CN117679205A - 管状类支气管结构体及其构建方法 - Google Patents

管状类支气管结构体及其构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种管状类支气管结构体及其构建方法。所述方法包括：A、制备打印墨水；B、体外培养用于打印的细胞，得到细胞培养液；C、将打印墨水与细胞培养液分别连接生物打印机的不同喷头，共同打印到缠绕棒上，形成无缝的管状组织，然后去掉缠绕棒，即为中空的管状类组织结构体。该方法通过水平缠绕式细胞3D打印技术形成结构和细胞/材料成分可控的管状结构。该管状类结构与人体脉管形状尺寸接近，并且具有适应人体所需求的力学与生物学性能，具备临床应用潜力，可用于药物检测、组织工程、再生医学、体外生理模型/病理模型/药理模型构建、组织/器官/人体芯片等方面。

Description

管状类支气管结构体及其构建方法
本发明是申请号CN201910549415.7，发明名称为“管状类血管结构体及其构建方法”的中国专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及生物医学工程领域，具体地说，涉及一种管状类支气管结构体及其构建方法。
背景技术
人体脉管系统分布广泛，提供人体内各种器官的营养物质、氧气与激素等的输运，对全身组织器官的生长发育，功能维持起着重要的作用。
心血管系统为人体内各种器官养分与氧气交换。在特定的心血管疾病中，有时需要将坏死的血管进行替换移植，而目前作为手术移植使用的人工血管仍无法完美的满足生物兼容性高、力学性能好、具收缩舒张能力等要求。举例而言，目前用于冠状血管移植的直径小于6mm的人工血管仍存在低通畅率的问题，同时，现阶段对于复杂形状的血管结构也很难进行客制化与制造。由此，血管构建也一直是生物制造组织与器官中的一个普遍问题。
人体胆管主要作用将肝细胞分泌的胆汁输送到十二指肠，帮助消化脂肪类食物。胆管堵塞引起胆汁淤积，其引起的急性梗阻性化脓性胆管炎，可危及生命。此时，使用生物工程胆管可以作为肝移植外的另一种选择。因而构造出人体胆管的构造、结构特性、标志物和功能(碱性磷酸酶和γ-谷酰基转移酶活性)等特征的生物工程胆管也成为一大需求。
人体气管作为连接喉与支气管之间的管道，不仅是空气的通道，而且具有防御、清除异物、调节空气温度和湿度的作用。喉气管狭窄或缺损是一种严重影响人们生活质量的致残性疾病。通常需要对病变部位进行切除手术，切除术后的愈合问题是临床一大难题。而构建具备气管结构特征与功能的生物工程气管可能是解决这一难题的关键。
人体胰管引流胰液至十二指肠，帮助消化食物。胰管堵塞致胰液引流不畅，可诱发急性胰腺炎。此外，人体还有其他管道类器官诸如输尿管、淋巴管、肠管等，一旦这些脉管器官发生病变，可能严重影响人体健康。而目前应用管状类生物结构体进行体外移植已经成为一种常见的方法。由此而言，构建具备一定力学性能与生物学性能相融合的管状类组织，成为临床一大需求，同时也是组织工程的研究焦点。
生物3D打印，定义为将含有活性细胞的材料用于3D打印技术。生物打印技术，可以根据仿生原理和计算机设计，将大量活性细胞和活性生物材料排布在预先设计的空间位置，在人体多种组织和脏器构建中表现出巨大优势。然而打印具备个性化结构尺寸(直径，厚度，长度，曲率等)并具有相应的力学及生物学性能等适应临床需求的管状类组织也仍旧是亟待解决的问题。因此，对于较复杂的体外组织，特别是较长的管状结构，如，血管、气管、胆管、喉管等，亟需开发新的细胞打印工艺。实现多种材料的分别控制和可控输送，以及较长管状结构的稳定制造。
发明内容
本发明的目的是提供一种管状类组织结构体及其构建方法。
本发明构思如下：采用水平缠绕式细胞3D打印技术，控制打印生物墨水、交联剂和活性细胞等物质的混合和输送。采用缓慢旋转的棒状收集装置作为成型平台，构建打印墨水水平缠绕模式，形成长度较长的中空管状类组织结构体。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种管状类组织结构体的构建方法，包括以下步骤：
A、制备打印墨水；
B、体外培养用于打印的细胞，得到细胞培养液；
C、将打印墨水与细胞培养液分别连接生物打印机的不同喷头，共同打印到缠绕棒上，形成无缝的管状组织，然后去掉缠绕棒，即为中空的管状类组织结构体。
其中，打印墨水的材料为细胞相容性及生物相容性好的温敏材料和/或生物材料；所述生物材料采用一种或多种天然生物材料和/或人工合成生物材料。
所述天然生物材料选自明胶、明胶衍生物、藻酸盐、藻酸盐衍生物、纤维素、纤维素衍生材料、琼脂、基质胶、胶原、胶原衍生物、氨基酸、氨基酸衍生物、蛋白多糖、蛋白多糖衍生物、糖蛋白及衍生材料、透明质酸、透明质酸衍生物、壳聚糖、壳聚糖衍生物、DNA水凝胶材料、层连接蛋白、纤连接蛋白、纤维蛋白、丝素蛋白、丝素蛋白衍生物等中的至少一种。优选纤维蛋白衍生物。
