CN117660148A - 一种微滴微流控系统及其在微滴数字化核酸检测中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微流控芯片及核酸检测领域，公开了一种微滴微流控系统及其在微滴数字化核酸检测中的应用。其中，微滴微流控系统包括：流动聚焦结构，用于与外相和内相均连通，并利用外相和内相生成微滴；微流控芯片，与流动聚焦结构相连通，以使微滴能够进入微流控芯片；负压发生装置，与微流控芯片相连通，并用于使微流控芯片和流动聚焦结构均产生负压，以利用负压驱动外相和内相进入流动聚焦结构内，并驱动微滴进入微流控芯片内部。本发明通过利用负压发生装置与流动聚焦结构配合来生产微滴，使得微滴微流控系统的成本大大降低。

Description

一种微滴微流控系统及其在微滴数字化核酸检测中的应用

技术领域

本发明涉及微流控芯片及核酸检测领域，特别是涉及一种微滴微流控系统及其在微滴数字化核酸检测中的应用。

背景技术

微滴微流控系统是近年来新兴的一种生物化学分析新型反应器，它是将预混反应液通过微流控芯片迅速乳化成大小均一、微米级、数量庞大的微微滴群微滴微流控技术在食物传递、药品传输、化学反应、健康监测以及多种化学与生命科学等许多领域中得到了广泛的关注，例如药物敏感性测试、癌症亚型鉴定的多重分析、病毒与宿主的相互作用、单细胞测序多模式和时空分析、以及对免疫细胞、抗体、酶特性的定向进化筛选。

目前，常用的微滴微流控系统包括精密注射泵和微流控芯片，精密注射泵与微流控芯片内部相连通，使用时，利用精密注射泵产生微滴，并将微滴注入微流控芯片内部，常用的微滴微流控系统存在的最主要的缺陷是精密注射泵一般选用美国Harvard品牌Harvard Pump系列的高精度注射泵，该系列高精度注射泵成本较高，导致微滴微流控系统整体成本较高，进而限制了微滴微流控系统的大面积推广使用。

因此，如何克服上述缺陷成为本领域技术人员目前所亟待解决的问题。

发明内容

为解决以上技术问题，本发明提供一种成本更低的微滴微流控系统。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种微滴微流控系统，包括：

流动聚焦结构，用于与外相和内相均连通，并利用所述外相和所述内相生成微滴；

微流控芯片，与所述流动聚焦结构相连通，以使所述微滴能够进入所述微流控芯片；

负压发生装置，与所述微流控芯片相连通，并用于使所述微流控芯片和所述流动聚焦结构均产生负压，以利用所述负压驱动所述外相和内相进入所述流动聚焦结构内，并驱动所述微滴进入所述微流控芯片内部。

可选地，所述微流控芯片包括：透明主体，所述透明主体内部设置有通道，所述通道的两端分别用于与所述流动聚焦结构和所述负压发生装置相连通，且所述通道的高度小于或者等于所述微滴直径，以使所述微滴单层排布于所述通道内。

可选地，所述透明主体包括透明基片和透明盖片，所述透明基片的边缘和所述透明盖片的边缘连接，且二者之间形成所述通道，所述透明基片和所述透明盖片之间的距离小于或者等于所述微滴的直径，以使所述微滴单层排布于所述通道内。

可选地，所述微流控芯片还包括至少两个第一透明分隔件，全部所述第一透明分隔件交错设置于所述透明基片和所述透明盖片之间，以使所述通道呈蛇型结构。

可选地，所述通道内部至少一侧设置有第一限位结构，所述第一限位结构包括沿所述通道的长度方向依次设置的至少两个第一限位凹槽，每个所述第一限位凹槽的槽口均朝向所述通道的中部，所述第一限位凹槽用于卡接所述微滴，以限制所述微滴的移动；

所述第一限位结构与所述通道的内壁之间形成有排放通路，所述排放通路与所述负压发生装置相连通，任意相邻两个所述第一限位凹槽之间均具有第一间隙，每个所述第一间隙均与所述排放通路相连通，且所述第一间隙的尺寸小于所述微滴的尺寸，以使所述微滴无法穿过所述第一间隙进入所述排放通路内。

可选地，所述微流控芯片还包括第二限位结构，所述第二限位结构设置于所述通道用于与所述负压发生装置相连通的一端，所述第二限位结构包括至少两个并排设置的第二限位凹槽，每个所述第二限位凹槽的槽口均朝向所述通道用于与所述流动聚焦结构相连通的一端，所述第二限位凹槽用于卡接所述微滴，以限制所述微滴的移动；

