CN117630250A - 一种O-GlcNAc和磷酸化共修饰的RNA结合蛋白质的富集和鉴定方法 - Google Patents
一种O-GlcNAc和磷酸化共修饰的RNA结合蛋白质的富集和鉴定方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种O‑GlcNAc糖基化和磷酸化共修饰的RNA结合蛋白质的富集和鉴定方法。利用代谢标记EU使RNA具有炔基，再用炔基与叠氮的点击化学反应在RNA‑蛋白质复合物上引入生物素，可以特异性地与商业化的链霉亲和素磁珠结合；接着串联HILIC富集，利用其与亲水性组分的相互作用实现O‑GlcNAc与磷酸化RNA结合蛋白的特异性富集。
Description
技术领域
本发明属于分析化学领域，具体涉及一种O-GlcNAc糖基化和磷酸化共修饰的RNA结合蛋白质的富集和鉴定方法。
背景技术
人类蛋白质组中存在超过4000种RNA结合蛋白质(RNAbinding proteins，RBPs)可与RNA结合形成种类繁多、功能各异的复合物。RNA结合蛋白上存在多种翻译后修饰(Post-translational modification,PTM)，其中O-GlcNAc糖基化和磷酸化是最主要的两种。磷酸化是RNA结合蛋白中存在最多的修饰，O-GlcNAc是一种广泛分布于细胞核、细胞质和线粒体的单糖修饰。O-GlcNAc和磷酸化共同可以修饰在相同的氨基酸位点或同一条肽段相邻的氨基酸位点上，这种相互影响称为串扰(crosstalk)，而且O-GlcNAc磷酸化串扰(O-Pcrosstalk，OPCT)广泛存在于多种生命活动中，共同调节转录、翻译、代谢，以及对缺氧低糖等外界压力的响应。对RNA结合蛋白O-GlcNAc和磷酸化修饰的定性定量分析有助于深入研究OPCT，从而发现其在关键生命活动中的调控机制。近年来已经开发了多种RNA结合蛋白富集方法，例如基于寡聚脱氧胸苷[oligo(dT)]富集策略、基于点击化学的富集方法和基于有机相分离的方法等。也有许多单独研究O-GlcNAc RNA结合蛋白和磷酸化RNA结合蛋白的方法报道。尽管这些富集策略有效促进了RNA结合蛋白的识别和功能研究，但是由于缺乏同时富集和在组学层面分析RBP上O-GlcNAc和磷酸化的方法，目前对受OPCT调控的RNA结合蛋白进行大规模研究仍然是一大挑战。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种在生理条件下对同时具有O-GlcNAc和磷酸化两种修饰的RNA结合蛋白的串联富集和鉴定新方法。
该方法通过5-炔基尿苷(5-ethynyluridine，EU)在生理条件下代谢标记细胞内源RNA，首先对紫外交联的RNA-蛋白质复合物进行大规模富集；接着串联亲水相互作用色谱(Hydrophilic interaction liquid chromatography，HILIC)，最终实现对同时具有O-GlcNAc和磷酸化的RNA结合蛋白的大规模富集与鉴定。后续结合蛋白质组质谱分析，可以在细胞水平实现O-GlcNAc和磷酸化RNA结合蛋白质的全面解析。
本发明所提供的对同时具有O-GlcNAc和磷酸化两种修饰的RNA结合蛋白的串联富集和鉴定方法，包括如下步骤：
1)在含有EU试剂的培养基中孵育培养细胞，外源性EU被细胞摄取利用，参与细胞RNA的合成，使RNA携带炔基基团；
2)步骤1)处理后细胞于紫外光条件下照射，使得相互作用的RNA和蛋白质紫外光照交联形成共价交联复合物；
3)裂解细胞，在细胞裂解物中加入叠氮-生物素试剂，利用炔基与叠氮的点击化学反应实现RNA-蛋白复合物的生物素化；
4)将步骤3)所得RNA-蛋白质复合物与链霉亲和素磁珠孵育，清洗去除非特异性吸附的蛋白与其他分子，实现RNA-蛋白质复合物的特异性富集；
5)加入RNaseA剪切RNA将RNA结合蛋白从磁珠上释放，并利用胰蛋白酶剪切RNA结合蛋白为肽段；
