CN117683738A - 一种交叉反应性提高、抗原谱拓展的重组o型口蹄疫疫苗毒株及其构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种交叉反应性提高、抗原谱拓展的重组O型口蹄疫疫苗毒株及其构建方法和应用，属于生物制品技术领域。一种O型口蹄疫疫苗毒株，在O型口蹄疫病毒rHN/TURVP1的基础上对VP1结构蛋白进行以下改造：重组表达插入有Cathay拓扑型流行毒株VP1的G‑H环基因的口蹄疫病毒O/TUR/5/2009株VP1结构蛋白。利用反向遗传学手段在口蹄疫病毒VP1基因中插入Cathay拓扑型流行毒株G‑H环基因，成功构建了含双G‑H环的重组病毒，该病毒遗传稳定，制备的疫苗免疫猪显著提高对Cathay型流行病毒的交叉反应性，拓展重组口蹄疫病毒的抗原谱，有潜力作为疫苗候选株用于我国当前流行O型口蹄疫的有效防控。
Description
技术领域
本发明属于生物制品技术领域，具体涉及一种交叉反应性提高、抗原谱拓展的重组O型口蹄疫疫苗毒株及其构建方法和应用。
背景技术
口蹄疫(Foot-and-Mouth Disease，FMD)是猪、牛和羊等70多种偶蹄动物感染的一种烈性传染病。目前，我国对FMD的防控主要采取以灭活疫苗免疫为主的综合防控措施，尽管灭活疫苗在预防、控制和净化FMD方面发挥了非常重要的作用，但口蹄疫病毒(Foot-and-Mouth Disease Virus,FMDV)血清型多，基因和抗原高度易变，使FMD很难防控。
近年来，我国主要流行A型和O型FMD，其中A型FMD趋于控制，而O型FMDV依然是危害我国畜牧养殖业最严重的血清型。系统进化树分析显示我国当前流行的O型FMDV主要分为古典中国(Cathay)、中东-南亚型(ME-SA)、东南亚型(SEA)三种拓扑型。其中Cathay拓扑型FMDV株主要引起猪发病，自1970年首次发现，2010年后很少出现，但2016年以来，Cathay拓扑型毒株引发的FMD逐渐增多，并已经成为危害我国养猪业最重要的基因型。三个拓扑型中Cathay拓扑型流行毒株抗原变异最大，已经遗传进化为四个分支：旧猪毒、新猪毒-1、新猪毒-2、新猪毒-3，其中旧猪毒分支的病毒株免疫原性普遍较强(如O/ZK/93，OS99)，而新猪毒2和3分支的免疫原性较弱，很难筛选新的疫苗株，且新猪毒-3分支的毒株抗原变异最大，现用疫苗株与其抗原不匹配，迫切需要筛选新的疫苗株。
FMDV粒子由结构蛋白VP4、VP2、VP3和VP1各60分子组成的二十面体衣壳包裹一分子的单股正链RNA组成。病毒衣壳由结构蛋白VP4、VP2、VP3和VP1各60分子组成，其中病毒衣壳蛋白VP2、VP3和VP1上含有大量的抗原位点，他们是诱导机体产生保护性中和抗体的主要免疫基因，在免疫压力下高度易变，从而使病毒逃避宿主的免疫识别。O型FMDV表面至少含有5个抗原位点，其中结构蛋白VP1上抗原位点1的G-H环是FMDV诱导机体产生中和抗体最重要的抗原表位，在疫苗免疫保护方面发挥着非常重要的作用，而且该环也是FMDV基因组中变异频率最高的部位，其上一个或几个氨基酸的突变常引起病毒抗原性的变异，从而直接影响型内不同谱系病毒株之间交叉免疫保护。如中东地区流行的A型FMDV结构蛋白VP1第149位氨基酸(在G-H环内)发生突变导致抗原性发生了变化，使常用的A型FMD疫苗毒株与流行毒株抗原不匹配。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种交叉反应性提高、抗原谱拓展的重组O型口蹄疫疫苗毒株，在嵌合口蹄疫病毒VP1结构蛋白中插入口蹄疫Cathay拓扑型流行株VP1蛋白G-H环抗原表位得到，该G-H环抗原表位的插入显著提高了重组病毒对当前流行的Cathay拓扑型口蹄疫病毒的交叉反应性，拓展了重组口蹄疫病毒的抗原谱。
本发明提供了一种重组O型口蹄疫疫苗毒株，在口蹄疫病毒株rHN/TURVP1的基础上对VP1结构蛋白进行以下改造：重组表达插入有Cathay拓扑型FMDV O/GXCX/CHA/2018病毒株VP1中G-H环基因的FMDV O/TUR/5/2009株VP1结构蛋白。
