CN117660427A - 一种高耐热型腈水合酶突变体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种高耐热型腈水合酶突变体，所述突变体含有α亚基、β亚基以及调控蛋白，所述α亚基、β亚基以及调控蛋白分别含如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2以及SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列，本发明还包括编码所述腈水合酶突变体的基因、含有所述基因的重组载体、表达所述腈水合酶的细胞、提高腈水合酶热稳定性的方法以及生产腈水合酶的方法及腈水合酶的应用，本发明提供的高耐热型腈水合酶突变体具有较高酶活和良好热稳定性，具有较高的商业化价值与推广利用价值。

Description

一种高耐热型腈水合酶突变体及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体而言，涉及一种高耐热型腈水合酶突变体及其应用。

背景技术

腈水合酶(Nitrile hydratase，简称NHase，EC 4.2.1.84)，可以将腈类底物水合，从而转化为相应的酰胺类产物。玫瑰色红球菌J1(节杆菌属)来源的该酶是人们首次发现并报道的腈水合酶[1]。目前生产腈水合酶的微生物有红球菌属(Rhodococccus)、假单胞菌属(Pseudomonas)和短杆菌属(Brevibacterium)等，且其异源表达已在大肠杆菌(Escherichia coli)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、毕赤酵母(Pichiapastoris)等模式菌株中实现。随着对腈水合酶研究的深入，条件温和、选择性强的生物催化法正逐步替代化学合成法，成功应用于工业生产丙烯酰胺、烟酰胺和5-氰基戊酰胺等酰胺类产品。

酰胺类化合物具有较高的商业价值，有许多具有代表性的产品。丙烯酰胺是聚丙烯酰胺的前体，聚丙烯酰胺可用作絮凝剂(废水处理)、土壤改良剂(减轻土壤侵蚀)、原料添加剂(造纸和纸浆工业)以及石油工业(提高石油采收率)。丙烯酰胺还可应用到塑料生产、食品加工，也可用作粘合剂和化妆品添加剂。然而，目前腈水合酶的工业应用仍然存在一定的问题。由于腈的水合是放热反应，这就要求腈水合酶具有较好的热稳定性才能在高温下维持高反应速率。因此，获取兼具较高酶活和良好热稳定性的腈水合酶具有重要意义。

嗜热假诺卡氏菌Pseudonocardia thermophila JCM3095来源的腈水合酶(PtNHase)具有较高的催化活性，但对温度的耐受性还有待提高，因此，提高该腈水合酶的热稳定性具有极大的应用价值和广阔的应用前景。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种高耐热型腈水合酶突变体，以解决腈水合酶的热稳定性一般，且常规嗜热假诺卡氏菌对温度的耐受性较差的问题。

为解决上述问题，本发明提供了一种高耐热型腈水合酶突变体，所述突变体含有α亚基、β亚基以及调控蛋白，所述α亚基、β亚基以及调控蛋白分别含如SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2以及SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。

本发明还包括一种编码所述腈水合酶突变体的基因。

本发明还包括一种所述基因的重组载体。

本发明还包括一种表达所述腈水合酶的细胞。

作为优选的方案，所述细胞包括大肠杆菌。

作为优选的方案，所述细胞是以大肠杆菌BL21为宿主，以pET-系列质粒为载体的细胞。

作为优选的方案，所述质粒为pET-24(+)。

本发明还包括一种提高腈水合酶热稳定性的方法，所述方法是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的腈水合酶β亚基第46位甲硫氨酸突变为丙氨酸。

本发明还包括一种生产腈水合酶的方法，所述方法将表达所述腈水合酶突变体的细胞接种于LB培养基中，37℃培养至OD₆₀₀为0.6-0.8时，加入诱导剂IPTG于24℃诱导12-16h。

作为优选的方案，具体方法为采用同源重组的方法构建包含上述3段氨基酸基序的突变体质粒，在宿主中表达后，通过纯化得到突变体的纯酶，测定热处理前后的比酶活和相对残余酶活并与野生酶进行比较。

本发明还包括所述的腈水合酶突变体或所述的细胞在生产含丙烯酰胺的产品中的应用。

作为优选的方案，所述应用具体包括通过5L发酵罐培养验证及全细胞催化计算转化效率和产率。

上述的5L发酵罐培养，是获得腈水合酶的一种方法：酶需要通过微生物发酵产生，5L发酵罐是培养含有腈水合酶的菌体，如果只得到菌体，即为全细胞，如果把菌体中的腈水合酶提取纯化出来，就是纯酶。