任意相邻两个所述第二限位凹槽之间均具有第二间隙，且所述第二间隙的尺寸小于所述微滴的尺寸，以使所述微滴无法穿过所述第二间隙进入所述负压发生装置内。

可选地，本发明提供的微滴微流控系统还包括：电路板、电压放大器和近红外激光器；

所述电路板与所述电压放大器连接；所述电压放大器与所述近红外激光器连接；所述近红外激光器与所述微流控芯片相连通；

所述电路板内置预设电压信息；所述预设电压信息包括：电压取值范围和电压输出时长；

所述电压放大器用于对所述预设电压信息中的电压取值范围，按照设定比例进行放大处理，得到处理后的电压取值范围；

所述近红外激光器用于根据处理后的电压取值范围和对应的电压输出时长，输出激光，以入射至所述微流控芯片。

可选地，微滴微流控系统还包括缓冲收集容器，所述缓冲收集容器设置于所述微流控芯片和所述负压发生装置之间，并与所述微流控芯片和所述负压发生装置均连通。

本发明还提供了上述方案所述的微滴微流控系统在非诊断目的的微滴数字化核酸检测中的应用。

本发明还提供了一种非诊断目的的微滴数字化核酸检测方法，采用上述技术方案所述的微滴微流控系统实现，包括以下步骤：

将反应预混液和待测样品混合作为内相，以油相为外相，分别加入到流动聚焦结构的不同入口处，通过负压，内相和外相被吸引入流动聚焦结构，经切割得到油包水微滴，在负压作用下，所述油包水微滴进入微流控芯片，在微流控芯片中进行扩增反应，统计荧光微滴比例，由泊松分布定量测得目标核酸分子丰度。

本发明相对于现有技术取得了以下技术效果：

与利用美国Harvard品牌Harvard Pump系列的高精度注射泵生成微滴相比，本发明提供的微滴微流控系统利用价格更低的负压发生装置与流动聚焦结构配合来生成微滴，进而与背景技术提供的微滴微流控系统相比，本发明提供的微滴微流控系统成本更低，更易于大面积推广使用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例中提供的微滴微流控系统的结构示意图；

图2为本发明实施例中提供的微滴微流控系统的部分结构示意图；

图3为本发明实施例中提供的第一限位结构的部分结构示意图；

图4为本发明实施例中提供的实施例中提供的十字交叉-流动交汇式微流道的部分结构示意图；

图5为本发明实施例1制备的典型微滴的明场光镜图和扫描电镜图；

图6为本发明实施例1的微滴微流控系统中制备微滴并填充满通道的效果图；

图7为本发明实施例1中所制备的密排微滴群在60℃条件下原位孵育后荧光拍照图和统计图；其中，(a)为荧光拍照图，比例：100μm，从左到右，从上到下，对应的DNA分子浓度依次为0、0.005、0.05、0.5、1、2个拷贝数/微滴；(b)为泊松分布统计结果；

图8为本发明实施例3形成微滴的尺寸大小、均匀度(标准差)与负压真空度的关系；

图9为本发明实施例提供的微滴微流控系统的电路图；

图10为本发明实施例提供的电路板和电压放大器的连接示意图；

图11为本发明实施例3中提供的微滴微流控系统的结构示意图。

图1-图3附图标记说明：1、流动聚焦结构；101、支管路；2、微流控芯片；201、通道；202、排放通路；203、第一限位凹槽；204、第二限位凹槽；205、第一间隙；206、第一透明分隔件；207、第二透明分隔件；208、第三透明分隔件；209、蛇型管；210、阻隔结构；3、缓冲收集容器；4、真空调节阀；5、真空泵；6、连通管；7、通路；8、透明分隔柱。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明的目的是提供一种成本更低的微滴微流控系统。

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

参考图1-图3所示，本发明实施例中提供的微滴微流控系统，包括：流动聚焦结构1、微流控芯片2以及负压发生装置。

具体而言，流动聚焦结构1用于与外相和内相均连通，并利用外相和内相生成微滴，流动聚焦结构1包括但不限于为T型微流道或者十字交叉-流动交汇式微流道，微滴例如为油包水微滴。

图2中流动聚焦结构1为十字交叉-流动交汇式微流道，且为了稳定系统内部压力，十字交叉-流动交汇式微流道的四个支管路101上均连接有蛇型管209。具体使用使用过程中，将反应预混液和待测样品混合作为内相，以油相为外相，内相注入其中两个支管路101，外相注入另外两个支管路101，并在四个支管路101的交汇处汇聚形成微滴。需要说明的是，T型微流道和十字交叉-流动交汇式微流道的具体结构均属于现有技术，在此不再赘述。

微流控芯片2与流动聚焦结构1相连通，以使微滴能够进入微流控芯片2。

负压发生装置与微流控芯片2相连通，并用于使微流控芯片2和流动聚焦结构1均产生负压，以利用负压驱动外相和内相进入流动聚焦结构1内，并驱动微滴进入微流控芯片2内部。

与利用精密注射泵生成微滴相比，本发明提供的微滴微流控系统利用价格更低的负压发生装置与流动聚焦结构1配合来生成微滴，进而与背景技术提供的微滴微流控系统相比，本发明提供的微滴微流控系统成本更低，更易于大面积推广使用。