所述人工合成生物材料选自聚丙烯、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚丙交酯、聚乙交酯、聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚羟基酸、聚乳酸醇酸共聚物、聚二甲基硅氧烷、聚酸酐、聚酸酯、聚酰胺、聚氨基酸、聚缩醛、聚氰基丙烯酸酯、聚氨基甲酸酯、聚吡咯、聚酯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯、聚碳酸酯、聚氧化乙烯等中的至少一种。优选聚乳酸或乳酸-羟基乙酸共聚物。
前述的方法，步骤B中所述细胞可以是血管细胞，所述血管细胞选自血管内皮细胞、血管内皮祖细胞、微血管内皮细胞、血管平滑肌细胞、血管成纤维细胞、间充质干细胞、周细胞等中的至少一种。优选血管内皮细胞和间充质干细胞。
其中，所述血管细胞是组织中提取获得的，或者由干细胞分化而来的。
前述方法中使用的缠绕棒可以是玻璃棒。
优选地，喷头与缠绕棒之间的距离为3-4mm。
带动缠绕棒旋转的电机驱动器转速为0-10000cts/s，而带动打印喷头平动的电机驱动器转速为0-10000cts/s。
第二方面，本发明提供按照上述方法构建得到的管状类组织结构体。
本发明提供的管状类组织结构体，可用于构建管状结构的三维体外生物学模型，进行生理学、病理学的分析与研究，以及体外药物测试。
第三方面，本发明提供一种管状类血管结构体的构建方法，包括以下步骤：
1)将0.02g牛血纤维蛋白原(MACKLIN，F823833-1g)溶于500μl的DMEM/F-12 HEPES(MACKLIN，F6519-500ml)培养液中，得到纤维蛋白原溶液；
2)将人脐静脉内皮细胞HUVEC用EBM-2 Endothelial Growth Basal Medium(LONZA,CC-3156)进行体外培养并传代，打印前培养至第四代，用PBS冲洗细胞，然后向培养瓶内加入Trypsin-EDTA(Sigma，59417C-500ML)，于37℃培养箱中消化2分钟，然后加入EBM(LONZA,CC-3156)培养液终止消化；放入离心机进行离心，弃上清，用培养液重悬细胞，计数后再次离心，弃上清，向细胞沉淀中加入步骤1)的纤维蛋白原溶液，得到4×106cells/ml的含细胞纤维蛋白原溶液，作为打印试剂1；
3)用DMEM/F-12 HEPES(MACKLIN，F6519-500ml)培养液配制20U/ml的凝血酶母液(牛凝血酶)；打印前，向0.12g无水氯化钙(可替换成戊二醛、碳化二亚胺或氨基乙酸)中加入500μl的凝血酶母液，溶解后放入37℃培养箱孵育5分钟，作为打印试剂2；
4)将打印试剂1和2分别连接生物打印机的不同喷头，共同打印到缠绕棒上，形成无缝的管状组织，然后去掉缠绕棒，即得中空的管状类血管结构体。
其中，步骤4)中喷头与缠绕棒之间的距离为3-4mm。
带动缠绕棒旋转的电动驱动器转速为0-10000cts/s(优选100cts/s，即100秒一转)，而带动打印喷头平动的电机驱动器转速为0-10000cts/s(优选80cts/s，即125秒一转)。
第四方面，本发明提供一种管状类胆管结构体的构建方法，包括以下步骤：
1)将0.02g牛血纤维蛋白原溶于500μl的DMEM/F-12 HEPES(MACKLIN，F6519-500ml)培养液中，得到纤维蛋白原溶液；
2)打印试剂1的制备：
①hPSCs细胞(人多功能干细胞)培养：取适量的hPSCs细胞(Stemcell，5795)进行复苏培养，所用培养液为：activin A 100ng/ml,bFGF 80ng/ml,BMP-4 10ng/ml,LY29400210μM和CHIR99021 3μM，37℃过夜培养；
②hPSCs向DE(定形内胚层)细胞的分化培养：次日，用添加有activin A(Abcam，ab113316)100ng/ml,bFGF(Beyotime，P6443-100μg)80ng/ml,BMP-4 10(Sigma，RAB0030-1KT)ng/ml和LY294002(CST，9901S)10μM的CDM–PVA培养液替换①的培养液，37℃过夜培养；第三天，用添加有activin A(Abcam，ab113316)100ng/ml和bFGF(Beyotime，P6443-100μg)80ng/ml的RPMI/B27培养液，替换旧培养液；
③DE细胞向FP细胞(前肠祖细胞)的分化：第4-6天，用添加有activin A(Abcam，ab113316)50ng/ml的RPMI(MACKLIN，R6516-500ml)/B27(Sigma，SCM013)培养液替换旧培养液；第7-8天，用添加有activin A 50ng/ml的RPMI/B27培养液替换旧培养液；