相较于现有技术而言，本发明至少具备以下的技术进步：

本发明提供了一段ptNHase的氨基酸基序及突变体的氨基酸基序，该基序与其他来源的腈水合酶基序在α亚基上酶活中心的108、111和113位点均是高度保守的，它们分别与钴离子形成配位键。同时，进一步说明了上述腈水合酶氨基酸基序中β亚基上的46号位单点突变体(M46A)在腈水合酶生物催化和工业生产上的应用。当对该位点进行突变构建单点突变体时，M46A的比酶活为965.72±79.6U/mg，65℃热处理下半衰期为180.34±1.94min。而野生型腈水合酶的比酶活1331.44±35.5U/mg，65℃热处理下半衰期只有75.29±11.59min。其中突变体M46A的熔融温度(T_m)比野生型高3.62℃。氨基酸残基的突变显著改善了腈水合酶的热稳定性，有利于应用于工业上高附加值化学品如丙烯酰胺的生产，提高催化效率，降低生产成本。

附图说明

图1为野生型和突变体纯酶的SDS-PAGE电泳图；

图2为ptNHase野生酶WT与突变体M46A在65℃下处理不同时间后的残余相对活性；

图3为ptNHase野生酶和突变体M46A的熔融温度测定。

具体实施方式

下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供了一种高耐热型腈水合酶突变体，所述突变体含有α亚基、β亚基以及调控蛋白，所述α亚基、β亚基以及调控蛋白分别含如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2以及SEQ IDNO.3所示的氨基酸序列。

本发明还包括一种编码所述腈水合酶突变体的基因。

本发明还包括一种所述基因的重组载体。

本发明还包括一种表达所述腈水合酶的细胞。

优选的，所述细胞包括大肠杆菌。

优选的，所述细胞是以大肠杆菌BL21为宿主，以pET-系列质粒为载体的细胞。

优选的，所述质粒为pET-24(+)。

本发明还包括一种提高腈水合酶热稳定性的方法，所述方法是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的腈水合酶β亚基第46位甲硫氨酸突变为丙氨酸。

本发明还包括一种生产腈水合酶的方法，所述方法将表达所述腈水合酶突变体的细胞接种于LB培养基中，37℃培养至OD₆₀₀为0.6-0.8时，加入诱导剂IPTG于24℃诱导12-16h。

本发明还包括所述的腈水合酶突变体或所述的细胞在生产含丙烯酰胺的产品中的应用。

本发明下述实施例中采用的培养基以及缓冲液包括：

1、培养基：

LB培养基(L^-1)：胰蛋白胨10g，NaCl 10g，酵母提取物5g，pH 7.0，配制固体培养基时添加琼脂粉16g。

无甘油TB培养基(L^-1)：胰蛋白胨12g，酵母提取物24g，KH₂PO₄2.31g，K₂HPO₄12.54g。

2、缓冲液：

结合缓冲液：20mM Na₂HPO₄·12H₂O，280mM NaCl，6mM KCl，pH 7.4

洗脱缓冲液：20mM Na₂HPO₄·12H₂O，280mM NaCl，6mM KCl，2.5mM d-Desthiobiotin，pH 7.4。

腈水合酶的酶活力(U)：单位酶活力定义为25℃下，每分钟催化丙烯腈生成1μmol丙烯酰胺所需要的酶量。

腈水合酶的比酶活(U/mg)：每毫克腈水合酶所具有的酶活力。

以下提供具体的实施例以对本发明上述的技术方案以及如何构建本发明上述质粒进行展开的描述：

实施例1：腈水合酶突变体的质粒构建

根据本实验室已有ptNHase的野生型质粒pET24a(+)-ptWT(张赛兰,李婷,程中一等.新型耐热腈水合酶的异源表达及其催化工艺研究[J].食品与发酵工业,2020,第46卷(14):108-113)，采用全质粒PCR的方法构建了突变体质粒pET24a(+)-M46A。

首先以质粒pET24a(+)-ptWT为模板，突变序列设计在引物上，通过PCR扩增出碱基序列发生突变的质粒，所用引物序列如表1所示，扩增体系如表2所示，

PCR扩增反应条件为98℃预变性3min，98℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min30s，72℃延伸5min，共30个循环。将PCR产物用DpnI消化酶消化2-3h，转化E.coli BL21(DE3)，涂布于含50mg/L卡那霉素的LB培养基平板，37℃倒置过夜培养。

挑取单菌落接种于5mL LB培养基，37℃、200rpm振荡培养过夜，使用商品化质粒抽提试剂盒获得重组质粒，由苏州金唯智生物科技有限公司进行测序验证，最终得到重构质粒pET24a(+)-M46A。

表1引物序列

(注：F代指上游引物，R代指下游引物)