于本发明另一实施例中，如图2所示，微流控芯片2包括：透明主体，透明主体内部设置有通道201，通道201的两端分别用于与流动聚焦结构1和负压发生装置相连通，且通道201的高度小于或者等于微滴直径，以使微滴单层排布于通道201内，完成对微滴群在芯片内原位恒温或热循环孵育、荧光拍照等微滴数字化核酸检测应用，用以dPCR和dLAMP扩增和检测致病菌等靶标的DNA分子。

进一步地，透明主体包括透明基片和透明盖片，透明基片的边缘和透明盖片的边缘连接，且二者之间形成通道201。透明基片和透明盖片之间的距离小于或者等于微滴的直径，以使微滴单层排布于通道201内。透明基片例如采用聚二甲基硅氧烷材料制成，透明盖片例如采用无机玻璃制成。

更进一步地，如图2所示，微流控芯片2还包括至少两个第一透明分隔件206，全部第一透明分隔件206交错设置于透明基片和透明盖片之间，以使通道201呈蛇型结构。第一透明分隔件206例如为透明分隔板。

在其它实施例中，第一透明分隔件206的材料可以与透明基片的材料相一致，且可采用光刻法，直接在透明基片上成型第一透明分隔件206。

进一步地，通道201内部至少一侧设置有第一限位结构，第一限位结构包括沿通道201的长度方向依次设置的至少两个第一限位凹槽203，第一限位凹槽203的详细数量根据实际需要而定。每个第一限位凹槽203的槽口均朝向通道201的中部，需要说明的是，这里的中部指的是通道201的轴线所处的位置。第一限位凹槽203用于卡接微滴，以限制微滴的移动，第一限位凹槽203例如为V型槽，进一步地，V型槽相对两个侧壁之间的最小距离小于微滴的直径，最大距离大于微滴的直径。

第一限位结构与通道201的内壁之间形成有排放通路202，排放通路202与负压发生装置相连通，任意相邻两个第一限位凹槽203之间均具有第一间隙205，每个第一间隙205均与排放通路202相连通，且第一间隙205的尺寸小于微滴的尺寸，以使微滴无法穿过第一间隙205进入排放通路202内。

具体使用过程中，微滴卡入第一限位凹槽203内之后，随着其它微滴的移动，卡入第一限位凹槽203内的微滴会与第一限位凹槽203的侧壁相碰撞，当微滴为油包水微滴时，微滴与第一限位凹槽203的侧壁碰撞过程中，微滴表面部分油相会与微滴相分离，并随着其它微滴沿着通道201的长度方向移动，当分离的油相移动至第一间隙205位置时，会穿过第一间隙205进入排放通路202内，并经排放通路202排出，从而实现微滴密排。

作为另一种具体的实施方式，如图2所示，通道201内部相对的两侧均设置有第一限位结构。

进一步地，如图2所示，微流控芯片2还包括第二限位结构，第二限位结构设置于通道201用于与负压发生装置相连通的一端，第二限位结构能够阻止微滴进入负压发生装置，第二限位结构包括至少两个并排设置的第二限位凹槽204，每个第二限位凹槽204的槽口均朝向通道201用于与流动聚焦结构1相连通的一端。第二限位凹槽204用于卡接微滴，以限制微滴的移动。同理，第二限位凹槽204例如为V型槽，且V型槽相对两个侧壁之间的最小距离小于微滴的直径，最大距离大于微滴的直径。

任意相邻两个第二限位凹槽204之间均具有第二间隙，且第二间隙的尺寸小于微滴的尺寸，以使微滴无法穿过第二间隙进入负压发生装置内。

具体使用过程中，微滴卡入第二限位凹槽204内之后，同样随着其它微滴的移动，卡入第二限位凹槽204内的微滴会与第二限位凹槽204的侧壁相碰撞，当微滴为油包水微滴时，微滴与第二限位凹槽204的侧壁碰撞过程中，微滴表面部分油相会与微滴相分离，并随着其它微滴移动，当分离的油相移动至第二间隙位置时，会穿过第二间隙自通道201内排出，从而实现微滴密排。

进一步地，为了更好地阻止微滴进入负压发生装置，第二限位结构的数量为至少两个，全部第二限位结构沿通道201的长度方向依次设置。

进一步地，如图2所示，微流控芯片2还包括至少两个第二透明分隔件207和至少两个第三透明分隔件208，全部第二透明分隔件207均设置于通道201内，并均匀布置于通道201与流动聚焦结构1相连通的一端，全部第三透明分隔件208均设置于通道201内，并均匀布置于通道201与负压发生装置相连通的一端。第二透明分隔件207和第三透明分隔件208例如均匀透明分隔柱，且第二透明分隔件207和第三透明分隔件208例如与透明基片的材料相一致，并采用光刻法成型于透明基片上。使用过程中，第二透明分隔件207能够使微滴均匀进入通道201内。

进一步地，如图2所示，为了避免杂质进入流动聚焦结构1内，在流动聚焦结构1的每个入口内部均设置有至少两个阻隔结构210，任意相邻两个间隔结构之间均具有间距，间距的大小要小于需要过滤杂质的大小，以避免杂质穿过相邻两个阻隔结构210之间进入流动聚焦结构1内，阻隔结构210包括但不限于为阻隔块。