优选的，所述Cathay拓扑型FMDV O/GXCX/CHA/2018病毒株VP1中G-H环的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
优选的，所述Cathay拓扑型FMDV O/GXCX/CHA/2018病毒株VP1中G-H环基因插入在FMDV O/TUR/5/2009株VP1结构蛋白G-H环的RGD上游或下游处。
优选的，所述插入有Cathay拓扑型FMDV O/GXCX/CHA/2018病毒株VP1中G-H环的FMDV O/TUR/5/2009株VP1结构蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
本发明提供了所述重组O型口蹄疫疫苗毒株的构建方法，包括以下步骤：
将Cathay拓扑型FMDV O/GXCX/CHA/2018病毒株VP1中G-H环基因序列合成至pSK-Z123/TURVP1半长质粒中，得到重组半长质粒；
从所述重组半长质粒中回收含重组VP1基因的5400bp的基因片段；
将所述含重组VP1基因的5400bp的基因片段克隆至FMDV重组全长质粒pOFS/TURVP1中，得到重组质粒pQUD；
将所述重组质粒pQUD进行病毒拯救，得到O型口蹄疫疫苗毒株。
优选的，所述Cathay拓扑型FMDV O/GXCX/CHA/2018病毒株VP1中G-H环基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
优选的，所述重组VP1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
本发明提供了所述重组O型口蹄疫疫苗毒株或所述构建方法得到的重组O型口蹄疫疫苗毒株在制备抗原谱扩展的O型口蹄疫疫苗中的应用。
优选的，所述O型口蹄疫疫苗的抗原谱包括以下至少一种类型的流行株：PanAsia、Mya98、Ind-2001和Cathay。
本发明提供了一种重组O型口蹄疫疫苗毒株，在口蹄疫病毒株rHN/TURVP1的基础上对VP1结构蛋白进行以下改造：重组表达插入有Cathay拓扑型FMDV O/GXCX/CHA/2018病毒株VP1中G-H环基因的FMDV O/TUR/5/2009株VP1结构蛋白。本发明利用反向遗传学手段在基因工程的FMDV VP1基因中插入Cathay拓扑型流行毒株24个氨基酸长G-H环抗原表位基因，再克隆至FMDV全长质粒pOFS/TURVP1中，得到重组全长质粒。线化的重组全长质粒转染表达T7 RNA聚合酶的细胞中拯救得到重组病毒rHN/TURVP1/GXGH24。结果表明，该重组病毒遗传稳定，G-H环的插入轻微的影响了重组病毒的复制性能，但显著(p<0.05)提高了重组病毒对Cathay拓扑型流行病毒的交叉反应性，拓展了FMDV的抗原谱。因此，本发明构建的重组病毒有潜力做O型FMD疫苗候选株，用于我国当前流行的所有O型FMD的有效防控。
附图说明
图1为重组质粒的构建示意图，注：深灰色部分表示FMDV O/TUR/5/2009株VP1基因，箭头表示插入的位置；
图2为重组质粒PstI酶切鉴定图；M:DNA标准marker；1:pQUD质粒用pstI酶切；
图3为转染重组质粒的BSR/T7细胞形态图，其中A:正常BSR/T7细胞，B：重组质粒pQUD转染60h后的BSR/T7细胞；
图4为间接免疫荧光结果；
图5为重组病毒和亲本病毒的一步生长曲线；
图6为FMDV特异性抗体的检测结果；
图7为免疫28天猪血清中和不同谱系病毒株的平均中和抗体结果，注：黑色虚线表示抗体滴度等于1.65log10；
图8为试验疫苗株与田间流行毒株的抗原匹配性分析(r1值)。
具体实施方式
本发明提供了一种重组O型口蹄疫疫苗毒株，在口蹄疫病毒株rHN/TURVP1的基础上对VP1结构蛋白进行以下改造：重组表达插入有Cathay拓扑型FMDV O/GXCX/CHA/2018病毒株VP1中G-H环基因的FMDV O/TUR/5/2009株VP1结构蛋白。
在本发明中，所述Cathay拓扑型FMDV O/GXCX/CHA/2018病毒株VP1中G-H环的氨基酸序列优选如SEQ ID NO:1(SNKYGDTSANNVRGDLHVLAKNAE)所示。