6)利用亲水相互作用色谱(HILIC)与亲水性成分(肽段中的O-GlcNAc糖基化和磷酸化修饰基团)的相互作用，实现对具有O-GlcNAc糖基化和磷酸化的RNA结合蛋白的特异性富集；
7)采用蛋白质组质谱分析在细胞水平实现O-GlcNAc和磷酸化RNA结合蛋白质的全面解析。
上述方法步骤1)中，EU试剂的工作浓度可为0.1-2mM，具体可为0.5mM；
所述孵育的时间可为3-12小时，具体可为9小时；
步骤2)中，所述紫外光的波长可为254nm；
所用254nm波长紫外光照能量可为0.1-1J/cm2，具体可为0.25J/cm2；
步骤3)中，裂解细胞后，依次在细胞裂解物中加入0.5mM预先按1:1(摩尔比)混合的CuSO4与配体(THPTA)混合液、0.1mM叠氮-生物素试剂、5mM L-抗坏血酸钠，室温避光1小时进行点击化学反应；
其中为了避免被氧化，抗坏血酸钠需要现配现用。
步骤4)中，RNA-蛋白质复合物与链霉亲和素磁珠的孵育时间为0.5-1h，具体可为1h；
RNA-蛋白质复合物与链霉亲和素磁珠孵育完成后，通过磁性分离收集磁珠并弃去上清液，磁珠依次用200μL 0.2％(w/v)SDS的PBS溶液、200μL 6M尿素的PBS溶液、200μLPBS溶液分别清洗两次，去除非特异性吸附蛋白和其他分子；
上述方法步骤5)的操作为：清洗后通过磁分离弃去上清液，将富集有RNA-蛋白质复合物的磁珠在RNaseA中于37℃孵育1小时释放磁珠上的RNA结合蛋白；释放的RNA结合蛋白依次利用10mM二硫苏糖醇(DTT)在56℃孵育1小时，用20mM碘乙酰胺(IAA)室温避光孵育1小时进行还原烷基化；接着利用胰蛋白酶将变性后的蛋白在37℃孵育过夜，得到酶切后的RBP肽段；
步骤6)的操作为：将酶切后的RBP肽段加入到亲水相互作用色谱填料中孵育，用清洗试剂清洗色谱填料，然后用洗脱试剂洗脱，收集目标肽段，即可；
其中，所述清洗试剂为含1％(体积浓度)TFA和80％(体积浓度)乙腈(ACN)的水溶液；
所述洗脱试剂为含0.5％(体积浓度)甲酸(FA)的水溶液；
以上所用试剂都应采用RNase-free的溶液进行配置，所用离心管均采用RNase-free规格。
本发明提供的方法流程(见图1)和原理如下：
培养皿中的细胞清洗后在含有EU试剂的培养基中孵育培养，外源性EU被细胞摄取利用，参与细胞RNA的合成，使RNA携带炔基基团。细胞于254nm波长紫外光条件下照射，可使得相互作用的RNA和蛋白质形成共价交联复合物。细胞裂解后，交联的RNA-蛋白质复合物仍能保持其天然组成不变。在细胞裂解液中加入叠氮-生物素试剂，利用炔基与叠氮的点击化学反应实现RNA-蛋白复合物的生物素化。将所得复合物与链霉亲和素修饰磁珠孵育，再清洗去除非特异性吸附的蛋白与其他分子，实现RNA-蛋白质复合物的特异性富集。接着加入RNase A剪切RNA将RNA结合蛋白从磁珠上释放，并利用胰蛋白酶剪切RNA结合蛋白为肽段。由于O-GlcNAc糖基化和磷酸化具有一定的亲水性，利用HILIC与亲水性成分的相互作用，即可实现对具有O-GlcNAc糖基化和磷酸化的RNA结合蛋白的特异性富集。后续结合蛋白质组质谱分析，可以在细胞水平实现O-GlcNAc和磷酸化RNA结合蛋白质的全面解析。
为获得更为准确可靠的RNA结合蛋白鉴定结果，我们设置了三种不同的对照条件(见图2)，它们分别是：对照组1，不采用EU试剂，即用相同体积的溶剂(DMSO)替代EU；对照组2，不采用紫外光照交联RNA与蛋白质；对照组3，在清洗链霉亲和素磁珠非特异性吸附步骤中加入RNase A，从而水解RNA并将RNA结合蛋白从磁珠上去除。对照组1由于缺乏EU试剂标记，后续无法通过点击化学反应获得RNA-蛋白质复合物；对照组2由于缺乏紫外光照使RNA与蛋白质共价交联，且RNA结合蛋白易在严格的清洗步骤中丢失，也无法获得RNA-蛋白质复合物；对照组3由于在清洗步骤中已去除RNA结合蛋白，后续洗脱中所得产物中将只包含与磁珠非特异性吸附的非RNA结合蛋白。除此之外，对照组与实验组采用完全相同的实验条件。在此基础上将实验组与对照组样品使用胰蛋白酶酶解为肽段后分别进行质谱分析，从而可以通过实验组和对照组中鉴定蛋白质种类和含量的差异获得更为准确的RNA结合蛋白鉴定结果(对照组中未鉴定到或含量明显低于实验组的蛋白质则可认为是高可信的RNA结合蛋白)。
