CN117660481A - 拟南芥AtNAC002基因的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了拟南芥AtNAC002基因的应用，拟南芥AtNAC002基因可以提高拟南芥对铜毒抗性，相同铜毒浓度下，不表达AtNAC002基因的突变株的根长和鲜重分别下降了31.46％和54％，其在铜毒条件下可以通过降低拟南芥根系对铜的吸收以降低拟南芥根系中的铜含量。

Description

拟南芥AtNAC002基因的应用

技术领域

本发明涉及生物技术和植物基因工程技术领域，具体涉及拟南芥AtNAC002基因的应用。

背景技术

铜(Cu)是植物生长发育必需的微量营养元素，对植物生长具有双重性质，在最佳水平上必不可少，当植物组织中铜浓度过高时，植物会出现明显的中毒症状，抑制植物正常生长发育。过量的铜不仅会降低作物的产量和品质，还可能经过食物链危害人体健康。因此，控制作物中铜的积累和动态平衡，对植物的正常生长发育和人体健康是非常重要的。尤其是在工业和煤矿开采方面，致使铜成为环境中较为严重的污染物。

在农业生产上使用杀菌剂、除藻剂和杀菌剂，铜通过各种农艺活动大量排放到生态系统中。铜的毒性不仅与工业活动的增加有关，还与金属加工、污泥的使用、电镀、金属采矿、染料、肥料、杀菌剂和杀虫剂有关。含铜的杀菌剂被广泛用于保护由真菌或昆虫引起的生物降解。由于铜在不同农业和工业活动中的使用增加，全球大量开采铜。目前工业的快速发展，不同的潜在有毒元素大量释放到环境中，对环境造成大量的污染。因此，随着人类活动对生态系统的影响，重金属等有毒元素对环境的污染正在变得越来越普遍和严重。

发明内容

发明人在对拟南芥AtNAC002基因的研究过程中发现该基因能够提高拟南芥对铜毒的抗性，因此，为解决背景技术中存在的问题，本发明提供了一种拟南芥AtNAC002基因的应用。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

第一方面，本发明提供了拟南芥AtNAC002基因在提高拟南芥对铜毒抗性中的应用，所述基因在NCBI中的ID号为At1g01720。

按上述方案，所述拟南芥AtNAC002基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

第二方面，本发明提供了拟南芥AtNAC002转录因子在提高拟南芥对铜毒抗性中的应用，所述拟南芥AtNAC002转录因子具有Ⅰ)或Ⅱ)所示的氨基酸序列：

Ⅰ)如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；或

Ⅱ)在Ⅰ)所述氨基酸序列的基础上经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸的得到的具有相同功能的蛋白质。

第三方面，本发明提供了一种重组载体在提高拟南芥对铜毒抗性中的应用，所述重组载体包含上述拟南芥AtNAC002基因。

按上述方案，拟南芥AtNAC002基因在根系中受铜毒诱导上调表达.

按上述方案，拟南芥AtNAC002基因通过降低拟南芥根系对铜的吸收以提高拟南芥对铜毒的抗性。

按上述方案，拟南芥AtNAC002转录因子通过降低拟南芥根系对铜的吸收以提高拟南芥对铜毒的抗性。

按上述方案，重组载体通过降低拟南芥根系对铜的吸收以提高拟南芥对铜毒的抗性。

按上述方案，拟南芥AtNAC002基因降低拟南芥根系中的铜含量。

按上述方案，拟南芥AtNAC002转录因子降低拟南芥根系中的铜含量。

按上述方案，重组载体降低拟南芥根系中的铜含量。

本发明的有益效果是：本发明通过比较野生型拟南芥以及通过T-DNA技术在AtNAC002基因中插入片段使AtNAC002基因不表达的突变株，发现突变株对于铜毒非常敏感，相同铜毒浓度下，突变株的根长和鲜重分别下降了31.46％和54％，且野生型拟南芥在铜毒条件下，其根部AtNAC002基因的表达量约为非铜毒条件下的6倍。表明拟南芥AtNAC002基因以及其编码的AtNAC002转录因子具有提高拟南芥对铜毒抗性的作用，其在铜毒条件下可以通过降低拟南芥根系对铜的吸收以降低拟南芥根系中的铜含量。

