测结果如图4-12所示，不同形状代表不同的碱基变异，相同形状的点表示携带相同碱基变异的材料。不同品种在目标位点上均能产生明显的分型。如图13所示：1.所有位点组合鉴别中棉113：KASP基因分型结果显示，中棉113在9个位点携带的碱基分别为T(P5-1)T(P5-2)T(P5-3)A(P5-6)T(P6-4)A(P11-1)A(P11-2)G(P12-3)T(P13-1)，而其它品种在9个位点上则无与其完全一样的碱基变异，表明这些位点能够鉴定品种中棉113；2.两个位点组合鉴别中棉113：进一步分析发现，在P11-1位点上，与中棉113携带相同碱基变异A的只有品种库车T94-4，而这两份品种在P5-2、P5-3、P5-6、P6-4上碱基变异情况均不一样，其中，中棉113为T(P5-2)T(P5-3)A(P5-6)T(P6-4)，而库车T94-4为C(P5-2)C(P5-3)G(P5-6)C(P6-4)，表明通过P11-1位点与P5-2、P5-3、P5-6、P6-4位点中的任何一个都能够鉴别品种中棉113；同样的，P11-2位点能够将中棉113、库车T94-4与其它品种相区分，而位点P5-2、P5-3、P5-6、P6-4能够将中棉113与库车T94-4品种区分，表明P11-2位点与P5-2、P5-3、P5-6、P6-4位点中的任一组合都能够鉴别品种中棉113。此外，P5-1与P5-3、P5-1与P5-6组合也能鉴别中棉113与其它品种的区别；3.三个位点组合鉴别中棉113：P5-1、P5-2两个位点上，中棉113与吐83-161均携带TT碱基变异，因此能将这两个品种与其它品种有效区别，进一步，在P5-3、P5-6、P6-4、P11-1、P11-2、P12-3位点上，中棉113分别为TATAAG碱基类型，而吐83-161则为CGCGCC碱基类型，表明P5-1、P5-2与P5-3、P5-6、P6-4、P11-1、P11-2、P12-3中的任一位点相组合，都能鉴别中棉113；同样地，P5-2、P5-3与P11-1、P11-2任一位点相组合，同样都能鉴别中棉113。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (3)
1.一种鉴定棉花品种中棉113的引物和方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
步骤一，收集单核苷酸多态性位点(SNP)信息：从公共数据库中下载陆地棉基因组序列，借助Blsat+进行基因组序列的本地化比对，找到基因组中存在的SNP信息，随机从不同染色体上挑选SNP并整理其基本信息，包括所在染色体、染色体物理位置、碱基变异；根据这些信息，提取SNP位点上下游50bp的序列；
步骤二，KASP引物设计：对步骤一中的每个SNP序列命名，并将该命名用于后续步骤的SNP引物名称，对上述每条序列在SNP位置处添加碱基变异位点，其中，[/]即为碱基变异位点；根据KASP引物设计原则，利用primer3软件基于上述每条序列碱基变异位点分别设计三条引物序列，包括两条正向PCR引物序列和一条反向引物序列；其中正向引物3’端为变异的碱基，在正向引物的5’端分别添加标签序列；具体而言，第一条正向引物(F1)5’端添加FAM标签的核苷酸序列：GAAGGTGACCAAGTTCATGCT，在第二条正向引物5’端添加HEX标签的核苷酸序列：GAAGGTCGGAGTCAACGGATT。对每条序列的下游设计通用的反向引物(C1)；
步骤三，棉花品种DNA准备：选取包括TM-1在内的来自西北内陆地区的棉花品种22份，具体包括陆地棉遗传标准系TM-1，其它所有的品种均来自西北内陆地区，具体包括八农212、吐71-113、库车96515、喀什736、库车T94-4、新陆早10号、莎陆1号、新陆中5号、新陆早36、博乐34、新陆早21、新陆早28、新陆中34、军棉1号、吐83-161、石河子913、科遗7号、红鸡脚叶白绒、新陆早31和新陆早7号；将以上22份棉花品种种植于营养钵中，待长出真叶后，剪取供试材料幼嫩叶片组织，采用CTAB法提取基因组DNA，将提取好的DNA稀释成最终浓度为40ng/μL，得到待检测模板；
步骤四，KASP反应体系及扩增程序：在384孔荧光定量板上进行KASP反应，每孔的混合反应体系共计5.0μL；而扩增程序分不同温度和反应时间条件下进行；
步骤五，结果和数据读取：利用荧光定量仪收集扩增产物的荧光信号，对产物分型检测；待反应完成后，同一位点不同等位变异通过不同颜色或者不同形状展示，相同等位变异类型的材料以相同颜色或者相同形状的图形通过二维聚类图展示，同时导出表格形式。
2.根据权利要求1所述的基于KASP技术鉴定棉花品种中棉113的方法，其特征在于，在筛选SNP时，需要考虑引物设计时，注意特异性、GC含量在40-60％以及序列中重复序列低的原则。
3.根据权利要求1所述的基于KASP技术鉴定棉花品种中棉113的方法，其特征在于，所述引物组的各引物的来源没有特殊限制，采用熟知的引物来源。
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2023
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