CN117624304A - 具有广谱抗菌活性的抗菌糖脂肽glip的制备及应用 - Google Patents

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CN117624304A CN202311634904.5A CN202311634904A CN117624304A CN 117624304 A CN117624304 A CN 117624304A CN 202311634904 A CN202311634904 A CN 202311634904A CN 117624304 A CN117624304 A CN 117624304A
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魏光成
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Abstract

本发明涉及一种具有良好生物相容性、稳定性及优异抗菌活性的抗菌糖脂肽GLIP的制备及其在治疗细菌感染中的应用，属于医药领域。所述抗菌糖脂肽的氨基酸序列为C12H20N2O‑Trp‑Lys‑Lys‑Leu‑Leu‑Lys‑Trp‑Trp‑Leu‑Lys‑Lys‑Phe‑Lys‑Lys‑Leu‑Asp‑C6H12NO5(简写为C12H20N2O‑WKKLLKWWLKKFKKLD‑C6H12NO5)，其是基于抗菌肽的几种重要生物学特征(净正电荷、两亲性和α‑螺旋结构)设计的，并分别在其N端和C端偶联了离子液C12H21N2O2和单糖C6H13NO5。本发明提供了糖脂肽固相合成的技术方案。本抗菌糖脂肽具有优异的体外抗菌活性，良好的血清及胰酶稳定性和良好的生物相容性。体内抗菌实验表明，所设计抗菌糖脂肽糖脂肽可以在小鼠感染模型中发挥优异抗菌作用，是一种具有良好应用前景的潜在抗生素替代品。