附图说明

图1为本发明实施例1中野生型和AtNAC002基因突变体(nac002)在不同重金属处理下的生物量，图1中的(a)为相对主根长，图1中的(b)为相对鲜重；

图2为本发明实施例2中野生型拟南芥在铜毒处理下根中以及地上部分AtNAC002基因的转录情况；

图3为本发明实施例3中AtNAC002基因的基因结构特征，其中图3中的(a)为T-DNA插入位点示意图，图3中的(b)为半定量验证T-DNA插入位点的结果，图3c为AtNAC002家族进化树分析；

图4为本发明实施例4提供的AtNAC002基因的亚细胞定位；

图5为本发明实施例5提供的AtNAC002基因的转录激活活性结果，其中图5中的(a)为不同区段CDS序列示意图，图5中的(b)为转录激活活性结果示意图；

图6为本发明实施例6提供的野生型和AtNAC002突变体(nac002)的正常和铜毒条件下的表型和生物量(根长和鲜重)统计结果，其中图6中的(a)为正常和铜毒条件下的表型，图6中的(b)为正常和铜毒条件下的根长，图6中的(c)为正常和铜毒条件下的鲜重；

图7为本发明实施例6提供的野生型和AtNAC002突变体(nac002)苗期在正常和铜毒条件下不同部位的铜浓度测定结果，其中图7中的(a)为地上部分，图7中的(b)为根系结果；

图8为本发明实施例6提供的野生型和AtNAC002突变体(nac002)的正常和铜毒条件下的地上部分的活性氧测定结果，其中图8中的(a)、(b)、(c)和(d)分别为SOD、CAT、POD和MDA的活性；

图9为本发明实施例6提供的野生型和AtNAC002突变体(nac002)的正常和铜毒条件下的根系中的活性氧测定结果，其中图9中(a)、(b)、(c)和(d)分别为SOD、CAT、POD和MDA的活性。

具体实施方式

以下结合附图及具体实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本申请中未详细单独说明的试剂均为常规试剂，均可从商业途径获得；未详细特别说明的方法均为常规实验方法，可从现有技术中获知。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

在本申请中，术语“基因”是指表达特定蛋白质或功能RNA分子的核酸片段，该核酸片段可包含位于编码序列之前的调节序列(5’非编码区)和之后的调节序列(3’非编码区)。

在本申请中，术语“表达载体”是指在克隆载体基本骨架(空骨架)的基础上增加表达元件(如启动子、RBS、终止子等)，使目的基因能够表达的载体。

在本申请中，术语“同源臂序列”是指一段同源序列，其作用为将扩增出的目标基因片段与线性化的质粒连接起来。连接过程中，由于同源序列的存在，会使目标序列与质粒DNA发生同源重组，将目标序列片段插入到质粒中。

在本申请中，术语“infusion连接”是指在表达载体构建中的一种无酶连接技术，主要来源于infusion酶的发现，infusion酶能够识别线性化的DNA片段5’-3’末端任意16碱基，使其形成粘性末端。目标质粒通过酶切或者PCR线性化后，也能被infusion酶识别。只需要载体和基因形成的黏性末端互补，通过退火的过程就能完成载体的构建。

在本申请中，术语“核酸分子”是指RNA或DNA的聚合物，它是单链或双链的，任选地包含合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。DNA聚合物形式的核酸分子可由cDNA、基因组DNA或合成DNA的一个或多个区段构成。

实施例提供了一个解铜毒的基因AtNAC002，该基因位于拟南芥的第一条染色体上，在NCBI中的ID号是：At1g01720，基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，该基因的编码核苷酸序列(CDS序列)如SEQ ID NO.2所示。

本发明提供的拟南AtNAC002基因的名称与基因ID均来源与拟南芥测序数据库(www.arabidopsis.org)，具体来源于野生型的拟南芥Col-0。

为了测定AtNAC002转录因子的转录激活活性，将AtNAC002蛋白分为保守的N端和活跃的C端两个片段，其C端序列如SEQ ID NO:3所示，长度为452bp，其N端序列如SEQ IDNO:4所示，长度为418bp。

在一个或多个实施例中，拟南芥AtNAC002基因的(SEQ ID NO:2)的扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11所示。