在本发明中，FMDV O/TUR/5/2009株VP1结构蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。鉴于FMDV结构蛋白VP1的许多位置均可容忍一些表位或者标签的插入，而不影响重组口蹄疫疫苗毒株的拯救。因此Cathay拓扑型FMDV O/GXCX/CHA/2018病毒株VP1中G-H环的插入的位置不做特殊限制，采用本领域所熟知的插入位置均可。所述Cathay拓扑型FMDV O/GXCX/CHA/2018病毒株VP1中G-H环插入在FMDV O/TUR/5/2009株VP1结构蛋白中G-H环的RGD上游或下游处。在口蹄疫病毒结构蛋白VP1G-H环RGD的上下游插入，其他任何位置不涉及，也就是在RGD的上下游能插入的位置均可。在本发明实施例中，所述Cathay拓扑型FMDV O/GXCX/CHA/2018病毒株VP1中G-H环插入在FMDV O/TUR/5/2009株VP1中RGD基序上游，具体在YNGNCK序列的G与N之间插入，具体见图1。所述插入有Cathay拓扑型FMDV O/GXCX/CHA/2018病毒株VP1中G-H环的FMDV O/TUR/5/2009株VP1结构蛋白的氨基酸序列优选如SEQ ID NO:3所示。
在本发明中，口蹄疫病毒株rHN/TURVP1在现有技术(Evaluation ofimmunogenicity and cross-reactive responses of vaccines prepared from twochimeric serotype O foot-and-mouth disease viruses inpigs and cattle)中披露。所述rHN/TURVP1/GXGH24毒株具有与亲本病毒相似的生长特性和复制能力，rHN/TURVP1/GXGH24中表达重组VP1蛋白没有明显影响标记FMDV的生长特性和复制能力；所述重组病毒株能在细胞上引起口蹄疫病毒典型的CPE能力，且经过10代传代结构蛋白和插入氨基酸序列未发生任何氨基酸突变，表明rHN/TURVP1/GXGH24具有较好的遗传稳定性。此外，所述rHN/TURVP1/GXGH24毒株制备的疫苗显著提高了重组病毒对Cathay拓扑型流行病毒的交叉反应性，拓展了FMDV的抗原谱，可用于发展抗原谱拓展的O型FMD疫苗候选株，利于实现对当前流行的O型FMD的有效免疫预防。
本发明提供了所述重组O型口蹄疫疫苗毒株的构建方法，包括以下步骤：
将Cathay拓扑型FMDV O/GXCX/CHA/2018病毒株VP1中G-H环基因核苷酸序列基因合成至pSK-Z123/TURVP1半长质粒中，得到重组半长质粒；
从所述重组半长质粒中回收含重组VP1基因的5400bp长的片段；
将所述含重组VP1基因的5400bp长的片段克隆至重组全长质粒pOFS/TURVP1中，得到重组质粒pQUD；
将所述重组质粒pQUD进行病毒拯救，得到O型口蹄疫疫苗毒株。
本发明将Cathay拓扑型FMDV O/GXCX/CHA/2018病毒株VP1中G-H环基因核苷酸序列合成至pSK-Z123/TURVP1半长质粒中，得到重组半长质粒。
在本发明中，所述pSK-Z123/TURVP1半长质粒为包含FMDV O/TUR/5/2009株VP1结构蛋白基因的重组质粒，在现有技术中公开(Evaluation of immunogenicity and cross-reactive responses of vaccines prepared from two chimeric serotype O foot-and-mouth disease viruses in pigs and cattle,2022)。
在本发明中，所述Cathay拓扑型FMDV O/GXCX/CHA/2018病毒株VP1中G-H环核苷酸序列优选如SEQ ID NO:2所示。本发明对所述克隆的方法没有特殊限制，采用本领域所述的克隆方法即可。在本发明实施例中，委托基因合成公司合成重组半长质粒。
得到重组半长质粒后，本发明从所述重组半长质粒中回收含重组VP1基因的5400bp长的DNA片段。
在本发明中，所述回收的方法优选包括酶切法。所述酶切法包括用SpeⅠ和BglⅡ限制性内切酶消化，收集5400bp的DNA片段。所述重组VP1基因的核苷酸序列优选如SEQ IDNO:4所示。