④FP细胞向HB细胞(肝母细胞)的分化：第9-12天，用含有SB-431542(Sigma，S4317-5MG)10μM和BMP-4(Sigma，RAB0030-1KT)50ng/ml的RPMI/B27培养液替换旧培养液；通过测定HNF4A、AFP和TBX3基因的表达与流式分析检测HB细胞的分化；
⑤HB细胞向CP(胆管上皮祖细胞)的分化：第13-16天，用含有FGF10(DLDEVELOP，DL-FGF10-Hu)50ng/ml,activin A 50ng/ml和retinoic acid(Beyotime，AF2398)3μM的RPMI/B27培养液替换旧培养液，通过测定Sox9基因的表达，检测CP细胞的分化；
⑥用PBS冲洗CP细胞，添加细胞消化液，在37℃培养箱内孵育20分钟，用移液管收集细胞；将细胞转移至RPMI/B27培养液中，重悬细胞，然后室温下，离心3分钟，弃上清，用含有EGF(peprotech，AF-100-15-100)20ng/ml和Rho激酶抑制剂Y-2763210μm的50％Matrigel基质凝胶(BD，XYHZ-267)中重悬细胞，计数后再次离心，弃上清，向细胞沉淀中加入步骤1)的纤维蛋白原溶液，得到4×106cells/ml的含细胞纤维蛋白原溶液，作为打印试剂1；
3)用DMEM/F-12 HEPES培养液配制20U/ml的凝血酶母液(牛凝血酶)；打印前，向0.12g无水氯化钙(可替换成戊二醛、碳化二亚胺或氨基乙酸)中加入500μl的凝血酶母液，溶解后放入37℃培养箱孵育5分钟，作为打印试剂2；
4)将打印试剂1和2分别连接生物打印机的不同喷头，共同打印到缠绕棒上，形成无缝的管状组织，然后去掉缠绕棒，得到中空的管状三维结构体；
5)将步骤4)的管状三维结构体置于含EGF 20ng/ml的WE(Sigma，W2895-1MG)培养液中，每2天更换培养基，培养2-4天后，形成管状类胆管结构体。
其中，步骤4)中喷头与缠绕棒之间的距离为3-4mm。
带动缠绕棒旋转的电动驱动器转速为0-10000cts/s(优选100cts/s，即100秒一转)，而带动打印喷头平动的电机驱动器转速为0-10000cts/s(优选80cts/s，即125秒一转)。
本发明中，纤维蛋白水凝胶可以通过纤维蛋白原与凝血酶反应而得到，属于酶交联的水凝胶。具体机理为：凝血酶混和纤维蛋白原后将会切除纤维蛋白原上α和β链末端的两段多肽，形成纤维蛋白单体，而纤维蛋白单体因氢键的作用而自主交联形成纤维蛋白水凝胶。
本发明中还可应用其他如纤维蛋白和明胶混合物、海藻酸和胶原混合物等，对上述纤维蛋白原-凝血酶-氯化钙这一体系进行替换。
第五方面，本发明提供一种管状类支气管结构体的构建方法，包括以下步骤：
1)制备打印墨水
将明胶(Sigma-Aldrich，G1890)和海藻酸钠(Sigma-Aldrich，A0682)分别溶解在0.5％w/v的氯化钠溶液中，形成浓度为15％的明胶溶液和4％的海藻酸钠溶液；将600μL的明胶溶液和400μL的海藻酸钠溶液混合，所得混合液于37℃保温20分钟，得到打印墨水；
2)打印细胞的制备
采用含10％ FBS的H-DMEM培养基(Hyclone,SH30022.01)分别培养人肺脏支气管上皮细胞和人胎肺成纤维细胞；待细胞生长铺满皿底80％～90％时，用含0.04％EDTA和0.25％胰酶(TargetMol，T0517-50mg)的酶液消化细胞，按1∶6比例传代，隔天更换培养液；打印前培养至第四代；然后，将人肺脏支气管上皮细胞和人胎肺成纤维细胞按5∶1的比例混合，得到细胞密度为6×105个/ml的细胞培养液；
3)将1)的打印墨水和2)的分别细胞培养液连接生物打印机的不同喷头，共同打印到缠绕棒上，形成无缝的管状组织，然后去掉缠绕棒，即得中空的管状类支气管结构体。
其中，步骤3)中喷头与缠绕棒之间的距离为3-4mm。
带动缠绕棒旋转的电动驱动器转速为0-10000cts/s(优选100cts/s，即100秒一转)，而带动打印喷头平动的电机驱动器转速为0-10000cts/s(优选80cts/s，即125秒一转)。
本发明提供的管状类组织结构体及其构建方法。该方法通过水平缠绕式细胞3D打印技术形成结构和细胞/材料成分可控的管状结构。该管状类结构与人体脉管形状尺寸接近，并且具有适应人体所需求的力学与生物学性能，具备临床应用潜力。本发明提供的管状类组织结构可用于药物检测、组织工程、再生医学、体外生理模型/病理模型/药理模型构建、细胞结构体构建、类器官构建、组织/器官/人体芯片等方面。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
(一)本发明核心部件为3D打印喷头与缠绕棒，打印喷头设计灵活，打印方式多样。提升了打印材料的利用率，减少打印材料的配置需求。扩展了可打印材料的应用范围和组合可能性，因此适用性广泛，有利于构建结构与功能更为复杂的打印材料。