本发明提供了一种基于EU代谢标记及HILIC富集的O-GlcNAC和磷酸化RNA结合蛋白的串联富集鉴定新方法。利用代谢标记EU使RNA具有炔基，再用炔基与叠氮的点击化学反应在RNA-蛋白质复合物上引入生物素，可以特异性地与商业化的链霉亲和素磁珠结合；接着串联HILIC富集，利用其与亲水性组分的相互作用实现O-GlcNAc与磷酸化RNA结合蛋白的特异性富集。
与现有的富集方法相比，本发明的方法具有三大优势：
(1)相较于经典的利用mRNA的poly(A)序列的富集方法，本方法基于EU代谢标记的策略能够无偏性的对各种类型的RNA进行标记，获得更全面的RNA结合蛋白，特别是对与非编码RNA相互作用的蛋白质的富集鉴定。
(2)相较于通过合成多功能化合物的化学标记方法，本方法均采用商业化试剂，不依赖于复杂合成步骤，极大提高了方法的广谱性和可及性。
(3)该策略可应用于具有O-GlcNAc和磷酸化双修饰的RNA结合蛋白的富集分析，这是现有富集鉴定方法难以实现的。
附图说明
图1为本发明O-GlcNAc与磷酸化RNA结合蛋白富集方法的实验流程图。
图2为本发明方法对HeLa细胞中RNA结合蛋白进行富集和质谱鉴定的实验流程图。
图3为本发明方法对HeLa细胞中RNA结合蛋白富集产物的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图。
图4为本发明方法优化HILIC富集方法的效果对比图。
图5A为本发明方法鉴定的HeLa细胞中RNA结合蛋白GO Molecular Function和Biological process分析，分别得到的最富集的6个条目。图5B为本发明方法鉴定的HeLa细胞中同时具有O-GlcNAc和磷酸化双修饰的RNA结合蛋白GO Molecular Function和Biological process分析，分别得到的最富集的8个条目。
图6为本发明方法所鉴定的O-GlcNAc RNA结合蛋白和磷酸化RNA结合蛋白与其他文献报道的相应修饰的RNA结合蛋白数据库的重叠维恩图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、基于EU代谢标记富集细胞中RNA结合蛋白的效果评价
实验组：培养在15cm内径培养皿中的HeLa细胞生长密度约为80％时，去除培养基，用5mL PBS清洗细胞三次，并吸干培养皿中残余溶液。加入12mL含0.5mM EU试剂(J&KScientific Co.Ltd.)的培养基，在培养箱中孵育9小时进行代谢标记。孵育完成后，去除培养基并用5mL PBS清洗细胞三次，吸干培养皿中残余溶液，将培养皿置于冰上进行紫外光照交联。紫外光波长为254nm，能量为0.25J/cm2。交联完毕后，加入预冷的PBS溶液1mL，采用细胞刮收集交联后的细胞，并用少量PBS润洗培养皿与刮刀，将细胞收集在2mL RNase-free离心管中，在4℃下采用1,000g离心3min，弃去上清液。接着依次用两种细胞裂解液充分裂解细胞，首先在离心管中加入250μL细胞裂解液I[0.5％(w/v)SDS，PBS，pH 7.4，蛋白酶抑制剂(Mannheim)，RNA酶抑制剂(New England Biolabs)]，将离心管置于冰上，用带有细针头(～0.7mm)的注射器充分吹打混匀，静置裂解20min。接着加入1mL细胞裂解液II(0.1％Triton-100，PBS，蛋白酶抑制剂，RNA酶抑制剂)，将离心管置于冰上，用带有细针头(～0.7mm)的注射器充分吹打混匀，静置裂解20min。将裂解后的细胞在4℃下采用16,000g离心15min，上清液转移至新1.5mL RNase-free离心管中以备后续点击化学反应。