在一个或多个实施例中，拟南芥AtNAC002基因的C端序列(SEQ ID NO:3)的扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13所示。

在一个或多个实施例中，拟南芥AtNAC002基因的N端序列(SEQ ID NO:4)的扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15所示。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

下列实施例中的分子生物学实验包括质粒构建、酶切、连接、感受态细胞制备、转化、培养基配制等，主要参考《分子克隆实验指南》(第三版)，J.萨姆布鲁克等编著，科学出版社进行，必要时可以通过简单试验确定具体实验条件。PCR扩增实验根据质粒或DNA模板供应商提供的反应条件或试剂盒说明书进行，必要时可通过简单试验予以调整。

植株、基因及载体：拟南芥Col-0种子、拟南芥突变体种子(AtNAC002基因的T-DNA插入，购自AraShare，产品ID：72973)、PBI121载体。

培养基及缓冲液：

YPDA培养基(1L)：胰蛋白胨20g、酵母提取物10g、葡萄糖20g、硫酸腺嘌呤30mg，盐酸调pH值至5.8，固体培养基加1.2-1.5％琼脂粉，115℃高温灭菌；

SD/-TRP培养基(1L)：无氨基酸酵母氮源6.7g、缺色氨酸的补充成分0.64g、葡萄糖20g、琼脂粉15g，NaOH调pH值至5.8,115℃高温灭菌；

SD/-TRP-HIS培养基(1L)：无氨基酸酵母氮源6.7g、缺色氨酸和组氨酸的补充成分0.64g、葡萄糖20g、琼脂粉15g，NaOH调pH值至5.8,115℃高温灭菌；

Z-Buffer(pH7.0,1L):Na₂HPO₄·12H₂O 21.5g、NaH₂PO₄·2H₂O 6.22g、KCl0.75g、MgSO₄·7H₂O 0.246g；

酵母显色液(10mL):Z-Buffer 10ml、β-巯基乙醇27μL、X-Gal母液167μL；

50％ PEG 4000(w/v，100mL):50g PEG 4000溶于水中，定容至100mL，0.22μmol/L滤器灭菌。

1mol/L LiAc(pH 7.5,100mL):10.2g C₂H₂LiO₂·2H₂O溶于水中，定容至100mL，0.22μmol/L滤器灭菌。

ssDNA(5mg/mL,50mL):250mg鲑鱼精DNA溶于50mL TE缓冲液。

X-Gal母液(20mg/mL):0.5g 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖溶于25mL二甲基酰胺，-20℃避光保存。

实施例1拟南芥AtNAC002基因响应铜毒的特异性

分别测定野生型拟南芥Col-0(WT)以及AtNAC002突变体(nac002)在不同金属毒害(锰毒：1mmol/L MnCl2；锌毒：200μmol//L ZnSO4；铁毒：300μmol/L EDTA-Fe；砷毒：20mmol/L H3AsO3；铜毒：30μmol/L CuSO4)下的生长情况，具体操作如下：

A)种子消毒：选取大小一致的拟南芥Col-0种子和突变体种子，先用75％的酒精消毒1min，再使用1％的NaClO灭菌处理20min。在超净工作台内，用经过高温高压灭菌的超纯水(>18.25MΩ)清洗6-8次。将洗好的种子避光置于4℃冰箱3d。

B)配制培养基：按照2.215g/L称取一定比例的MS(Murashige and Skoog)至三角瓶中，根据不同处理条件需要，加入对应的金属盐至相应浓度。加入1％(g/L)蔗糖，超纯水溶解并定容，调节培养基pH至5.7-5.9，加入1％(g/L)琼脂。将配好的培养基灭菌。

C)播种：工作台灭菌20-30min，在培养皿上写上种子编号，处理浓度和培养时间等。将培养基均匀倒入培养皿中，等待凝固。培养基凝固后，用蓝枪头将种子按照一定间距均匀点播在培养基上。用3M透气胶带封好培养皿。

D)培养：将培养皿按照一定角度摆放在光照培养箱(温度为22℃，光照周期为16h(光照)/8h(黑暗)，光照强度为15000lx，湿度为60％-75％。)，在生长期间不定期变换皿与皿之间的位置，以确保光照均匀。