(二)本发明管状类组织可以应用于人体各类脉管系统病变部位的置换与搭桥手术操作，具备生物相容性。
(三)本发明管状类组织可以批量化生产，通过对打印平台的改进，可以降低管状结构的构建难度，减少构建时间，降低管状组织的构建成本，使更多患者有机会接受管状类疾病治疗。
(四)本发明管状类组织可以个性化构造，依据需求，通过调配打印墨水配比及细胞类型，构建适用于人体不同类型脉系统的管状组织。
(五)本发明管状类组织所用的细胞，可以应用自体细胞，以构建出能够适应人体生理环境，无免疫排斥反应的管状结构，更适应人体脉管系统病变部位的修复。
(六)本发明管状类组织的构建中，可以通过改变打印喷头的运行模式，改变缠绕棒的形状及尺寸，构建结构尺寸(直径，厚度，长度，曲率及分叉等)个性化的管状组织。
(七)本发明构建的管状组织，可以通过改变打印材料的配比，构建具备定向或交错蛋白纤维排布的管状组织，以使管状组织具备接近人体组织的机械性能。
(八)本发明采用3D打印喷头平动模式与缠绕棒单元旋转模式相结合进行管状结构构建，该方法中模块构建简单，组装方便，可拆卸，可重复利用，具备更优良的可操作性。
(九)本发明采用缠绕棒单元进行管状结构构建，该方法中缠绕棒单元可以是具备一定机械性能及生物学性能的管状结构，以便构建出具备多层次结构、机械性能及生物学性能的复合型管状组织。
附图说明
图1为本发明细胞打印方法的流程示意图。
图2为本发明实施例1打印后的带细胞结构浸泡在培养液中的形态。
图3为本发明实施例1中构建的管状类组织结构体Day 6光学显微镜图。
图4为本发明实施例1中构建的管状类组织结构体CD31染色图，Confocal层扫三维重构示意图。
图5为本发明实施例1中对打印结构体中内皮细胞出芽情况统计结果。图中所示为培养不同时间，单位面积下的细胞出芽长度。
图6为本发明实施例2中管状类胆管结构体中胆管上皮祖细胞的CK19免疫染色图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
本发明利用3D打印喷头对微量物质和交联参数的精准控制，以及水平旋转缠绕式接收装置，完成即时打印构建管状结构的细胞三维打印技术。
如图1所示，本发明的用于构建管状结构的三维细胞打印方法，包括以下步骤：
1)打印平台的准备
本发明所构建的管状结构主要依赖于缠绕式打印设备的构建。缠绕式打印设备的设计主要分作两方面，可进行精确旋转运动的缠绕棒以及精确平动的打印喷头，打印喷头的平动方向与缠绕棒平行，且位于同一垂直方向。同时缠绕棒与打印喷头都有一个独立的电机驱动系统控制，以保证两者速度独立且可调。
2)打印墨水(生物打印材料，打印基质)的准备
准备打印墨水，设置墨水分配方案(例如成分，容量比例等，但不限于此)。准备打印用细胞。利用动力驱动系统(气动方式，但不限于此)推动打印喷头喷挤打印墨水。
3)打印参数设置
开启打印模式，控制打印过程。按照打印管状组织结构的尺寸(直径，厚度，长度)，设置3D打印喷头内打印墨水的喷射速度，设置缠绕棒的运转速度，设置打印喷头的平动运行速度。由3D打印喷头内的打印墨水经由喷头推挤而出，藉由重力作用，开始附着在缠绕棒上。以此同时，缠绕棒实时旋转，由此喷头挤出的丝状混合物开始沿着缠绕棒缠绕。同时打印喷头的平动与缠绕棒的旋转运动，两种组合起来，完成特定尺寸管状结构组织的打印。
4)打印成品检测及参数修正
将初步打印而成的管状结构取下，检测其形态及结构尺寸。对照其与目标管状结构的差异，修正打印参数。重复步骤1-4，进行再次打印。
5)打印成品培养
通过控制打印时间，打印出相应长度的完整管状结构。将完整的管状组织放置于培养基中进行长期动态培养。
6)对管状类组织理化性能和生物学性能进行检测
管状组织在培养液中培养一段时间后，将其取出，进行力学性能与生物学性能的检测。
在一个优选的实施例中，所述步骤1)中的打印平台可以采用多种构建形式，可以框架式，吊顶式及其他一些组装构建形式，形成整体结构稳定，操作便捷的打印平台，以便保证打印过程平稳，减少打印误差。
在一个优选的实施例中，所述步骤1)中的3D打印喷头可以采用多种形式的喷头形式，如单轴中空喷头，复式中空式，以及基于微流控原理的微流控芯片喷头
在一个优选的实施例中，所述步骤1)中的打印喷头可以以多个数量进行排列，以完成单层及多层管状结构的打印。
在一个优选的实施例中，所述步骤1)中的缠绕棒可以改为与水平方向具有一定倾斜角度的夹持方式，以打印厚度渐变的管状结构。
在一个优选的实施例中，所述步骤1)中的缠绕棒可替换为具备预先经过组织工程培养，具备一定结构强度及生物学活性的管腔结构体，用以构建具备多层次生物学特性的复合型管状类组织结构体。
在一个优选的实施例中，所述步骤1)中的缠绕棒可套合在管腔结构体内，用以构建具备多层管腔结构的复合型管状类组织结构体。
在一个优选的实施例中，所述步骤1)中的打印喷头与缠绕棒运动组合，可以为打印喷头平动，缠绕棒固定旋转。或者打印喷头固定，缠绕棒旋转行进。或者两者同时行进，完成管状结构的打印。