预先将400mM CuSO4溶液(Sigma-Aldrich)与400mM THPTA试剂(Sigma-Aldrich)1:1(v/v)混合，得到200mM CuSO4-THPTA混合液。在1.2mL细胞裂解产物中加入CuSO4-THPTA混合液至Cu2+终浓度0.5mM，加入叠氮-生物素(DMSO配置，Sigma-Aldrich)至终浓度0.1mM，加入L-抗坏血酸钠(现用现配，Sigma-Aldrich)至终浓度5mM，在室温振荡条件下进行点击化学反应1小时。然后采用Amicon Ultra-15超滤离心管(截留分子量10kDa，Millipore)去除多余反应试剂，并用200μLPBS清洗三次，将反应液浓缩至200μL。加入50μL链霉亲和素固载磁珠(Thermo)于室温振荡孵育1小时。通过磁性分离弃去上清液，磁珠依次分别用200μL 0.2％(w/v)SDS的PBS溶液、200μL 6M尿素的PBS溶液、200μL PBS溶液各清洗两次。通过磁分离弃去上清液，加入含有25μL 0.01μg/μLRNaseA的PBS溶液，于37℃孵育1h，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。所用试剂都应采用RNase-free溶液进行配置，所用离心管均采用RNase-free规格。
对照组：对照组1为用相同体积的溶剂(DMSO)替代EU孵育9小时；对照组2为不采用紫外光照交联RNA与蛋白质；对照组3为在清洗链霉亲和素磁珠非特异性吸附步骤中加入25μL 0.01μg/μL RNase A的PBS溶液，于37℃孵育1h，从而水解RNA并将RNA结合蛋白从磁珠上去除。其他实验条件及试剂均与实验组相同。
如图3所示，与实验组相比，未加入EU试剂的对照组几乎没有蛋白条带，证明EU试剂在RNA结合蛋白的富集中起到关键作用。没有254nm紫外光照的对照组蛋白条带也相对较少，是因为没有254nm紫外交联RNA-蛋白质无法形成稳定的复合物，而仅仅依靠二者的生理性弱相互作用无法承受细胞裂解、磁珠富集和反复清洗的扰动，造成复合物中的蛋白质丢失。与实验组相比，清洗步骤中加入RNaseA处理、并弃去清洗液的对照组蛋白条带明显减少。这是由于磁珠捕获的RNA-蛋白质复合物在RNaseA处理下RNA发生水解，蛋白质脱落，大部分蛋白质在清洗中被去除，仅有少量非特异性吸附蛋白残留在磁珠上。以上实验证明了基于EU代谢标记的方法对于RNA结合蛋白具有很好的富集选择性。
实施例2、优化后的亲水相互作用色谱法对O-GlcNAc糖基化与磷酸化富集效果评价
亲水相互作用色谱(HILIC)利用其材料与亲水性组分形成氢键、离子相互作用和偶极相互作用使亲水性组分保留在HILIC材料表面，清洗非特异性吸附后再利用极性较强的洗脱试剂回收亲水性组分，从而能富集具有较强亲水性的磷酸肽和O-GlcNAc糖肽。但是会引入亲水性较强的非修饰肽段，离子对试剂TFA能与肽段中带正电的官能团形成中性离子对，增加其疏水性，从而减少在HILIC材料上的保留，增加HILIC对目标肽段的富集选择性。因此，采用在清洗试剂中加入TFA试剂优化HILIC富集选择性。考虑到O-GlcNAc主要分布于细胞核、细胞质和线粒体中，采用核质蛋白对优化后的HILIC对O-GlcNAc糖基化与磷酸化富集效果进行评价。
配制三种不同的清洗试剂，分别为试剂1(含5％FA和80％ACN的水溶液，均为体积浓度，下同)、试剂2(含0.1％TFA和80％ACN的水溶液)，以及试剂3(含1％TFA和80％ACN的水溶液)。每组实验均为平行操作，最终采用相同的洗脱试剂(含0.5％FA的水溶液)收集目标肽段。采用核质蛋白提取试剂盒(Thermo)提取HeLa细胞的核蛋白和质蛋白，将二者合并，核质合蛋白依次利用10mM DTT在56℃孵育1小时，用20mM IAA室温避光孵育1小时进行还原烷基化。接着利用胰蛋白酶将变性后的核质蛋白在37℃孵育过夜，得到酶切后的肽段，室温浓缩干燥。将5mg ZIC-HILIC填料(Merck)分别与200μL三种清洗试剂混合，并加入至干燥的肽段中，室温振荡孵育1小时，使肽段与HILIC填料充分混合。取200μL枪头，在枪头前端垫入2层C8膜作为筛板，制作成简易富集装置。将肽段和HILIC填料的悬浮混合液吸入富集装置中，用注射器将悬浮液体推下，HILIC填料颗粒会被C8筛板截留在枪头内；再分别用100μL清洗试剂清洗填料3次；最后用100μL洗脱试剂(含0.5％FA的水溶液)将目标肽段从HILIC填料中洗脱下来，重复此步骤3次，收集洗脱液，室温浓缩干燥，使用0.1％FA溶液重溶，进行蛋白组学质谱分析。