以拟南芥的根长和鲜重为指标，测定第13d时拟南芥的根长和鲜重，结果如图1所示，在铜毒条件下，AtNAC002基因突变体的根长为野生型的67.7％，鲜重为野生型的50.7％，说明在AtNAC002基因不表达的情况下，拟南芥对铜毒表现出敏感性，其生长受阻，证明AtNAC002基因在拟南芥中具有解铜毒的作用。但是AtNAC002基因突变体材料在其他重金属毒害条件下与野生型没有显著差异，只有在铜毒条件下才表现出敏感性，说明AtNAC002基因突变体对铜毒的敏感是特异的。

实施例2拟南芥AtNAC002基因相应铜毒的时空表达

a)拟南芥铜毒培养条件：将灭菌的种子播种于正常培养基中生长10d后，移入于含有30μmol/L CuSO₄的固体培养基上处理不同时间点(0,3h,6h,12h,24h,3d,7d)，分地上部(Shoot)和根部(Root)取样，立即放入液氮中，并储存在-80℃冰箱。

b)定量分析过程：将储存在-80℃冰箱中的拟南芥样品，使用EastepR SuperTotal RNA Extraction Kit(Promega,Madison,WI,United States)从野生型拟南芥中提取总RNA。使用ReverTra Ace qPCR RT Master Mix(TOYOBO,Osaka,Japan)将总RNA(500ng)逆转录为cDNA。根据制造商的说明，使用HieffqPCR SYBR Green Master Mix(Yeasen)在QuantStudio6Flex System(Applied Biosystems)上进行qRT-PCR。qRT-PCR中使用的引物经过仔细检查，扩增效率在90％和110％之间。通过对相对表达水平进行标准化。

以UBC9为内参基因，检测铜毒处理不同时间后基因AtNAC002的转录水平，结果如图2所示，以铜毒处理0h地上部的表达量定位1，根部基因AtNAC002的表达量在前3天无显著变化，到第七天显著上升，约为对照的6倍。这一结果表明：基因AtNAC002在根系中受铜毒诱导上调表达。

实施例3拟南芥AtNAC002基因的结构特征

(1)基因AtNAC002的T-DNA插入位点的鉴定过程

下载由http://signal.salk.edu/tdnaprimers.2.html网址提供的T-DNA引物LP、RP和BP。采用TPS法提取突变体的DNA，利用三引物法进行PCR扩增。通过与marker对照，根据片段长度确定是否为纯合材料，根据扩增片段长度和片段条带数判断是否为纯合材料。

(2)PCR扩增引物设计

本实施例共设计三条引物，根据http://signal.salk.edu/网站提供的T-DNA插入的序列号SALK_057618，查阅网站提供的LP和RP引物序列，核苷酸序列如SEQ ID NO：5(LP)和SEQ ID NO：6(RP)所示，BP为T-DNA插入序列上的片段，根际序列号类别，选择LBb1.3为该基因的BP引物，BP对应的核苷酸序列如SEQ ID NO：7(BP)所示。

(3)PCR反应体系及程序

PCR反应体系：引物LP 0.2μL、引物RP 0.2μL、引物BP0.2μL、cDNA 1μL、2×HieffPCR Master Mix(With Dye)5μL、ddH₂O 3.4μL。

PCR扩增条件：84℃5min，94℃30s，55℃30s，72℃1min/kb，35循环，72℃，10min。

(4)AtNAC家族进化树分析

构建拟南芥中AtNAC家族成员的系统发育树，对拟南芥AtNAC家族成员间的系统发育进行分析。使用MEGA7.0.21软件，选择蛋白质序列比对，按默认参数进行蛋白质对齐后，选择进化树分析，以邻接法(Neighbor-joining method,NJ)构建基因进化树，校验参数Bootstrap重复1000次，代换模型选择泊松分布模型，其它参数保持默认值，构建系统进化树。