需要说明的是，当设置有第二限位结构时，排放管路排放出的油相需要穿过第二间隙才能进入负压发生装置内。另外，微流控芯片2还可以是其它结构，本实施例中仅提供了一种可实施的方式，例如当无需实现微滴密排时，如图11所示，微流控芯片2还可以为以下结构：

具体地，微流控芯片2包括透明主体，透明主体内部设置有通路7，通路7内设置有多个透明分隔柱8，通路7的两端分别用于与流动聚焦结构1和负压发生装置相连通，透明分隔柱8用于分隔微滴，使微滴均匀布置于通路7内。

于本发明另一实施例中，如图1所示，负压发生装置包括真空泵5和真空调节阀4，真空泵5、真空调节阀4以及微流控芯片2依次连通。真空泵5用于产生负压，真空调节阀4用于调节负压的大小。真空泵5例如选用PENGPU公司型号为G4BL1273S的真空泵5，真空调节阀4例如选用Seeedstudio公司型号为UNO R3的真空调节阀4。另外，为了避免微滴尺寸不均匀，微滴微流控系统内压强的调整范围例如为-5至-20bar。

作为一种可选的实施方式，微滴微流控系统还包括：电路板、电压放大器和近红外激光器。电路板与电压放大器连接；电压放大器与近红外激光器连接；近红外激光器与微流控芯片相连通。

电路板内置预设电压信息；预设电压信息包括：电压取值范围和电压输出时长；电压放大器用于对预设电压信息中的电压取值范围，按照设定比例进行放大处理，得到处理后的电压取值范围。

近红外激光器用于根据处理后的电压取值范围和对应的电压输出时长，输出激光，以入射至微流控芯片。激光入射至微流控芯片后，照射在微滴上，可以改善热循环温度，进行温度的调节。

具体地，负压发生装置的电路图见图9。在图9中，该负压发生装置还包括两个开关电源，即一号0-24V开关电源和二号0-24V开关电源。一号0-24V开关电源用于向电压放大器提供电源；而二号0-24V开关电源用于向近红外激光器提供电源。

其中，电路板和电压放大器的连接结构的细节图见图10。

此外，关于电路板对于内置预设电压信息进行控制处理的过程，具体的代码操作信息如下：

const int ledPin＝3；定义ledPin函数是Arduind电路板的三号引脚的高电平数据

int cycle＝3；循环函数，可以与count函数配合着设置循环过程

int count＝0；定义一个循环函数，名字叫count，设初值为0

void setup(){定义一个循环

while(count<1){当count函数<1时，执行下面括号里的语句

analogWrite(ledPin,153)；设定输出功率为6W，激光器的输出功率＝(10W-0W)/255×ledPin赋的值

Delay(45000)；设定持续光照时间为45秒

analogWrite(ledPin,68)；设定输出功率为2.667W，激光器的输出功率＝(10W-0W)/255×ledPin赋的值

Delay(30000)；设定持续光照时间为30秒

analogWrite(ledPin,0)；设定输出功率为0，即激光器关闭

Delay(70000)；设定关闭时间为70秒

analogWrite(ledPin,153)；设定输出功率为6W，激光器的输出功率＝(10W-0W)/255×ledPin赋的值

Delay(5000)；设定持续光照时间为5秒

analogWrite(ledPin，68)；设定输出功率为2.667W，激光器的输出功率＝(10W-0W)/255×ledPin赋的值

Delay(60000)；设定持续光照时间为60秒

count++；count函数的值加1

}结束该循环

while(count＝＝1){当count函数＝1时，执行下面括号里的语句

digitalWrite(ledPin，0)；设定输出功率是0W

Delay(2000)；设定0W持续2秒，但是重复着2s无限次。即关闭程序和激光。

于本发明另一实施例中，微滴微流控系统还包括缓冲收集容器3，缓冲收集容器3设置于微流控芯片2和负压发生装置之间，并与微流控芯片2和负压发生装置均连通。缓冲收集容器3能够起到缓冲收集微流控芯片2排出的液体，例如上述油相或者微滴，并能够起到防倒吸的作用。

在其它具体的实施例中，缓冲收集容器3例如与负压发生装置的真空调节阀4相连通。更进一步地，如图1所示，流动聚焦结构1、微流控芯片2、缓冲收集容器3、真空调节阀4以及真空泵5依次通过连通管6连通。

缓冲收集容器3例如为PE管、二通缓冲瓶、发酵罐或补料瓶。另外，可以在缓冲收集容器3内部安放试管，将试管与微流控芯片2相连通，利用试管来收集微滴。

本发明还提供了上述方案所述的微滴微流控系统在非诊断目的的微滴数字化核酸检测中的应用。

在本发明中，所述核酸检测优选的包括LAMP(环介导等温扩增技术)、RPA(重组酶聚合酶扩增)、CRISPR、HDA、RCA、MDA、NASBA和PCR(聚合酶链式反应)中的一种或几种。