得到含重组VP1基因的5400bp长的DNA片段后，本发明将所述含重组VP1基因的5400bp长的DNA片段克隆至FMDV重组全长质粒pOFS/TURVP1中，得到重组质粒pQUD。
本发明对所述克隆的方法没有特殊限制，采用本领所熟知的克隆方法即可，例如酶切、连接方法。得到重组质粒pQUD后，优选还包括对重组质粒pQUD进行鉴定。所述鉴定方法优选为用PstI内切酶进行酶切，结果切出与预期大小相符的目的条带，说明成功得到重组质粒pQUD。
得到重组质粒pQUD后，本发明将所述重组质粒pQUD进行病毒拯救，得到O型口蹄疫疫苗毒株。
本发明对所述病毒拯救的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的病毒拯救的方法即可，例如线性化处理重组质粒pQUD后转染至表达T7RNA聚合酶的细胞中培养，待细胞病变后，收集病毒液，命名为rHN/TURVP1/GXGH24。所述病毒拯救的方法优选为将所述重组质粒pQUD进行线性化处理，然后转染BSR/T7细胞。
得到重组O型口蹄疫疫苗毒株后，优选利用RT-PCR和间接免疫荧光检测鉴定重组病毒情况。结果表明，所述O型口蹄疫疫苗毒株包含G-H环基因的插入。
在本发明中，所述重组O型口蹄疫疫苗毒株具有良好的遗传稳定性，在重组病毒连续传10代，测序验证结果表明结构蛋白和插入氨基酸未发生任何氨基酸突变。同时一步生长曲线结果表明，所述重组O型口蹄疫疫苗毒株与亲本毒株相比，复制滴度略有下降，但未达到显著性差异。
本发明提供了所述重组O型口蹄疫疫苗毒株或所述构建方法得到的重组O型口蹄疫疫苗毒株在制备抗原谱扩展的O型口蹄疫疫苗中的应用。
在本发明中，所述O型口蹄疫疫苗还包括佐剂。所述重组口蹄疫病毒和佐剂的体积比为45～47:53～55，更优选为46:54。所述佐剂优选为ISA201佐剂。
在本发明中，所述疫苗的制备方法优选包括以下步骤：所述重组口蹄疫病毒进行灭活后再与佐剂按比例混合，至两者不分层，得到疫苗成品。所述灭活的方式优选为将收集的病毒液用终浓度1～1.2％BEI溶液混合，在30℃灭活28h。所述混合时，优选佐剂进行37℃预热处理。所述疫苗优选在4～8℃下保存。
在本发明中，所述应用中制备的O型口蹄疫疫苗免疫猪14、21和28天产生的LPB-E抗体滴度均高于亲本病毒rHN/TURVP1免疫猪产生的LPB-E抗体滴度，说明24aa长G-H环基因的插入提高了重组病毒的免疫原性。
在本发明中，所述O型口蹄疫疫苗的抗原谱优选包括以下至少一种拓扑类型的流行病毒株：PanAsia、Mya98、Ind-2001和Cathay。本发明实施例表明，中和抗体实验结果表明，和亲本病毒相比，重组病毒rHN/TURVP1/GXGH24免疫猪28天后均能对上述4个谱系流行毒株产生高的、保护性的平均中和抗体(>2.1log10)，说明Cathay拓扑型流行毒株24aa长G-H环基因的插入显著提高了(p<0.05)重组FMDV对该谱系病毒的交叉反应性。
下面结合实施例对本发明提供的一种交叉反应性提高、抗原谱拓展的O型口蹄疫疫苗毒株及其构建方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
重组FMDV的半长质粒pSK-Z123/TURVP1和全长质粒pOFS/TURVP1(见李平花2022发表的文章Evaluation ofimmunogenicity and cross-reactive responses of vaccinesprepared from two chimeric serotype O foot-and-mouth disease viruses in pigsand cattle中共开过)用于重组全长质粒的构建。O型FMDV株O/GXCX/CHA/2018(Cathay拓扑型)、O/HB/HK/99(PanAsia谱系)、O/XJ/CHA/2017(Ind-2001谱系)、O/NXYCh/CHA/2018(Mya-98谱系)为我国公开菌株，其中O/HB/HK/99在口蹄疫编著(刘湘涛等主编)P29页公开；O/XJ/CHA/2017(MF461724.1)、O/NXYCh/CHA/2018(MH791315.1)、O/GXCX/CHA/2018(MH791316.1)和O/GZSD/CHA/2018(MG840803.1)在Genebank中公开过，全长质粒pOFS/TURVP1转染拯救的病毒rHN/TURVP1作为亲本病毒(见李平花2022发表的文章Evaluation ofimmunogenicityand cross-reactive responses of vaccines prepared from two chimeric serotypeOfoot-and-mouth disease viruses inpigs and cattle中共开过))。