质谱分析流程：使用纳升液相色谱(EASY-nLC 1000，Thermo)联合高分辨质谱(Orbitrap Fusion Tribrid，Thermo)分析。使用C18反相色谱柱(填料直径1.9μm，色谱柱内径150μm)，以600nL/min的流速来实现样品的分离。以正离子模式采集，一级质谱分析的扫描范围为300-1400m/z，分辨率为120,000。二级质谱分析选择数据依赖性扫描模式(DDA)，动态排除时间为18秒。自动增益控制值为5.0e3，最大离子注入时间为35ms，高能碰撞解离碎裂模式(HCD)的能量设置为32％。
数据分析流程：质谱原始数据使用MaxQuant软件进行解析。具体参数设置如下，蛋白酶切模式设置为“胰蛋白/P”，并允许每个肽段中最多含有2个漏切位点。固定修饰设置为脲甲基修饰半胱氨酸(carbamidomethyl cycteine，即被碘乙酰胺封闭的半胱氨酸)。可变修饰设置为甲硫氨酸上的氧化、蛋白N端乙酰化、苏氨酸和丝氨酸的磷酸化和苏氨酸和丝氨酸的O-GlcNAc糖基化。谱图、蛋白和修饰水平的假发现率(FDR)均小于0.01。对于磷酸化和O-GlcNAc的确证，只有位点可能性(Localization probability)大于等于0.75才认为是磷酸化肽段及O-GlcNAc肽段。
如图4所示，在三种不同的清洗试剂条件下，含1％TFA的实验组得到的O-GlcNAc肽段和磷酸化肽段均最多，至少是其它两组结果的2.7倍。由于试剂1中不含有TFA，不具有离子对效应，得到的目标肽段最少。而试剂2由于TFA浓度不足，富集选择性没有明显提高。根据以上实验结果，证明含有1％TFA和80％ACN的水溶液作为清洗试剂能显著提高HILIC富集效果，此条件将用于富集O-GlcNAc和磷酸化RNA-结合蛋白。
实施例3、串联富集细胞中O-GlcNAc和磷酸化RNA结合蛋白的质谱分析
经过代谢标记、点击化学及RNaseA酶切释放的RNA结合蛋白依次利用10mM DTT在56℃孵育1小时，20mM IAA室温避光孵育1小时进行还原烷基化。接着利用胰蛋白酶按照蛋白：酶为50:1(w/w)的比例将变性后的蛋白在37℃孵育过夜，得到酶切后的肽段，室温浓缩干燥。使用0.1％FA溶液重溶实验组与对照组肽段，进行蛋白组学质谱分析，采用非标记定量模式对蛋白质进行定量分析。将5mg ZIC-HILIC填料与200μL含有1％TFA和80％ACN的水溶液混合，并加入干燥的肽段中，室温振荡孵育1小时，使肽段与HILIC填料充分混合。取200μL枪头，在枪头前端垫入2层C8膜作为筛板，制作成简易富集装置。将肽段和HILIC填料的悬浮混合液吸入富集装置中，用注射器将悬浮液体推下，HILIC填料颗粒会被C8筛板截留在枪头内；再分别用100μL清洗试剂清洗填料3次；最后用100μL洗脱试剂(含0.5％FA的水溶液)将目标肽段从HILIC填料中洗脱下来，重复此步骤3次，收集洗脱液，室温浓缩干燥，使用0.1％FA溶液重溶，进行蛋白组学质谱分析。
质谱分析流程：使用纳升液相色谱(EASY-nLC 1000，Thermo)联合高分辨质谱(Orbitrap Fusion Tribrid，Thermo)分析。使用C18反相色谱柱(填料直径1.9μm，色谱柱内径150μm)，以600nL/min的流速来实现样品的分离。液相色谱的A液为0.1％(体积浓度，下同)FA水溶液，B液为0.1％FA乙腈溶液。色谱梯度设置为：6％-9％B液2分钟，9％-13％B液8分钟，13％-26％B液40分钟，26％-38％B液20分钟，38％-100％B液1分钟，100％B液7分钟。质谱以正离子模式采集，一级质谱分析的扫描范围为300-1400m/z，分辨率为120,000。二级质谱分析选择数据依赖性扫描模式(DDA)，动态排除时间为18秒。自动增益控制值为5.0e3，最大离子注入时间为35ms，高能碰撞解离碎裂模式(HCD)的能量设置为32％。