本发明的微滴微流控系统可有效、便捷方便地应用在微滴数字化LAMP、RPA、PCR等核酸检测场景，适宜推广，在健康卫生和公共安全等多领域具有深刻的社会和临床价值。

本发明还提供了一种非诊断目的的微滴数字化核酸检测方法，采用上述技术方案所述的微滴微流控系统实现，包括以下步骤：

将反应预混液和待测样品混合作为内相，以油相为外相，分别加入到流动聚焦结构1的不同入口处，通过负压，内相和外相被吸引入流动聚焦结构1，经切割得到油包水微滴，在负压作用下，所述油包水微滴进入微流控芯片，在微流控芯片中进行扩增反应，统计荧光微滴比例，由泊松分布定量测得目标核酸分子丰度。

在本发明中，所述反应预混液优选的包括引物、荧光探针和反应试剂；所述油相包括含有亲水性的纳米粒子类型表面活性剂的HFE7500油相。在本发明中，所述亲水性的纳米粒子类型表面活性剂优选为含氟界面活性剂，所述HFE7500油相中含氟界面活性剂的质量浓度优选为2％。

在本发明中，所述反应预混液优选的还包括琼脂糖和/或明胶，以加工具有温敏特性的水凝胶微滴用以核酸检测，能有效改善水微滴易碎、不易保存等不足；所述反应预混液中琼脂糖的质量体积浓度(w/v)优选为0.25％～1.5％，更优选为0.5％～1％，避免高浓度阻碍DNA分子的反应扩散；所述反应预混液中明胶的质量体积浓度优选为1％～10％，更优选为3％～8％，进一步优选为5％，避免高浓度阻碍DNA分子的反应扩散。

在本发明的一个实施例中，所述微滴数字化核酸检测为肺炎杆菌的微滴数字化LAMP检测；所述肺炎杆菌的微滴数字化LAMP检测的反应预混液以50μL计，包括以下组分：浓度为10μM的每种引物各2μL、浓度为800nM的Cyto9荧光探针、BSA、10V/V％tween 20和反应试剂；所述肺炎杆菌的微滴数字化LAMP检测用到的引物包括F3、B3、LB和F2；所述F3的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：GAATATCTGCAGTCCCGCG；所述B3的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示，具体为：CGATTTGTACGCCGTGAATG；所述LB的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，具体为：GATCGGTGACCTGTTTATGTG；所述F2的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，具体为：GCAGCTTCGATTGTGCCA；所述F3、B3、LB和F2的浓度独立优选为100、200、300、400或500nM；所述肺炎杆菌的微滴数字化LAMP检测用到的荧光探针优选为Cyto9或Cyto82；所述Cyto9优选为Invitrogen S34854，颜色为绿色；所述Cyto82的颜色为橙色；所述肺炎杆菌的微滴数字化LAMP检测用到的反应液优选为购自于诺唯赞的P701；所述肺炎杆菌的微滴数字化LAMP检测的扩增程序优选为60℃、20～30min。

在本发明的一个实施例中，所述微滴数字化核酸检测为2019-nCoV E1基因片段的琼脂糖凝胶微滴数字LAMP检测；所述2019-nCoV E1基因片段的琼脂糖凝胶微滴数字LAMP检测的反应预混液以50μL计，包括以下组分：琼脂糖0.5w/v％、浓度为10μM的每种引物各0.5μL、浓度为1000nM的Cyto82荧光探针、BSA、10V/V％tween 20和反应试剂；所述2019-nCoV E1基因片段的琼脂糖凝胶微滴数字LAMP检测以含有体积浓度为2％的含氟界面活性剂的HFE7500油相为外相；所述2019-nCoV E1基因片段的琼脂糖凝胶微滴数字LAMP检测用到的引物包括C-FIP、C-BIP、C-LF、C-LB、C-F3和C-B3；所述C-FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，具体为：ACCACGAAAGCAAGAAAAAGAAGTTCGTTTCGGA AGA GACAG；所述C-BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，具体为：TTGCTAGT TACACTAGCCATCCTTAGGTTTTACAAGACTCACGT；所述C-LF的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，具体为：CGCTATTAACTATTAACG；所述C-LB的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，具体为：GCGCTTCGATTGTGTGCGT；所述C-F3的核苷酸序列如SEQ IDNO.9所示，具体为：TGAGTAC GAACTTATGTACTCAT；所述C-B3的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，具体为：TTCAGATTTTTAACACGAGAGT；所述2019-nCoV E1基因片段的琼脂糖凝胶微滴数字LAMP检测的扩增程序优选为：60℃、20～30min。

在本发明的一个实施例中，所述微滴数字化核酸检测为大肠杆菌的微滴数字化dPCR检测；所述大肠杆菌的微滴数字化dPCR检测的反应预混液以50μL计，包括以下组分：浓度为10μM的每种引物各0.5μL、浓度为1000nM的TaqMan荧光探针、BSA、10％tween 20和反应试剂；所述TaqMan荧光探针包括Cy5和FAM；所述大肠杆菌的微滴数字化dPCR检测以含有体积浓度为2％的含氟界面活性剂的HFE7500油相为外相；所述大肠杆菌的微滴数字化dPCR检测采用的引物包括上游引物和下游引物；所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，具体为：GCTACCGCGATAACTGTCAT；所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，具体为：TGGAGAACCGTTCCACTCTA；所述大肠杆菌的微滴数字化dPCR检测的扩增程序优选为：95℃、3min；95℃、30s，55℃、60s，68℃、60s，34个循环。