实施例1
1、重组全长克隆的构建
以插入FMDV O/TUR/5/2009株VP1结构蛋白的半长质粒pSK-Z123/TURVP1为骨架，根据Genebank中公布的Cathay拓扑型FMDV O/GXCX/CHA/2018病毒株VP1中G-H环核苷酸序列，设计合成含该病毒24个氨基酸(amino acid,aa)长G-H环基因插入的重组质粒pSK-Z123/TURVP1/GXGH(金唯志生物技术有限公司合成)。该质粒用SpeⅠ和BglⅡ限制性内切酶消化，回收约5400bp的DNA片段，并将其插入用同样酶消化的pOFS/TURVP1质粒中，得到重组质粒pQUD。该质粒用Pst I内切酶进行酶切鉴定，结果切出与预期大小相符的目的条带(见图2)。酶切鉴定正确的重组质粒送金唯智生物技术有限公司进行序列测定，结果表明构建的重组质粒含24aa G-H环的插入。其中插入的24aa G-H环的氨基酸序列见SEQ ID NO:1，核苷酸序列见SEQ ID NO:2所示；pOFS/TURVP1和pQUD的VP1基因核苷酸序列分别见SEQ IDNO:5和SEQ ID NO:4，对应的氨基酸序列见SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:3(见表1)。
表1重组质粒对应的部分序列名称和病毒
2、重组FMDV的拯救
常规方法制备的全长质粒pQUD用Not I内切酶线化后，片段回收试剂盒纯化回收作为模板，并用脂质体LipofectamineTM2000介导转染至80％～90％满的BSR/T7细胞(置六孔板培养)。转染后5h加入2mL完全培养基，置37℃5％CO2培养箱继续培养。转染后每日观察细胞出现致细胞病变(Cytophathic Effect，CPE)的情况。培养2～3天后收集转染细胞，反复冻融3次后，连续传代。
结果表明：重组全长质粒pQUD转染BSR/T7细胞48h后，约50％的细胞出现典型的CPE，即纤维状分布的细胞变大、变圆(图3)，对照细胞除个别死细胞外，形态正常。转染72h后收集转染细胞，拯救得到的重组病毒命名为rHN/TURVP1/GXGH24。
3、RT-PCR鉴定
转染的细胞上清用RNAasy Mini Kit提取细胞毒总RNA，用OZ1490(+)/OZ3980(-)引物对(引物序列见表2)RT-PCR扩增含结构蛋白VP1基因的特定片段，凝胶纯化回收后送金唯智生物有限公司测序，验证重组病毒的正确性。测序结果表明：重组病毒rHN/TURVP1/GXGH24含有预期的插入，说明本发明成功构建了含靶标基因插入的重组FMDV。
表2RT-PCR所用的引物
4、间接免疫荧光
BHK-21单层细胞(12孔板)生长至70％～80％满时分别接种亲本病毒和重组病毒。接种病毒6h后用间接免疫荧光检测FMDV非结构蛋白3A的表达。详细步骤：(1)弃接种病毒的细胞培养液，PBS(pH＝7.4)漂洗3次，加入4％冰冷的多聚甲醛，室温固定30min；(2)PBS漂洗3次，加入5％BSA室温封闭30min；(3)PBS漂洗3次后分别加入1:500稀释的抗FMDV非结构蛋白3A单抗37℃孵育1h；(4)PBS漂洗5次，加入1:100稀释的FITC标记的IgG二抗，37℃孵育1h，PBS漂洗5次，置共聚焦荧光显微镜下拍照，同时设正常细胞对照。结果表明：接种亲本病毒rHN/TURVP1和重组病毒rHN/TURVP1/GXGH24的BHK-21细胞均能与3A单抗作用，出现特异的绿色荧光，而对照细胞与3A单抗作用均看不到任何可见荧光(见图4)，说明本发明成功拯救了重组FMDV，G-H环基因的插入没有影响感染性重组FMDV的拯救。
5、重组病毒的生长特性