图3基因结构分析，AtNAC002(AT1G01720)基因包含三个外显子和两个内含子。基因组全长为1827bp，共编码290个氨基酸。atnac002(SALK_057618)突变类型为T-DNA插入，插入位点在第三个外显子靠近3’UTR区。以1kb为扩增的范围，通过三引物(LP、RP和BP)进行鉴定，PCR证实T-DNA插入在atnac002突变体中，鉴定结果表明该突变体为纯合体。在mRNA水平也没有检测到AtNAC002，说明该突变体在转录水平上发生改变。之前的研究报导水稻中发现了151个NAC成员，拟南芥中一共有105个NAC基因，我们以文献报道的105个拟南芥NAC基因构建进化树分析。参照水稻NAC家族分析，我们将拟南芥NAC家族基因一共分为A和B两个大家族，17个小亚家族，A家族分为4个小亚家族，一共29个基因；B家族分为13个小亚家族，一共76个基因。我们研究的NAC002属于B5亚家族。该小亚家族一共有包括四个基因,其中AtNAC002和AtNAC032之前都被报道过跟干旱和盐胁迫有关。

实施例4AtNAC002基因的亚细胞定位

(1)基因AtNAC002亚细胞定位载体的构建和鉴定方法如下：

以拟南芥根系CDS为模板，扩增含酶切位点(EcoRⅠ和XmaⅠ)的NAC002的CDS片段，扩增引物如SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示，插入PBI121载体的35S启动子后，构建35S：NAC002载体。基因AtNAC002的CDS片段采用擎科公司的蓝酶扩增，正确片段通过酶切连接表达载体pBI121-35S-NOS。

(3)利用基因AtNAC002表达载体转化农杆菌GV3101；

详细方法为：25μL农杆菌感受态细胞(无菌操作)，在冰上缓慢融化后，加入1μL质粒(约200ng)，用手拨打管底混匀，立即插入冰中，用200μL枪头将感受态-质粒混合物快速移到电击杯中电击，加入500μL的LB液体培养基，200rpm，28℃孵育2h；将孵育的菌液涂布于含有相应抗素(庆大霉素Gen和卡那霉素Kana)的LB平板上，28℃，倒置培养2天，挑选单克隆进行菌落PCR和提取质粒酶切鉴定。

(4)利用重组表达载体转化烟草

挑取转化有表达质粒的农杆菌克隆于1ml含有相应抗生素的LB中，28度摇床250rpm培养24小时，于5ml含有相应抗生素的LB中，加入100μl 0.5M MES，2μl 100mMAS，再接种50μl农杆菌菌液，28度摇床250rpm培养至OD600＝1.0(大约12-18小时)，4000rpm常温离心10分钟收集菌体，用10mM MgCl2重悬至OD600＝1.0，以每毫升菌液加入2μl的比例加入100mM AS，静置3小时以上。取正处于生长旺盛时的本生烟草(Nicotiana benthamiana)，用注射器吸入菌液，去掉针头，以手指抵住叶片正面，将菌液从叶片的反面渗透进去，正常条件下放置，24-48小时即可取样。

图4为确定基因AtNAC002的亚细胞定位，利用烟草瞬时表达系统来观察蛋白亚细胞定位原理，将目的基因与GFP报告基因的编码区融合，利用农杆菌将含有外源目的基因的载体导入到烟草叶片中进行表达。通过激光共聚焦显微镜观察叶片表皮细胞中的荧光。亚细胞定位，在烟草叶片表皮细胞中，与基因AtNAC002融合表达的GFP信号在细胞核中检测到，并与细胞核标记物重叠。

实施例5AtNAC002基因的转录激活活性

(1)酵母载体构建及连接

酵母空载体选用pGBKT7空载体，用无缝克隆法(infusion连接)进行酵母载体构建，根据载体线性化后的两端序列信息设计目标基因全长AtNAC002、AtNAC002-C和AtNAC002-N，用已测序正确的CDS质粒作为模板，在目标基因AtNAC002、AtNAC002-C和AtNAC002-N的三对引物(核苷酸序列分别如SEQ ID NO：10—SEQ ID NO：15所示)前端加上与载体连接的15bp同源臂序列(核苷酸序列分别如SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17所示)形成第二引物对(核苷酸序列分别如SEQ ID NO：18—SEQ ID NO：23所示)进行片段扩增，然后将扩增后的目标片段和线性化后的载体骨架进行infusion连接，进行大肠杆菌转化。