数据分析流程：质谱原始数据使用MaxQuant软件进行解析。具体参数设置如下，蛋白酶切模式设置为“胰蛋白/P”，并允许每个肽段中最多含有2个漏切位点。对于RNA结合蛋白的鉴定，固定修饰设置为脲甲基修饰半胱氨酸(carbamidomethyl cycteine，即被碘乙酰胺封闭的半胱氨酸)；可变修饰设置为甲硫氨酸上的氧化、蛋白N端乙酰化。对于O-GlcNAc和磷酸化RNA结合蛋白的鉴定，还需要在可变修饰中加入苏氨酸和丝氨酸的磷酸化和苏氨酸和丝氨酸的O-GlcNAc糖基化。谱图、蛋白和修饰水平的假发现率(FDR)均小于0.01。对于磷酸化和O-GlcNAc的确证，只有位点可能性(Localization probability)大于等于0.75才认为是磷酸化肽段及O-GlcNAc肽段。对于蛋白质鉴定，每个蛋白质需要鉴定到至少两条独有的肽段才认为是可靠的鉴定结果。将实验组和对照组鉴定到的蛋白进行定量比较差异分析。差异分析使用的软件是Perseus，通过计算蛋白质在实验组与对照组中的定量差异比例以及P值实现差异蛋白质筛选。将P值小于0.01、且差异比例大于等于4的蛋白质认为是高置信的RNA结合蛋白。
如图5A所示，本发明提供的方法鉴定出1115个高置信的RNA结合蛋白。对这些蛋白进行GO功能分析，结果表明最富集的条目中绝大部分都是与RNA相关，进一步证明了该方法的可靠性和选择性。
如图5B所示，通过串联优化后的HILIC富集，发现其中300个O-GlcNAc RNA结合蛋白，389个磷酸化RNA结合蛋白，其中213个RNA结合蛋白同时具有这两种修饰。对这213个双修饰RBP进行GO分析发现它们主要与RNA出核过程有关。
如图6所示，对本发明方法所鉴定的O-GlcNAc RNA结合蛋白和磷酸化RNA结合蛋白与其他文献([1]Huang R,Han M,Meng L,et al.Transcriptome-wide discovery ofcoding and noncoding RNA-binding proteins[J].Proceedings ofthe NationalAcademy of Sciences,2018,115(17):E3879-E3887.[2]Bao X,Guo X,Yin M,etal.Capturing the interactome of newly transcribed RNA[J].Nature methods,2018,15(3):213-220.[3]Queiroz R M L,Smith T,Villanueva E,et al.Comprehensiveidentification of RNA–protein interactions in any organism using orthogonalorganic phase separation(OOPS)[J].Nature biotechnology,2019,37(2):169-178.[4]Trendel J,Schwarzl T,Horos R,et al.The human RNA-binding proteome and itsdynamics during translational arrest[J].Cell,2019,176(1-2):391-403.E19.[5]Urdaneta E C,Vieira-Vieira C H,Hick T,et al.Purification ofcross-linked RNA-protein complexes by phenol-toluol extraction[J].Nature communications,2019,10(1):1-17.以及Uniprot已报道的O-GlcNAc肽段和磷酸化肽段(www.uniprot.org)报道的相应修饰的RNA结合蛋白数据库进行对比，49.67％的O-GlcNAc RBP和80.72％的磷酸化RBP之前已经被报道过，进一步证明了该方法的可靠性。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。