5.1、拯救病毒的遗传稳定性分析
将亲本病毒和转染上清按10％接种量接种长满BHK-21细胞的T25细胞瓶，待接种转染上清的细胞95％出现典型的致细胞病变时收获细胞，反复冻融3次后继续连续传代，观察第5代后病毒接种细胞致95～100％以上细胞出现典型CPE的时间，并对第5和10代病毒进行RT-PCR，检测拯救的重组病毒结构蛋白氨基酸的变化。连续传代的结果标明：拯救的重组病毒连续传至第6代出现典型CPE的时间趋于稳定(12-14h)。重组病毒连续传10代，测序验证结果表明结构蛋白和插入氨基酸未发生任何氨基酸突变，显示出良好的遗传稳定性。
5.2重组病毒的一步生长曲线
将第6代亲本病毒rHN/TURVP1和重组病毒rHN/TURVP1/GXGH24分别做10倍系列稀释，然后将不同稀释度病毒分别接种长满的单层BHK-21细胞(200ul/孔，6孔板)，置于37℃培养箱，每10min摇动一次，1h后加入2mL黄芪胶混合液静止培养，48h后吸弃培养液，用MEM洗涤1～2次后，加入固定液室温固定30min后结晶紫染色1h，清水冲洗，计算每个病毒的噬斑形成单位(PFU/ml)。将第6代亲本病毒和重组病毒以1×106PFU/ml病毒感染量接种长满的单层BHK-21细胞(25mL培养瓶)，吸附1h后弃接种的病毒液，用MEM洗2次后，加5ml MEM培养基置于37℃培养箱继续培养。接种后4h、8h、12h、16h和20h收取样品，反复冻融3次后在BHK-21单层细胞上(6孔板)按照上述方法测定病毒的滴度(PFU/mL)(实验进行2次重复)，绘制病毒的一步生长曲线。结果表明：插入24aa的重组病毒与亲本病毒复制动力学曲线相似，但插入轻微的影响了重组病毒在BHK-21细胞上的复制滴度，如图5所示。
6、FMDV灭活疫苗的制备
单层贴壁BHK-21细胞繁殖亲本病毒和重组病毒各200mL，反复冻融3次后，4℃6000rpm/min离心1h，去除细胞碎片。收集的病毒上清用1-1.2％BEI 30℃灭活28h。灭活后的病毒抗原用细胞盲传4代，进行灭活安全检验。检验合格后，蔗糖密度梯度离心法纯化病毒粒子，用液相色谱仪确定病毒抗原的146S含量。将ISA201佐剂置于37℃恒温水浴锅预热，按抗原:佐剂体积比＝46:54的比例将适量的佐剂缓慢加入病毒抗原中，缓慢摇振，直至抗原和佐剂不分层，将配好的疫苗制品(每头份146S抗原浓度为6μg/mL)置于4～8℃保存备用。
7、动物实验
选取90日龄左右健康易感猪12头(O型口蹄疫液相阻断ELISA抗体效价＜1:6，3ABC抗体阴性)，分2组，每组6头。一组免疫接种亲本病毒rHN/TURVP1疫苗，一组免疫接种rHN//TURVP1/GXGH24病毒疫苗，接种剂量为2mL/头(6μg)。所有猪免疫前和免疫后每周采血，收集血清置-20℃待用。
8、FMDV结构蛋白抗体的检测
用O型FMDV液相阻断ELISA(LPB-ELISA)试剂盒(中国农业科学院兰州兽医研究所生产)检测所有猪免疫前和免疫后每周的血清，检测疫苗免疫后动物产生的结构蛋白抗体效价。具体步骤如下：
①在U型反应板上，用PBST倍比稀释待检血清，50μL/孔；在第11列稀释阳性对照血清，从1:2稀释至1:256；同时设置阴性对照血清，从1:2稀释至1:4；设置4孔全病毒对照。
②将病毒抗原用PBST稀释至工作浓度，以50μL/孔的量加至各孔，封板，振荡37℃温育1.5h。
③将抗原抗体混合物从U型反应板上按次序转移至已包被口蹄疫O型兔抗的ELISA板上，50μL/孔，封板，振荡37℃温育1h。
④用PBST洗板5次，拍干，按50μL/孔加入口蹄疫O型豚鼠抗体工作液(红色)，封板，振荡37℃温育30min。
⑤同上洗板5次，拍干，按50μL/孔加兔抗豚鼠IgG-HRP工作液(蓝色)，封板，振荡37℃温育30min。
⑥同上洗板5次，拍干。将TMB底物A溶液和B溶液以1:1比例混匀，加入混匀后底物溶液50μL/孔，置37℃显示15min。
⑦显示反应结束后，加入终止液50μL/孔，终止反应，在酶标仪上读取OD450nm值。