(2)酵母感受态的制备和转化

将酵母菌株AH109划线于YPDA固体培养基，30℃培养2天，活化酵母菌株，挑选单菌落于5mL YPDA液体培养基中，30℃摇培至OD₆₀₀为1.6-1.8(约需16h)；按照1:10转接至新的YPDA液体培养基中，30℃摇培至OD₆₀₀为0.8-1.0(约需3-5h)；室温，3000r/min离心5min，弃上清，用1/2体积的无菌ddH₂O洗涤菌体；室温，3000r/min离心5min，弃上清，加入适量的无菌ddH₂O重悬菌体，将ssDNA用沸水煮5-10min，立即放于冰上，冷却备用，向1.5mL无菌EP管中依次加入以下溶液：酵母感受态60μL，50％ PEG 4000 240μL、1M LiAc 36μL、ssDNA(5mg/mL)10μL和质粒DNA(0.1-5μg)各5μL，斡旋1min，使转化体系混匀；30℃恢复培养30min；42℃热激转化25min，冰上放置5min；7200r/min离心1min，弃上清，加入200μL ddH2O重悬菌体，涂布于SD/-TRP固体培养基上；30℃培养2-3天，至长出单克隆菌落。

(3)酵母克隆梯度稀释点斑

将上一步得到的单克隆菌落接种于2mL YPDA液体培养基中，30℃过夜；7200r/min离心1min，弃上清，用无菌ddH₂O重悬菌体，并重复2次；向新的1.5mL无菌EP管中加入1mL无菌ddH₂O，加入适量的酵母菌液，将其OD₆₀₀调整至0.8左右；将调整好的酵母菌液分别按照10倍、100倍和1000倍进行梯度稀释；取10μL各浓度条件的酵母菌液分别点斑于SD/-TRP和SD/-TRP-HIS营养缺陷型固体培养基上，于30℃培养箱内黑暗培养2-3天。

(4)β-半乳糖苷酶活性检测

取2张滤纸并用2mL含有X-Gal的Z-Buffer浸湿，吸去多余的液体；取出一张滤纸覆盖在长有酵母转化子的SD/-TRP-HIS营养缺陷型固体培养基上，用玻璃涂棒小心赶走气泡，并使滤纸尽可能与酵母菌斑接触，在滤纸上标记好克隆的顺序；轻轻取出滤纸，液氮中速冻15s；取出滤纸，室温解冻，再次将滤纸置于液氮中速冻15s，室温解冻，将滤纸沾有菌液的一面朝上，紧贴于预先用含有X-Gal的Z-Buffer浸润的另一张滤纸上，将滤纸放在培养皿中，并放于30℃培养箱，观察显色情况，8h内能够显色的认为具有转录激活活性。

图5为根据转录因子的结构特点，我们检测AtNAC002是否具有转录激活活性，并解剖转录激活的关键区域，将AtNAC002蛋白分为保守的N端和活跃的C端两个片段，将AtNAC002全长和2个片段分别连接到pGBKT7载体上(含有DNA-BD结构域)；单独的GAL4的结合结构域(pGBKT7)作为阴性对照，然后将载体导入酵母细胞在不同的培养基上生长。所有转化的酵母细胞，包括阴性对照，培养在SD/-Trp的单缺培养基上都生长。相比之下，当培养在SD/-Trp/-His的双缺培养基上，只有包含全长和C端序列的酵母细胞可以存活，并通过激活报告基因将无色的X-Gal转化为蓝色(图5b)。这些结果表明，基因AtNAC002具有转录激活活性，并且C端在转录激活过程中起到非常重要的作用。

实施例6AtNAC002基因响应铜毒的表型结果

(1)拟南芥琼脂培养

选取大小一致的拟南芥种子(野生型和AtNAC002突变体(nac002))，先用75％的消毒酒精进行灭菌1min，再使用1％的NaClO(w/v)灭菌处理10min，最后在超净工作台中用无菌水清洗3-6次，并在黑暗中于4℃纯化2-3d，然后播种于含有或不含30μmol/L CuSO₄的1/2MS培养基中，放在光照培养室中生长13d左右。

测定拟南芥的根长以及鲜重，结果如图6所示，在正常培养条件下，野生型以及AtNAC002突变体的根长及鲜重没有明显差异，而在铜毒条件下，AtNAC002突变体(nac002)的根长和鲜重相比野生型分别降低了31.46％和54％，显著低于野生型。