在本发明的另一个实施例中，所述微滴数字化核酸检测为肺炎克雷伯菌的微滴数字化dPCR检测；所述肺炎克雷伯菌的微滴数字化dPCR检测的反应预混液以50μL计，包括以下组分：浓度为10μM的每种引物各0.5μL、浓度为1000nM的TaqMan荧光探针、BSA、10％tween20和反应试剂；所述TaqMan荧光探针包括Cy5和FAM；所述肺炎克雷伯菌的微滴数字化dPCR检测以含有体积浓度为2％的含氟界面活性剂的HFE7500油相为外相；所述肺炎克雷伯菌的微滴数字化dPCR检测采用的引物包括上游引物和下游引物；所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，具体为：GCGTGGCGGTAGATCTAAGTCATA；所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示，具体为：TTCAGCTCCGCCACAAAGGTA；所述肺炎克雷伯菌的微滴数字化dPCR检测的扩增程序优选为：95℃、3min；95℃、30s，55℃、60s，68℃、60s，34个循环。

为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种微滴微流控系统及其在非诊断目的的微滴数字化核酸检测中的应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1本发明提供的微滴微流控系统用于微滴数字LAMP法高效检测肺炎杆菌病原体DNA分子，方法如下：

(1)开发微滴微流控系统

微滴微流控系统以真空泵G4BL1273S作为负压发生装置，通过PU导管串接真空调节阀IRV10-LC06B、再由鲁尔接头连接具有缓冲和防倒吸作用的缓冲收集容器，最终由外径为1.2mm的PE2导管作为装置的外接端口，与微流控芯片相连接。另外，选择十字交叉-流动交汇式微流道制备微滴，十字交叉-流动交汇式微流道各个支管路的宽度均为75μm、深度均为60μm，具体图4中d指示的是支管路的宽度，且支管路的深度方向与支管路的宽度方向以及支管路内液体的流动方向均垂直。

微流控芯片的通道内部设置有第一限位结构和第二限位结构。第一限位结构与通道的内壁之间形成有排放通路，排放通路与负压发生装置相连通。第一限位结构包括沿通道的长度方向依次设置的至少两个并排设置的第一限位凹槽203，第一限位凹槽203为V型槽。第二限位结构设置于通道用于与负压发生装置相连通的一端，第二限位结构能够阻止微滴进入负压发生装置，第二限位结构包括至少两个并排设置的第二限位凹槽204，第二限位凹槽204为V型槽，每个第二限位凹槽204的槽口均朝向通道用于与流动聚焦结构1相连通的一端。第一限位凹槽203和第二限位凹槽204均用于卡接微滴，以限制微滴的移动，第一限位凹槽203和第二限位凹槽204的最大宽度均为135μm。每个第一限位凹槽203的槽口均朝向通道的轴线所处的位置。任意相邻两个第一限位凹槽203之间均具有第一间隙205，每个第一间隙205均与排放通路202相连通，第一间隙205的尺寸为20μm，以使微滴无法穿过第一间隙进入排放通路内，任意相邻两个第二限位凹槽204之间均具有第二间隙，且第二间隙的尺寸小于微滴的尺寸，以使微滴无法穿过第二间隙进入负压发生装置，第二间隙的尺寸为20μm。同时，微流控芯片还设置有若干个第二透明分隔件和若干个第三透明分隔件，全部第二透明分隔件均设置于通道内，并均匀布置于通道与流动聚焦结构1相连通的一端，全部第三透明分隔件均设置于通道内，并均匀布置于通道与负压发生装置相连通的一端。第二透明分隔件和第三透明分隔件与透明基片的材料相一致，并采用光刻法成型于透明基片上。使用过程中，第二透明分隔件能够使微滴均匀进入通道内。