⑧抗体效价判定：病毒抗原对照4孔，弃去最高和最低OD450nm值，计算剩余2孔的平均OD450nm值，再除以2，即为临界值，表示阻断50％反应的对照OD450nm值。检测孔OD450nm值大于临界值为阴性孔，小于为阳性孔。若临界值与稀释倍数最高阳性孔的OD450nm值相同，则以被检样本阳性孔的最高稀释倍数作为该份血清的抗体效价；若临界值处于两个稀释孔OD450nm值之间，抗体效价取相邻阳性孔和阴性孔稀释倍数的反对数中间值。其中测定的抗体效价大于1:128免疫动物基本均可获得保护。
结果表明：两个疫苗免疫28天后均诱导猪产生了保护性的LPB-E抗体(>1:128)，但重组病毒rHN/TURVP1/SCGH疫苗免疫猪14、21和28天产生的LPB-E抗体滴度均高于亲本病毒rHN/TURVP1免疫猪产生的LPB-E抗体滴度，说明24aa长G-H环基因的插入提高了重组病毒的免疫原性(见图6)。
8、病毒中和实验
用微量病毒中和实验检测2个疫苗免疫动物28天后的血清中和我国流行的四个谱系FMDV株O/GXCX/CHA/2018(Cathay)、O/GZSD/CHA/2018、(Cathay)、O/HB/HK/99(PanAsia谱系)、O/XJKS/2017(Ind-2001谱系)和O/NXYCh/CHA/2018(Mya-98谱系)的交叉中和抗体效价，具体步骤如下：
(1)免疫血清56℃30min灭活；
(2)取灭活血清，在96孔微量细胞培养板上，用无血清细胞培养液稀释血清，从1:4开始作一系列倍比稀释，每孔含量为50μL，每个稀释度4孔；
(3)取-70℃冰箱保存的病毒液，按测定的毒价作200TCID50稀释(与等量血清混合后，其毒价为100TCID50)；
(4)含稀释血清的96空板中每孔加入50μL已稀释好的病毒液，置5％CO237℃温箱中和1h；
(5)血清和病毒作用1h后每孔加入50μL细胞悬液(24h内长满单层为宜)，用透明胶带封好盖后置37℃温箱培养。48h后，显微镜下作适当判断，72h后固定染色；
(6)每次试验每块培养板都必须设立下列对照：
①阳性和阴性血清对照：阳性和阴性血清对照各设4孔，每孔50μL，阳性孔应呈兰色，阴性孔不着色。
②病毒回归试验：先将病毒作0.1TCID50、1TCID50、10TCID50、100TCID50稀释，每个稀释度4孔，每孔50μl。然后每孔50μl细胞悬液，补加50μl稀释液。0.1TCID50应呈兰色，100TCID50不着色，否则该实验不成立。
③正常细胞对照：为避免培养板本身引起试验误差，应在每块板上均设立4孔不接种病毒和血清的正常细胞对照，该对照应在整个试验中一直保持良好的形态和生活特征，染色呈兰色。
(7)结果判定和计算
当病毒回归试验、阳性、阴性、正常细胞对照全部成立时，才能进行判定。被检血清孔出现100％CPE判阴性，50％以上细胞出现保护者为阳性；固定病毒稀释血清中和试验的结果计算，以血清/病毒混合物的50％终点表示血清的最终稀释度，用Karber法计算血清中和滴度，中和滴度1:45或更高为阳性，1:16-1:32为可疑须重做，滴度为1:11或更低为阴性。
中和实验的结果表明：亲本病毒疫苗免疫猪28天均能对O/NXYCh/CHA/2018、O/HB/HK/99和O/XJKS/2017谱系流行毒株产生保护性的平均中和抗体(>2.1log10)，但不能对Cathay拓扑型毒株O/GXCX/CHA/2018和O/GZSD/CHA/2018产生保护性的平均中和抗体(<1.0log10)，而重组病毒rHN/TURVP1/GXGH24免疫猪28天后均能对4个谱系流行毒株产生保护性的平均中和抗体(>2.1log10)(见图7)，说明Cathay拓扑型流行毒株24aa长G-H环基因的插入显著提高了(p<0.05)重组FMDV对该谱系病毒的交叉反应性。
9、抗原匹配性分析(r值)
用微量中和实验检测的中和抗体效价，评价制苗毒株与流行毒株的抗原匹配性。FMDV的抗原匹配性关系常用r1值判定，r1＝中和异源病毒的抗体效价/中和同源病毒的抗体效价，r1值愈接近1，毒株间抗原关系愈靠近；反之，抗原关系疏远，毒株差异较大。其中当r1值≥0.3时，说明制备参考血清的抗原和另一抗原相似，该疫苗可有效抵御另一毒株的攻击，适用于制造疫苗；当r值＜0.3时，则说明制备参考血清的抗原和另一抗原差异显著，该疫苗不能有效抵御另一毒株的攻击，不适用于制造疫苗。