在一个优选的实施例中，所述步骤1)中的打印喷头可以设置为往复运动，完成单层及多层管状结构的打印。
在一个优选的实施例中，所述步骤1)中的缠绕棒旋转运动，可以改变缠绕棒旋转方向，或者设置旋转方向随时间而交替改变，以构建具有不同纤维排布模式或者厚度不均一的管状组织。
在一个优选的实施例中，所述步骤1)中的缠绕棒旋转运动速度可自助调节，打印喷头平动速度可自助调节。两者速度可自主组合，以实现不同结构及尺寸管状结构的打印。
在一个优选的实施例中，所述步骤1)中的缠绕棒旋转运动速度及印喷头平动速度可自助调节。其调节方式可以为通过控制驱动电机工作状态，或者增加速度转换接头等方式实现。
在一个优选的实施例中，所述步骤1)，打印喷头可以采用三维制图软件(例如Solidworks，但是不限于此)设计3D打印喷头的三维结构图；采用现有的材料(例如PDMS、PMMA，但是不限于此)进行加工(例如灌模，但不限于此)加工成型，但不限于此。
在一个优选的实施例中，所述步骤1)中的缠绕棒，可应用玻璃，树脂等材料的一种或多种。其横截面构型可以为圆形，椭圆、或者多边形的一种或多种。其直径可以为单一直径，或者随轴线方向改变。其中心线可以为直线，或者曲线等。藉由缠绕棒的不同设置，以完成不同构型管状结构的打印。
在一个优选的实施例中，所述步骤2)中的打印墨水材料为细胞相容性和生物相容性好的温敏材料和/或其他生物材料的混合液；其中，生物材料可以采用一种或更多种天然生物材料和/或人工合成生物材料。
在一些实施方案中，所述步骤2)中打印墨水中所使用的天然生物材料为如下材料中的至少一种：明胶、明胶衍生物、藻酸盐(如藻酸钠)、藻酸盐衍生物、纤维素、纤维素衍生材料、琼脂、基质胶、胶原、胶原衍生物、氨基酸、氨基酸衍生物、蛋白多糖、蛋白多糖衍生物、糖蛋白及衍生材料、透明质酸、透明质酸衍生物、壳聚糖、壳聚糖衍生物、DNA水凝胶材料、层连接蛋白、纤连接蛋白、纤维蛋白、丝素蛋白、丝素蛋白衍生物，更优选为纤维蛋白衍生物。
在一些实施方案中，所述步骤2)中打印墨水中使用的人工合成生物材料为如下材料中的至少一种：聚丙烯、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚丙交酯、聚乙交酯、聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚羟基酸、聚乳酸醇酸共聚物、聚二甲基硅氧烷、聚酸酐、聚酸酯、聚酰胺、聚氨基酸、聚缩醛、聚氰基丙烯酸酯、聚氨基甲酸酯、聚吡咯、聚酯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯、聚碳酸酯、聚氧化乙烯，优选聚乳酸或乳酸-羟基乙酸共聚物。
在一些实施方案中，所述步骤2)中打印墨水中使用的所述血管细胞包括血管内皮细胞、血管内皮祖细胞、微血管内皮细胞、血管平滑肌细胞、血管成纤维细胞、间充质干细胞和周细胞，这些细胞可以是组织中提取获得的，也可以是干细胞分化而来的，优选血管内皮细胞和间充质干细胞。
在一个优选的实施例中，所述步骤3)中，打印墨水可以在打印喷头推挤动作之前、过程之中及推挤之后，完成(交联反应，但不限于此)反应，形成可供缠绕的丝状聚合物，以完成具备纤维结构的管状组织。
在一些实施方案中，所述步骤6)中的理化性能及生物学性能检测，可以使用(单轴拉伸试验，免疫荧光试验，但不限于此)等实验方法来测定。
在一个优选的实施例(实施例1)中，如图2所示，用于管状组织培养的培养基为保持一种或多种组织构型固定，稳固及结构或功能强化的培养基。
在一个优选的实施例(实施例1)中，如图4所示，用于检测管状组织形态及尺寸结构，可以应用(光学显微镜，扫描电子显微镜，但不限于此)等检测手段。
实施例1纤维蛋白管状类血管结构体的构建
1、打印平台准备
构建不锈钢合金框架结构，并且将3D打印喷头与缠绕棒组装在框架之内，调试电机控制系统，组建运动系统，保证3D打印喷头能够进行平动运动，缠绕棒能够进行旋转运动。安装过程中，保证3D打印喷头安置在缠绕棒的正上方，与缠绕棒位于同一竖直平面内。缠绕棒水平放置，其旋转运动能够得到精确控制，而3D打印喷头的平动方向沿着缠绕棒的轴向，其运动也能得到精准控制。平台结构件均从企业定制，少数零件如电机安装板等则通过购买板材等原材料，自行绘图设计，并委托专业机械加工单位加工得到。
本实施例采用的是基于微流控原理的微流控芯片喷头，应用Solidworks结构设计软件设计微流控芯片结构图。微流控流道构型采用Y+S型，一方面是为了增加混合液所行经的路程，为推挤速度留出更多的变化空间，另一方面S形通道也有利于混合液的均匀混合。在混合通道的汇聚入口处做了圆角处理，防止液体流动时在该处因尖角产生气泡。为避免影响材料打印性能，喷头材料或通道表面选择亲水性材料或涂层，以减少纤维蛋白凝胶的吸附，避免通道堵塞问题。