通过上述设置，能实现微流控芯片内微滴单层密排。

(2)将步骤(1)的微滴微流控系统应用于微滴数字化LAMP对肺炎杆菌病原体DNA分子的高效检测

引物：

F3：GAATATCTGCAGTCCCGCG、B3：CGATTTGTACGCCGTGAATG、LB：GATCGGTGACCTGTTTATGTG、F2：GCAGCTTCGATTGTGCCA。

将由2μL引物(每份10μM)、Cyto9荧光探针(800nM)、BSA、10％tween20和反应试剂组成的共50μL的LAMP预混液和待测样品混合作为内相，以含有2％含氟界面活性剂的HFE7500油相为外相，分别吸入移液枪头，倒插在流动聚焦结构1的不同支路管处。将步骤(1)所搭建的负压发生装置串接在微流控芯片出口末端，通电并设定所需真空度为12Bar，两相物系被吸引入芯片，在流动聚焦结构1处交汇，经切割得到直径约为116μm的均匀油包水微滴，所得到的微滴粒径均匀、球形度好、大小可调控(如图5所示)，大约4～5min微滴填满微流控芯片的通道(如图6所示)。关闭真空泵，将芯片放在60℃热台孵育20～30min，扫场拍照统计荧光微滴比例，随着肺炎杆菌病原体的DNA分子浓度增加，统计荧光微滴比例增大，与样品中核酸分子的理论数值一致，最终由泊松分布定量测得目标核酸分子丰度(如图7所示)。逐级稀释实验结果显示能精准定量检测0.2～20×10⁴个DNA分子，并具有很好的线性度。

实施例2本发明提供的微滴微流控系统用于微滴数字LAMP法高效检测2019-nCoVE1基因片段，方法如下：

(1)除十字交叉-流动交汇式微流道各个支管路的宽度均为30μm、深度均为50μm，第一间隙和第二间隙的尺寸均为15μm，第一限位凹槽203和第二限位凹槽204的最大宽度均为80μm外，其余和实施例1相同。

(2)将步骤(1)的微滴微流控系统应用于微滴数字化LAMP对2019-nCoV E1基因片段的高效检测

将由琼脂糖(0.5w/v％)、0.5μL引物(每份10μM)、Cyto82荧光探针(1000nM)、BSA、10％tween 20和反应试剂在内的LAMP预混液(共50μL)和待测样品混合作为内相，以含有2％含氟界面活性剂的HFE7500油相为外相，分别吸入移液枪头，倒插在流动聚焦结构1的不同支路管处。引物序列为C-FIP：ACCACGAAAGCAAGAAAAAGAAGTTCGTTTCGGAAGA GACAG；C-BIP：TTGCTAGT TACACTAGCCATCCTTAGGTTTTACAAGACTCACGT；C-LF：CGCTATTAACTATTAACG；C-LB：GCGCTTCGATTGTGTGCGT；C-F3：TGAGTAC GAACTTATGTACTCAT；C-B3：TTCAGATTTTTAACACGAGAGT。将步骤(1)所搭建的负压发生装置串接在微流控芯片出口末端，通电并设定所需真空度为9Bar，两相物系被吸引入芯片，在流动聚焦结构1处交汇，经切割得到直径约为60μm的均匀油包水琼脂糖微滴，所得到的微滴粒径均匀、球形度好、大小可调控。大约6min微滴填满微流控芯片的通道。关闭真空泵，将微流控芯片放在60℃热台孵育20～30min，扫场拍照统计荧光微滴比例，随着2019-nCoV E1基因片段浓度增加，统计荧光微滴比例增大，与样品中核酸分子的理论数值一致，最终由泊松分布定量测得目标核酸分子丰度。逐级稀释实验结果显示能精准定量检测0.2～20×10⁴个DNA分子，并具有很好的线性度。

实施例3本发明提供的微滴微流控系统分别用于微滴数字PCR法高效检测大肠杆菌和肺炎克雷伯菌的DNA分子，方法如下：

(1)开发微滴微流控系统

该微滴微流控系统以微型真空泵(G4BL1273S)作为负压发生装置，通过PU导管串接真空调节阀(IRV10-LC06B)、再由鲁尔接头连接定制的具有缓冲和防倒吸作用的缓冲收集容器，最终由外径为1.2mm的PE2导管作为装置的外接端口，与微流控芯片相匹配。另外，如图11所示，选择并行的两个流动聚焦结构1均与微流控芯片2相连通，同步制备微滴，流动聚焦结构1各个支管路的宽度均为的宽度均为75μm、深度均为60μm，下游连接图11所示的微流控芯片。

(2)将步骤(1)的微滴微流控系统分别应用于微滴数字化PCR对大肠杆菌和肺炎克雷伯菌的高效检测

将由0.5μL引物(每份10μM)、TaqMan荧光探针(1000nM，Cy5和FAM荧光标记)、BSA、10％tween 20和反应试剂在内的PCR预混液(50μL)和待测样品混合分别作为内相，以含有2％含氟界面活性剂的HFE7500油相为外相，分别吸入移液枪头，倒插在流动聚焦结构1的不同支路管处。大肠杆菌扩增引物为F：GCTACCGCGATAACTGTCAT；R：TGGAGAACCGTTCCACTCTA；肺炎克雷伯菌扩增引物为F：GCGTGGCGGTAGATCTAAGTCATA；R：TTCAGCTCCGCCACAAAGGTA。将步骤(1)所搭建的负压发生装置串接在微流控芯片出口末端，通电并设定所需真空度为12Bar，两相物系被吸引入芯片，在流动聚焦结构1处交汇，经切割制备直径约为100μm的均匀油包水微滴，所得到的微滴粒径均匀、球形度好、大小可调控。