Claims (8)
1.一种对同时具有O-GlcNAc和磷酸化两种修饰的RNA结合蛋白的串联富集和鉴定方法，包括如下步骤：
1)在含有EU试剂的培养基中孵育培养细胞，外源性EU被细胞摄取利用，参与细胞RNA的合成，使RNA携带炔基基团；
2)步骤1)处理后细胞于紫外光条件下照射，使得相互作用的RNA和蛋白质紫外光照交联形成共价交联复合物；
3)裂解细胞，在细胞裂解物中加入叠氮-生物素试剂，利用炔基与叠氮的点击化学反应实现RNA-蛋白复合物的生物素化；
4)将步骤3)所得RNA-蛋白质复合物与链霉亲和素磁珠孵育，清洗去除非特异性吸附的蛋白与其他分子，实现RNA-蛋白质复合物的特异性富集；
5)加入RNaseA剪切RNA将RNA结合蛋白从磁珠上释放，并利用胰蛋白酶剪切RNA结合蛋白为肽段；
6)利用亲水相互作用色谱(HILIC)与亲水性成分(肽段中的O-GlcNAc糖基化和磷酸化修饰基团)的相互作用，实现对具有O-GlcNAc糖基化和磷酸化的RNA结合蛋白的特异性富集；
7)采用蛋白质组质谱分析在细胞水平实现O-GlcNAc和磷酸化RNA结合蛋白质的全面解析。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1)中，EU试剂的工作浓度为0.1-2mM；
所述孵育的时间为3-12小时。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤2)中，紫外光照交联能量为0.1-1J/cm2。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于：步骤3)中，裂解细胞后，依次在细胞裂解物中加入0.5mM预先按1:1(摩尔比)混合的CuSO4与配体(THPTA)混合液、0.1mM叠氮-生物素试剂、5mM L-抗坏血酸钠，室温避光1小时进行点击化学反应。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于：步骤4)中，RNA-蛋白质复合物与链霉亲和素磁珠的孵育时间为0.5-1h；
RNA-蛋白质复合物与链霉亲和素磁珠孵育完成后，通过磁性分离收集磁珠并弃去上清液，磁珠依次用200μL 0.2％(w/v)SDS的PBS溶液、200μL 6M尿素的PBS溶液、200μLPBS溶液分别清洗两次去除非特异性吸附蛋白和其他分子。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于：步骤5)的操作为：清洗后通过磁分离弃去上清液，将富集RNA-蛋白质复合物的磁珠在RNase A中孵育释放磁珠上的RNA结合蛋白；释放的RNA结合蛋白依次利用二硫苏糖醇孵育，用碘乙酰胺室温避光孵育进行还原烷基化；接着利用胰蛋白酶将变性后的蛋白孵育过夜，得到酶切后的RBP肽段。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于：步骤6)的操作为：将酶切后的RBP肽段加入到亲水相互作用色谱填料中孵育，用清洗试剂清洗色谱填料，然后用洗脱试剂洗脱，收集目标肽段，即可。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述清洗试剂为含1％TFA和80％乙腈的水溶液；
所述洗脱试剂为含0.5％甲酸(FA)的水溶液。
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