本实施例设计了可拆卸的PMMA芯片打印喷头，在两片PMMA间夹上一层压敏胶，并使用螺钉固定。同时使用塑料接头，使用胶水封闭的钢针作为引导，将PVC管子作为注射用管子，以此拥有更光滑的表面能够有效避免液体渗出。
缠绕式旋转运动所使用的缠绕棒为具备一定长度与直径的玻璃棒。
2、打印墨水(生物打印材料)准备
本发明的打印墨水可以通过商业途径购买，也可以根据实际需要进行制备，本实施例要打印纤维蛋白管状类血管结构，在进行纤维蛋白管状类血管结构打印前制备打印材料(打印墨水)，具体制备过程为：
1)制备主体材料打印墨水(牛血纤维蛋白原与凝血酶)
牛血纤维蛋白原需要长期保存于冰箱-20℃，使用时现配现用，配制牛血纤维蛋白原时应先将秤量天平喷上酒精后搬入超净台，并使用紫外光照射灭菌30分钟，每次打印，主要使用0.02g的粉末，每次取出一管含0.02g的纤维蛋白原溶于500μl的DMEM/F-12 HEPES培养液中，保证该培养液内DMEM完全溶解，没有沉淀。
凝血酶则先用PBS分装为几个EP管，每管1ml含100U并存放于-20℃，配置一批材料只需取出一管，并同样使用DMEM/F-12 HEPES培养液稀释成20U/ml共5ml的母液，包上锡箔纸避光存放于4℃冰箱，一批母液足够打印多次。每次打印时，先取一个新的EP管加入一颗质量约为0.12g的无水氯化钙颗粒，并加入500μl的凝血酶母液吹打直至完全溶解，配置完成也将液体放入37℃培养箱5分钟。
本实施例中所采用的终浓度为，纤维蛋白原：20mg/ml，凝血酶：10U/ml，氯化钙：120mM，打印前使用1ml的针管将材料吸入，注意需要尽量减少吸入气泡，而在吸入后可以轻打针管以消除气泡。
2)打印墨水中细胞的制备
本实施例打印使用的细胞为人脐静脉内皮细胞HUVEC，使用EBM-2 EndothelialGrowth Basal Medium(Lonza)进行培养，且打印前代数为第四代，打印前，先对T75培养瓶用PBS进行冲洗，并使用3ml的0.25％ Trypsin-EDTA(Thermal Fisher)在37℃培养箱中进行消化2分钟，至镜下观察后加入6毫升的EBM培养液终止消化，放入离心机进行离心，使用的参数为1000rpm并处理3分钟，接着取出上清液后加入1ml培养液重悬细胞，使用细胞计数板进行计数，可得到细胞浓度并估计总细胞数，计完数后取出所需细胞数的溶液量再次离心，参数与前一步相同，去掉上清液后加入先前配好的500μl纤维蛋白原溶液配置出浓度为4×106cells/ml的含细胞纤维蛋白原溶液。
3、打印设置
打印过程中的所有输液工作主要使用保定申辰SPLab02注射泵来完成，每次打印前，先用去离子水对流道进行灌流，以5μl/min的流速总共冲洗50μl，一方面作为使用前的流道冲洗，一方面也是为了在流道中充满液体，可以在加入材料时减少阻力，使流道内尽快达到稳态。冲洗完毕后将芯片分别接上纤维蛋白原及凝血酶的管子并向其中通液，同样设置为5μl/min，总量一般设置为400μl，可以少量使用注射泵上的快进键，使流道内快速达到稳态，当看到芯片下方出现粉红色液珠状凝胶，即可将微流控芯片喷头架上打印机横梁，喷头与缠绕用玻璃管间的距离约为3-4mm。
打印机参数部分，将缠绕棒的旋转速度调整为100cts/s，即100秒一转，而带动打印喷头平动的电机驱动器转速为80cts/s，即125秒一转，即可稳定打印出没有缝隙的管状组织。一次打印约可以打印出总长为6cm，壁厚为2mm的管状类血管结构。
4、打印成品检测及参数修正
使用光学显微镜与电子扫描显微镜，观察检测打印出的管状结构体，修正打印参数(缠绕棒的旋转速率，微流控芯片喷头的喷射速率及平动速度等)，再次打印。
5、打印成品培养
将打印出的纤维蛋白中空结构体放置于富含培养液的培养皿中。
6、对管状类组织理化性能和生物学性能进行血管化检测
在纤维蛋白中空结构体在培养液中培养一段时间后，将其取出，进行力学性能与生物学性能的检测。应用单轴拉伸测试测算纤维蛋白中空结构体的力学性能，与人体血管特性做对比。使用CCK8细胞增殖检测其细胞存活状态，利用免疫荧光测试(CD31及DAPI)检测其细胞增殖生长状态。
图3为本实施例所构建的管状类组织结构体Day 6光学显微镜图。图4显示内皮细胞能够良好地在打印的定向纤维蛋白中铺展生长并形成脉络状结构。图5是对打印结构体中内皮细胞出芽情况统计结果，结果显示，随着培养时间的增加，内皮细胞出芽长度增加，说明管状结构体内部开始进行血管化。
实施例2纤维蛋白管状类胆管结构体的构建
1、打印平台准备
构造不锈钢合金框架结构打印平台，主要包含打印用喷头及用于管状构建的缠绕单元。其中，打印平台及其组件自主绘图设计，各组件可以通过企业定制或者委托专业机械加工单位进行加工。
本实施例应用基于微流控原理设计的微流控芯片喷头，应用PMMA材料构建出具有Y+S构型流道的微流控芯片喷头。该喷头能够有效促进溶液融合，并且能防止通道堵塞问题。