微滴一并收集进缓冲收集容器的PCR小管中，随后在上表面盖上30μL的矿物油防挥发，在PCR仪内完成过程：95℃ 3min，(95℃ 30s，55℃ 60s，68℃ 60s)*34个循环。扫场拍照统计荧光微滴比例，随着细菌DNA分子浓度增加，统计荧光微滴比例增大，与样品中核酸分子的理论数值一致，最终由泊松分布定量测得目标核酸分子丰度，具体尺寸大小、均匀度(标准差)与负压真空度的关系如图8。逐级稀释实验结果显示能精准定量检测0.2～20×10⁴个DNA分子，并具有很好的线性度，。

本说明书中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处。综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

Claims (10)

1.一种微滴微流控系统，其特征在于，包括：

流动聚焦结构，用于与外相和内相均连通，并利用所述外相和所述内相生成微滴；

微流控芯片，与所述流动聚焦结构相连通，以使所述微滴能够进入所述微流控芯片；

负压发生装置，与所述微流控芯片相连通，并用于使所述微流控芯片和所述流动聚焦结构均产生负压，以利用所述负压驱动所述外相和内相进入所述流动聚焦结构内，并驱动所述微滴进入所述微流控芯片内部。

2.根据权利要求1所述的微滴微流控系统，其特征在于，所述微流控芯片包括：透明主体，所述透明主体内部设置有通道，所述通道的两端分别用于与所述流动聚焦结构和所述负压发生装置相连通，且所述通道的高度小于或者等于所述微滴直径，以使所述微滴单层排布于所述通道内。

3.根据权利要求2所述的微滴微流控系统，其特征在于，所述透明主体包括透明基片和透明盖片，所述透明基片的边缘和所述透明盖片的边缘连接，且二者之间形成所述通道，所述透明基片和所述透明盖片之间的距离小于或者等于所述微滴的直径，以使所述微滴单层排布于所述通道内。

4.根据权利要求3所述的微滴微流控系统，其特征在于，所述微流控芯片还包括至少两个第一透明分隔件，全部所述第一透明分隔件交错设置于所述透明基片和所述透明盖片之间，以使所述通道呈蛇型结构。

5.根据权利要求2所述的微滴微流控系统，其特征在于，所述通道内部至少一侧设置有第一限位结构，所述第一限位结构包括沿所述通道的长度方向依次设置的至少两个第一限位凹槽，每个所述第一限位凹槽的槽口均朝向所述通道的中部，所述第一限位凹槽用于卡接所述微滴，以限制所述微滴的移动；

所述第一限位结构与所述通道的内壁之间形成有排放通路，所述排放通路与所述负压发生装置相连通，任意相邻两个所述第一限位凹槽之间均具有第一间隙，每个所述第一间隙均与所述排放通路相连通，且所述第一间隙的尺寸小于所述微滴的尺寸，以使所述微滴无法穿过所述第一间隙进入所述排放通路内。

6.根据权利要求2所述的微滴微流控系统，其特征在于，所述微流控芯片还包括第二限位结构，所述第二限位结构设置于所述通道用于与所述负压发生装置相连通的一端，所述第二限位结构包括至少两个并排设置的第二限位凹槽，每个所述第二限位凹槽的槽口均朝向所述通道用于与所述流动聚焦结构相连通的一端，所述第二限位凹槽用于卡接所述微滴，以限制所述微滴的移动；

任意相邻两个所述第二限位凹槽之间均具有第二间隙，且所述第二间隙的尺寸小于所述微滴的尺寸，以使所述微滴无法穿过所述第二间隙进入所述负压发生装置内。

7.根据权利要求1所述的微滴微流控系统，其特征在于，还包括：电路板、电压放大器和近红外激光器；

所述电路板与所述电压放大器连接；所述电压放大器与所述近红外激光器连接；所述近红外激光器与所述微流控芯片相连通；

所述电路板内置预设电压信息；所述预设电压信息包括：电压取值范围和电压输出时长；

所述电压放大器用于对所述预设电压信息中的电压取值范围，按照设定比例进行放大处理，得到处理后的电压取值范围；

所述近红外激光器用于根据处理后的电压取值范围和对应的电压输出时长，输出激光，以入射至所述微流控芯片。

8.根据权利要求1-7任一项所述的微滴微流控系统，其特征在于，还包括缓冲收集容器，所述缓冲收集容器设置于所述微流控芯片和所述负压发生装置之间，并与所述微流控芯片和所述负压发生装置均连通。

9.权利要求1～8任一项所述的微滴微流控系统在非诊断目的的微滴数字化核酸检测中的应用。

10.一种非诊断目的的微滴数字化核酸检测方法，其特征在于，采用权利要求1～8中任意一项所述的微滴微流控系统实现，包括以下步骤：

将反应预混液和待测样品混合作为内相，以油相为外相，分别加入到流动聚焦结构的不同入口处，通过负压，内相和外相被吸引入流动聚焦结构，经切割得到油包水微滴，在负压作用下，所述油包水微滴进入微流控芯片，在微流控芯片中进行扩增反应，统计荧光微滴比例，由泊松分布定量测得目标核酸分子丰度。