表2PCR扩增体系

实施例2：野生酶WT与各突变体的表达与纯化

步骤1：将实施例1获得的ptNHase的野生型pET24a(+)-ptWT及重构质粒pET24a(+)-M46A，分别转化E.coli BL21(DE3)，挑取单菌落至5mL LB培养基，37℃、200rpm条件下培养7-8h。将种子液按1％(v/v)接种量转接至100mL 2×YT培养基，37℃、200rpm条件下培养至OD600至0.6-0.8，加入终浓度为0.4mM的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)以及0.05g/L的CoCl₂·6H₂O，改变培养温度为25℃，诱导表达12-16h。

步骤2：采用亲和层析的方法纯化野生型WT及其突变体，纯化柱为GE公司的StrepTrap HP 1mL柱。在10000rpm条件下离心3min收集菌体细胞，用20mL结合缓冲液重悬，于冰水混合物中超声破碎。破碎液在4℃、12000rpm条件下离心20min，取上清液过0.22μm有机滤膜。纯化柱在用结合缓冲液平衡后，进行上样，然后用结合缓冲液洗去杂蛋白，目的蛋白用100％的洗脱缓冲液洗脱并收集。蛋白浓度使用Bradford蛋白浓度检测试剂盒进行定量。采用SDS-PAGE检测目的蛋白的纯化质量，检测如图1所示，可见野生型及其突变体所表达的蛋白在纯化后蛋白条带单一，纯化质量高。

实施例3：ptNHase的野生型及突变体催化效率和热稳定性检测

用10mM KPB(pH 7.4)溶液将WT及其突变体纯酶的浓度稀释至0.05mg/mL，稀释后的纯酶在水浴锅65℃下分别处理0.5、1、1.5、2、2.5、3h后冰浴10min，每个样品取10μL至1.5mL离心管中，置于25℃金属浴上。向离心管中加入490μL底物(100mM丙烯腈溶液)，充分涡旋混匀，25℃下反应5min，然后加入500μL 1MH₃PO₄溶液进行终止。将反应液用KPB溶液稀释适当倍数，过0.22μm滤膜。

液相检测方法：流动相组成为乙腈：水＝1：2(v/v)，流速为0.6mL/min，检测波长为215nm，柱温为40℃，测定反应体系中产物丙烯酰胺的生成量。

定义每个酶在处理时间为0h时酶活力为100％，计算热处理后残余酶活性。半衰期定义为残留酶活性为50％时的热处理时间。野生酶WT和突变体M46A的初始比酶活分别为1331.44±35.5U/mg和965.72±79.6U/mg。计算结果如图2所示。

实施例4：熔融温度的测定

将纯酶用KPB稀释至0.06mg/ml，使用圆二色光谱仪进行Tm值测定，监控波长设置为222nm，温度范围设置为20-98℃。以温度变化为横坐标，CD为纵坐标，取适当范围内斜率最大的点对应的温度即为酶的熔融温度。测定结果如图3所示。

虽然突变体M46A的初始催化效率没有野生型高，但在65℃热处理下，突变体的半衰期为3h，而野生型只有1.5h。另外，突变体M46A的熔融温度Tm比野生型高3.62℃。

对比例：

对比例的质粒构建方法同实施例1，其不同之处在于，对位点46位的酪氨酸进行突变为谷氨酸，按照实施例2制备得到酶突变体，并用于丙烯酰胺的催化反应，结果如图3所示，其催化丙烯腈的酶活为375.29±0.65U/mg，相比突变体L48H低了54％。

通过对比例和实施例的比较，也是进一步地证明了，通过本发明提供的高耐热型腈水合酶突变体解决了现有技术中存在的问题，提供了一种具有较高酶活和良好热稳定性的腈水合酶。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种高耐热型腈水合酶突变体，其特征在于：所述突变体含有α亚基、β亚基以及调控蛋白，所述α亚基、β亚基以及调控蛋白分别含如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2以及SEQ IDNO.3所示的氨基酸序列。

2.一种编码权利要求1所述腈水合酶突变体的基因。

3.一种含有权利要求2所述基因的重组载体。

4.一种表达权利要求1所述腈水合酶的细胞。

5.根据权利要求4所述的细胞，其特征在于，所述细胞包括大肠杆菌。

6.根据权利要求4或5所述的细胞，其特征在于，所述细胞是以大肠杆菌BL21为宿主，以pET-系列质粒为载体的细胞。

7.根据权利要求6所述的细胞，其特征在于，所述质粒为pET-24(+)。

8.一种提高腈水合酶热稳定性的方法，其特征在于，是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的腈水合酶β亚基第46位甲硫氨酸突变为丙氨酸。

9.一种权利要求1所述生产腈水合酶突变体的方法，其特征在于，将表达所述腈水合酶突变体的细胞接种于LB培养基中，37℃培养至OD₆₀₀为0.6-0.8时，加入诱导剂IPTG于24℃诱导12-16h。

10.权利要求1所述的腈水合酶突变体或权利要求4所述的细胞在生产含丙烯酰胺的产品中的应用。