本实施例中应用的缠绕用的玻璃管直径约0.5cm，与人体胆管直径相近。
2、.打印墨水(生物打印材料)准备
本发明的打印墨水可以通过商业途径购买，也可以根据实际需要进行制备，本实施例要打印纤维蛋白管状类胆管结构，在进行打印前制备打印材料(打印墨水)，具体制备过程为：
1)制备主体材料打印墨水(牛血纤维蛋白原与凝血酶)
将保存于冰箱-20℃的牛血纤维蛋白原取出0.02g粉末，溶于500μl的DMEM/F-12HEPES培养液中，保证该培养液内DMEM完全溶解，没有沉淀。
凝血酶则先用PBS分装为几个EP管，每管1ml含100U并存放于-20℃，配置一批材料只需取出一管，并同样使用DMEM/F-12 HEPES培养液稀释成20U/ml共5ml的母液，包上锡箔纸避光存放于4℃冰箱，一批母液足够打印多次。每次打印时，先取一个新的EP管加入一颗质量约为0.12g的无水氯化钙颗粒，并加入500μl的凝血酶母液吹打直至完全溶解，配置完成也将液体放入37℃培养箱5分钟。
本实施例中所采用的终浓度为，纤维蛋白原：20mg/ml，凝血酶：10U/ml，氯化钙：120mM。
2)打印墨水中细胞的制备
本实施例打印使用的细胞为人胆管上皮祖细胞(CP,cholangiocyteprogenitor)。
①hPSCs细胞培养：取适量的hPSCs细胞进行复苏培养，以备选用。第一天，应用富含成分activin A(100ng/ml),bFGF(80ng/ml),BMP-4(10ng/ml),LY294002(10μM)和CHIR99021(3μM)培养液，对多功能肝细胞hPSCs进行换液操作，在37℃过夜培养。
②hPSCs向DE的分化培养：第二天，使用添加有activin A(100ng/ml),bFGF(80ng/ml),BMP-4(10ng/ml)和LY294002(10μM)的CDM–PVA替换培养液。在37℃过夜培养。第三天，使用新配置添加有activin A(100ng/ml)和bFGF(80ng/ml)的RPMI/B27培养液，替换培养液。
③DE向FP细胞的分化：第4-6天，使用新配制的添加有activin A(50ng/ml)的RPMI/B27培养液替换旧培养液。第7,8天，使用新配制添加有activin A(50ng/ml)的RPMI/B27培养液替换培养基。
④FP细胞向HB细胞的分化：第9-12天，使用新配制的含有SB-431542(10μM)和BMP-4(50ng/ml)的RPMI/B27培养液替换培养基。通过HNF4A,AFP和TBX3的表达与流式分析检测HB肝祖细胞的分化。实现FP细胞向HB细胞HB的分化。
⑤HBs细胞向CPs的分化：第13-16天，使用新配制的含有FGF10(50ng/ml),activinA(50ng/ml)与retinoic acid(3μM)的RPMI/B27培养基替换培养液，通过Sox9的表达，检测胆管上皮祖细胞的分化。确保实现肝祖细胞向胆管上皮祖细胞的分化。
⑥使用PBS冲洗细胞，添加细胞消化液，在37℃中保存20分钟。细胞与底板分离，使用移液管收集细胞。将细胞转移到15毫升的管道中，轻柔吹气并重悬细胞2-3次，使用1000微升移液管，将细胞分离成小团块。以RPMI/B27培养基冲洗平板，移至15毫升管中。室温下离心3分钟。吸取上清液，在6毫升的RPMI/B27重悬细胞。室温下，离心3分钟，吸取上清液。在含有EGF(20ng/ml)和Rho激酶抑制剂Y-27632(10μm)的预先准备的50％基质凝胶中重悬细胞，混合充分。
使用细胞计数板进行计数，可得到细胞浓度并估计总细胞数，计完数后取出所需细胞数的溶液量再次离心，参数与前一步相同，去掉上清液后加入先前配好的500μl纤维蛋白原溶液配置出浓度为4×106cells/ml的含细胞纤维蛋白原溶液。
3、打印设置
应用保定申辰SPLab02注射泵进行打印墨水的灌注及压力驱动，每次打印前，先用去离子水对流道进行灌流，从而可以在加入材料时减少阻力，使流道内尽快达到稳态。冲洗完毕后将芯片分别接上纤维蛋白原及凝血酶的管子并向其中通液，同样设置为5μl/min，总量一般设置为400μl，调节注射泵，使流道内快速达到稳态。当看到芯片下方出现粉红色液珠状凝胶，即可将微流控芯片喷头架上打印机横梁，喷头与缠绕用玻璃管间的距离约为3-4mm。
调整打印机参数部分，确保可稳定打印出没有缝隙的管状组织。
4、打印成品检测及参数修正
使用光学显微镜与电子扫描显微镜，观察检测打印出的管状结构体，修正打印参数(缠绕棒的旋转速率，微流控芯片喷头的喷射速率及平动速度等)，再次打印。
5、打印成品培养
将打印出的纤维蛋白类胆管结构体放置于新鲜配制的EGF(20ng/ml)的WE培养基中，每2天替换培养基。在2-4天的培养中，会形成类器官组织。
6、对管状类组织理化性能和生物学性能进行类胆管化检测