抗原匹配性分析结果表明：亲本病毒rHN/TURVP1与O/HB/HK/99(PanAsia)、O/HBCZ/2019(Mya98)、O/XJKS/2017/(Ind-2001)抗原匹配(r1值均＞0.3)，但与近年流行的FMDV O/GXCX/CHA/2018(Cathay)抗原不匹配(r1值＜0.3)，而重组病毒rHN/TURVP1/GXGH24不仅与O/HB/HK/99、O/HBCZ/2019、O/XJKS/2017病毒株抗原匹配(r1＞0.3)，而且与近几年流行的FMDV O/GXCX/CHA/2018株的抗原也匹配(r1＞0.3)(见图8)，表明24aa长G-H环基因的插入拓展了重组FMDV的抗原谱。
本发明的研究结果表明：在亲本FMDV rHN/TURVP1的骨架上插入Cathay拓扑型流行毒O/GXCX/CHA/201824aa长G-H抗原表位基因的重组病毒遗传稳定，G-H环的插入轻微的影响了重组病毒的复制性能，但显著提高了重组病毒对Cathay拓扑型流行病毒的交叉反应性，拓展了FMDV的抗原谱。因此，本发明构建的重组FMDV rHN/TURVP1/GXGH24有潜力做O型FMD疫苗候选株，用于我国当前流行的所有O型FMD的有效防控。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种重组O型口蹄疫疫苗毒株，其特征在于，在口蹄疫病毒株rHN/TURVP1的基础上对VP1结构蛋白进行以下改造：重组表达插入有Cathay拓扑型FMDV O/GXCX/CHA/2018病毒株VP1中G-H环基因的FMDV O/TUR/5/2009株VP1结构蛋白。
2.根据权利要求1所述重组O型口蹄疫疫苗毒株，其特征在于，所述Cathay拓扑型FMDVO/GXCX/CHA/2018病毒株VP1中G-H环的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
3.根据权利要求1所述重组O型口蹄疫疫苗毒株，其特征在于，所述Cathay拓扑型FMDVO/GXCX/CHA/2018病毒株VP1中G-H环插入在FMDV O/TUR/5/2009株VP1结构蛋白G-H环的RGD上游或下游处。
4.根据权利要求1～3中任意一项所述重组O型口蹄疫疫苗毒株，其特征在于，所述插入有Cathay拓扑型FMDV O/GXCX/CHA/2018病毒株VP1中G-H环基因的FMDV O/TUR/5/2009株VP1结构蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
5.权利要求1～4中任意一项所述重组O型口蹄疫疫苗毒株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
将Cathay拓扑型FMDV O/GXCX/CHA/2018病毒株VP1中G-H环基因序列合成至pSK-Z123/TURVP1半长质粒中，得到重组半长质粒；
从所述重组半长质粒中回收含重组VP1基因的5400bp的基因片段；
将所述含重组VP1基因的5400bp的基因片段克隆至FMDV重组全长质粒pOFS/TURVP1中，得到重组质粒pQUD；
将所述重组质粒pQUD进行病毒拯救，得到重组O型口蹄疫疫苗毒株。
6.根据权利要求5所述构建方法，其特征在于，所述Cathay拓扑型FMDV O/GXCX/CHA/2018病毒株VP1中G-H环核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
7.根据权利要求5所述构建方法，其特征在于，所述重组VP1基因的核苷酸序列如SEQID NO:4所示。
8.权利要求1～4中任意一项所述重组O型口蹄疫疫苗毒株或权利要求5～7中任意一项所述构建方法得到的重组O型口蹄疫疫苗毒株在制备抗原谱扩展的O型口蹄疫疫苗中的应用。
9.根据权利要求8所述应用，其特征在于，所述重组O型口蹄疫疫苗的抗原谱包括以下至少一种类型的流行株：PanAsia、Mya98、Ind-2001和Cathay。
10.一种抗原谱扩展的O型口蹄疫疫苗，其特征在于，包括权利要求1～4中任意一项所述重组O型口蹄疫疫苗毒株或权利要求5～7中任意一项所述构建方法得到的重组O型口蹄疫疫苗毒株和佐剂。
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