(2)铜含量测定

测铜含量的样品为组培13d的拟南芥根系和地上部，将材料存于牛皮纸袋中于烘箱中105℃杀青30min，65℃烘干至样品恒重，用万分之一天平分别称量样品干重。称取0.1000-0.1500g地上部样品和0.0150-0.0450g根部样品于试管中，加入5mL HNO₃/HClO₄混合溶液(v:v＝4:1)，后放置到通风橱中浸泡过夜。于60℃预消煮1h后，将温度升至1260℃，直至冒白烟，消化液呈无色透明或略带黄色时消解完成。冷却至室温后将消化液用去离子水定容至10mL容量瓶中，摇匀，过滤，同时做试剂空白试验。使用原子吸收光谱法(AAS)测定消解液中的铜含量。

测定根和地上部的铜含量，结果如图7所示，在正常条件下，地上部和根中铜含量没有显著差异；在铜毒的条件，地上部铜含量没有显著差异，而突变体根系中铜含量相比野生型提高了47％，显著高于野生型，基因AtNAC002突变体会增加拟南芥根系对铜的吸收，从而抑制植物的生长。

(3)抗氧化酶活性测定

超氧化物歧化酶(SOD)酶活测定

依据超氧化物歧化酶抑制氮蓝四唑(nitro-blue tetrazolium,NBT)在光下的还原作用来确定酶活性的大小。氮蓝四唑在甲硫氨酸和核黄素存在条件下，光照后发生光化还原反应而生成蓝色甲腙，在560nm处有最大光吸收。而SOD可清除O₂ ^-，从而抑制氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，因而在光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明SOD酶活性愈低，反之酶活性愈高。根据超氧化物歧化酶抑制氮蓝四唑(NBT)在光下的还原强度便可表示酶活性的大小。

过氧化物酶(POD)酶活测定

在过氧化物酶催化下，过氧化氢将愈创木酚氧化成茶褐色产物。此产物在470nm有最大光吸收。因此，通过测定470nm下的吸光度变化就可以测定过氧化物酶的活性大小。

过氧化氢酶(CAT)活性的测定

在240nm波长下有强吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度(A240)随反应时间延长而降低。根据测量吸光度的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。

丙二醛(MDA)的测定

MDA是常用的膜脂过氧化指标，在酸性和高温条件下，可与硫代巴比妥酸(TBA)反应生成红棕色三甲基复合物，其最大吸收波长为532nm，在600nm处有最小吸收峰。

分别测定地上部分和根系中上述酶的含量，结果如图8和9所示，在正常和铜毒条件下，突变体根系中SOD、CAT和POD的含量降低，突变体根系中的SOD活性增加，而在地上部只有POD活性显著高于野生型，其他抗氧化酶无显著差异。结果表明，在铜毒的条件下，基因AtNAC002突变体降低了根系中关键抗氧化相关酶的活性，从而增加拟南芥根系中ROS的积累量，进而增加对铜毒的敏感性。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.拟南芥AtNAC002基因在提高拟南芥对铜毒抗性中的应用，其特征在于，所述基因在NCBI中的ID号为At1g01720。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述拟南芥AtNAC002基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.拟南芥AtNAC002转录因子在提高拟南芥对铜毒抗性中的应用，其特征在于，所述拟南芥AtNAC002转录因子具有Ⅰ)或Ⅱ)所示的氨基酸序列：

Ⅰ)如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；或

Ⅱ)在Ⅰ)所述氨基酸序列的基础上经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸的得到的具有相同功能的蛋白质。

4.一种重组载体在提高拟南芥对铜毒抗性中的应用，其特征在于，所述重组载体包含权利要求1或2所述的拟南芥AtNAC002基因。

5.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述拟南芥AtNAC002基因在根系中受铜毒诱导上调表达。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述拟南芥AtNAC002基因在根系中受铜毒诱导上调表达。

7.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述拟南芥AtNAC002基因通过降低拟南芥根系对铜的吸收以提高拟南芥对铜毒的抗性。

8.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述拟南芥AtNAC002转录因子通过降低拟南芥根系对铜的吸收以提高拟南芥对铜毒的抗性。

9.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述拟南芥AtNAC002基因降低拟南芥根系中的铜含量。

10.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述拟南芥AtNAC002转录因子降低拟南芥根系中的铜含量。