在纤维蛋白中空结构体在培养液中培养一段时间后，将其取出，进行力学性能与生物学性能的检测。通过CK7的表达来检测胆管上皮样细胞的分化，确保可以在＞75％细胞中观察到。通过CK19的免疫荧光染色检测其表达，表征胆管上皮细胞的生长情况。检测用于表征胆管上皮细胞功能的碱性磷酸酶染色表现和谷酰转肽酶的活性。CK19免疫荧光染色图(图6)显示CK19阳性表达，说明胆管上皮细胞生长状态良好，且有管状结构生成。
实施例3管状类支气管结构体的构建
1、打印平台准备
构造不锈钢合金框架结构打印平台，主要包含打印用喷头及用于管状构建的缠绕单元。其中，打印平台及其组件自主绘图设计，各组件可以通过企业定制或者委托专业机械加工单位进行加工。
本实施例应用基于微流控原理设计的微流控芯片喷头，应用PMMA材料构建出具有具有单一流道的微流控芯片喷头。该喷头能够精准控制溶液流量。
本实施例中应用的缠绕用的玻璃管直径约1cm，与人体支气管直径相近。
2、打印墨水(生物打印材料)准备
本发明的打印墨水可以通过商业途径购买，也可以根据实际需要进行制备，本实施例要打印管状类支气管结构，在进行打印前制备打印材料(打印墨水)，具体制备过程为：
1)制备主体材料打印墨水(海藻酸与明胶)
明胶(Sigma-Aldrich，G1890)和海藻酸钠(Sigma-Aldrich，A0682)溶解在0.5％(w/v)的氯化钠溶液中，分别形成浓度为15％的明胶溶液和4％的海藻酸钠溶液。
2)打印墨水中细胞的制备
本实施例中所用细胞为人肺脏支气管上皮细胞(Beas-2B)和人胎肺成纤维细胞(MRC-5)。
细胞培养：采用H-DMEM培养基(Hyclone,SH30022.01)(含10％FBS)培养。待细胞生长铺满皿底约80％时，使用0.25％胰酶(TargetMol，T0517-50mg)(含0.04％EDTA)消化，按1∶6比例传代，隔天更换培养液。
3、打印设置
将600μL的明胶溶液和400μL的海藻酸钠溶液在37℃下保温20分钟，轻缓地混合作为基质材料。将Beas-2B和MRC-5细胞(细胞密度为6×105个/ml，二者比例为5∶1)。
应用保定申辰SPLab02注射泵进行打印墨水的灌注及压力驱动，每次打印前，先用去离子水对流道进行灌流，从而可以在加入材料时减少阻力，使流道内尽快达到稳态。冲洗完毕后将芯片接上上述经过混合后的溶液并向其中通液，同样设置为5μl/min，总量一般设置为400μl，调节注射泵，使流道内快速达到稳态。喷头与缠绕用玻璃管间的距离约为3-4mm。
调整打印机参数部分，确保可稳定打印出没有缝隙的管状组织。
4、打印成品检测及参数修正
使用光学显微镜与电子扫描显微镜，观察检测打印出的管状结构体，修正打印参数(缠绕棒的旋转速率，微流控芯片喷头的喷射速率及平动速度等)，再次打印。
5、打印成品培养
将打印出的类支气管结构体放置于5％CO2、37℃培养箱中培养，新鲜配制的H-DMEM培养基(含10％FBS)中，每1-2天替换培养基。
6、对管状类组织理化性能和生物学性能进行类支气管化检测
在类支气管中空结构体在培养液中培养一段时间后，将其取出，进行力学性能与生物学性能的检测。类支气管结构体构建后生长7天后，HE染色显示细胞连接生长现象；广谱CK和Vimentin染色均有阳性结果，说明细胞活性较好。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (3)

1.管状类支气管结构体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)制备打印墨水
将明胶和海藻酸钠分别溶解在0.5％w/v的氯化钠溶液中，形成浓度为15％的明胶溶液和4％的海藻酸钠溶液；将600μL的明胶溶液和400μL的海藻酸钠溶液混合，所得混合液于37℃保温20分钟，得到打印墨水；
2)打印细胞的制备
采用含10％FBS的H-DMEM培养基分别培养人肺脏支气管上皮细胞和人胎肺成纤维细胞；待细胞生长铺满皿底80％～90％时，用含0.04％EDTA和0.25％胰酶的酶液消化细胞，按1:6比例传代，隔天更换培养液；打印前培养至第四代；然后，将人肺脏支气管上皮细胞和人胎肺成纤维细胞按5:1的比例混合，得到细胞密度为6×105个/ml的细胞培养液；
3)将1)的打印墨水和2)的分别细胞培养液连接生物打印机的不同喷头，共同打印到缠绕棒上，形成无缝的管状组织，然后去掉缠绕棒，即得中空的管状类支气管结构体。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中喷头与缠绕棒之间的距离为3-4mm；和/或
带动缠绕棒旋转的电机驱动器转速为0-10000cts/s，而带动打印喷头平动的电机驱动器转速为0-10000cts/s。
3.按照权利要求1或2所述方法构建得到的管状类支气管结构体。
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