Description

具有广谱抗菌活性的抗菌糖脂肽GLIP的制备及应用
技术领域
本发明属于医药领域，具体涉及一种具有优异的体外抗菌活性，良好的血清及胰酶稳定性的两亲性阳离子抗菌糖脂肽GLIP的制备及其在治疗细菌感染中的应用。
背景技术
传统抗生素以其强大的抗菌活性在全球范围内有效治疗传染病。然而在过去的几十年里，由于抗生素的过度使用，导致耐药细菌的不断涌现，这对传统的抗生素治疗构成了巨大挑战。因此，迫切需要开发新的抗菌剂来对抗耐药病原微生物。抗菌肽是许多生物体产生的机体免疫防御系统的关键组成部分。大多数抗菌肽是阳离子抗菌肽，这些肽分子通过携带的正电荷与带负电荷的细菌膜结合，然后抗菌肽的两亲性二级结构通过形成瞬时跨膜孔洞或将细菌细胞膜破坏为肽包被的囊泡，导致膜结构的破坏，进而导致菌体死亡。抗菌肽因其非特异性膜靶向性往往具有强大、广谱、高度易感的抗菌活性，与传统抗生素相比在延缓或抑制细菌耐药性发展方面的优势使其成为有希望的候选者。
抗菌肽的生物活性和特异性受到多种因素的影响，比如净电荷、疏水性、两亲性、α-螺旋二级结构等。大多数抗菌肽都带有净正电荷，净电荷数目从+2至+9不等，而抗菌肽抗菌活性与所含正电荷的数目密切相关，研究发现增加正电荷的数目可以提高抗菌肽的抗菌活性，但是过高的正电荷数使抗菌肽分子之间的静电斥力增大，超过了抗菌肽与细菌细胞膜的静电引力，从而不利于抗菌肽和细菌细胞膜的结合，使抗菌肽的抗菌活性降低。疏水性对抗菌肽与细菌脂膜的相互作用至关重要，它控制了抗菌肽分配到细菌膜脂质层的程度。与净电荷类似，研究表明，适当增加疏水性可以显著提高抗菌肽的抗菌活性,且对溶血活性没有显著影响。疏水性太低会使抗菌肽与细菌细胞膜的亲和力过低，无法与之结合，疏水性过高易使抗菌肽自身聚集，导致抗菌肽分子的溶解性降低并导致其溶血活性增加。α-螺旋结构是其形成两亲性结构的基础。两亲性是指肽内亲水性和疏水性区域的相对比例和地形位置，是抗菌肽与病原微生物细胞膜结合产生杀菌作用的结构基础，有助于抗菌肽分子与膜双分子层结合并形成孔洞。
离子液因其作为“绿色溶剂”的潜在作用而引起广泛关注。最近，人们发现离子液在抗菌活性方面有广阔的应用前景。与阳离子抗菌剂类似，阳离子离子液具有亲脂性烷基链部分和带正电阳离子基团部分，阳离子基团附着在带负电的细菌膜表面，然后烷基链插入脂质双分子层，破坏膜结构以增加渗透性或导致胞内内容物泄漏。
脂肽是由抗菌肽N末端与脂肪酸偶联形成，抗菌肽的N端酰化赋予抗菌肽额外的疏水性，可以显著提高其破膜能力，并可以减少蛋白酶的降解，增强抗菌肽的酶稳定性，延长抗菌肽在体内的血浆半衰期，提高生物利用度。而糖基化是蛋白质一种常见的翻译后修饰，对其结构和功能有着决定性的影响。抗菌肽的糖基化修饰可能会对其稳定性、抗菌活性、病原体特异性、组织或细胞靶向以及免疫调节等产生影响。此外，糖基化修饰通过掩盖肽中的蛋白酶降解位点或改变其构象，使肽更紧密或对蛋白酶有保护作用，也可以使肽折叠成最佳结构，而不会影响其抗菌性能。
因此，本发明基于脂化和糖基化修饰对抗菌肽生物活性的重要影响，设计并合成了一种具有优异抗菌活性的的新型阳离子两亲性抗菌糖脂肽GLIP。其中，带正电荷的亲水性氨基酸Lys(K)为抗菌肽提供正电荷，使其与带负电荷的细菌膜产生静电吸引；将疏水性氨基酸Leu(L)、Phe(F)和Trp(W)引入以提高疏水性，增强抗菌肽对细菌膜的破坏能力；离子液和单糖分子的偶联将进一步提高所得抗菌糖脂肽的抗菌活性。本发明抗菌糖脂肽将为细菌感染的治疗提供新的可行方案，具有极好的应用价值。
发明内容
本发明的目的之一在于根据多肽固相合成技术制备具有良好抗菌活性及稳定性的两亲性抗菌糖脂肽GLIP，本发明的第二个目的在于将所制备的抗菌糖脂肽分子应用于细菌感染的治疗。
为实现本发明的目的，本发明提供了如下技术方案：
本发明两亲性阳离子抗菌糖脂肽GLIP的氨基酸序列为C12H20N2O-Trp-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Trp-Trp-Leu-Lys-Lys-Phe-Lys-Lys-Leu-Asp-C6H12NO5(简写为C12H20N2O-WKKLLKWWLKKFKKLD-C6H12NO5)，其中Trp(W)为色氨酸，Lys(K)为赖氨酸，Leu(L)为亮氨酸，Phe(F)为苯丙氨酸，Asp(D)为天冬氨酸，其N端所连接修饰为C12H21N2O2，C端连接单糖分子为C6H13NO5。其设计方法如下：基于抗菌肽的几种重要生物学特征(净正电荷、两亲性和α-螺旋结构)，将带正电荷的亲水性氨基酸Lys(K)和疏水性氨基酸Leu(L)、Phe(F)和Trp(W)引入所设计的氨基酸序列，并分别再其N端和C端偶联了离子液C12H21N2O2和单糖分子C6H13NO5得到抗菌糖脂肽。根据所设计的肽序列，通过多肽固相合成法由C端至N端依次偶联氨基酸并脱除N末端氨基酸的Fmoc保护基得到多肽树脂，在多肽树脂的N端偶联合成的离子液C12H21N2O2并脱除树脂，然后在抗菌脂肽的C端偶联单糖分子C6H13NO5，最后将所得抗菌糖脂肽的的所有侧链保护基脱除。所述抗菌糖脂肽结构式如下：
通过圆二色光谱测定所得抗菌糖脂肽GLIP的二级结构；采用微量肉汤稀释法对制备得到的抗菌糖脂肽GLIP进行体外抗菌活性检测；对制备得到的抗菌糖脂肽GLIP进行血清稳定性、胰酶稳定性及生物相容性研究；研究所述抗菌糖脂肽GLIP的抗菌机理；最后，评价抗菌糖脂肽GLIP的体内抗菌活性。
附图说明
图1：抗菌糖脂肽GLIP在纯水和SDS溶液中的CD谱。
图2：抗菌糖脂肽GLIP的杀菌动力学。
图3：抗菌糖脂肽GLIP的胰酶稳定性测定。
图4：抗菌糖脂肽GLIP的生物相容性。(a)不同浓度糖脂肽GLIP处理RAW264.7细胞24h时的相对细胞存活率；(b)糖脂肽GLIP对小鼠红细胞的溶血性；(c)NS处理的小鼠红细胞形态(400×)；(d)糖脂肽GLIP(6mg/kg)处理后的小鼠细胞形态(400×)。
图5：生物膜清除和膜破坏机制研究。ONPG摄取实验评估对S.aureusATCC 29213(a)和E.coli ATCC 25922(b)的内膜渗透性；(c)不同浓度糖脂肽GLIP对S.aureusATCC29213和E.coli ATCC 25922的生物膜清除效果；(d)NPN摄取实验评估糖脂肽GLIP对E.coliATCC 25922的外膜渗透性。
图6：4×MIC糖脂肽GLIP分别处理E.coliATCC 259220h(a)、2h(b)、4h(c)、6h(d)、10h(e)的FCM分析。
图7：4×MIC脂肽-荧光素分别处理E.coliATCC 259220h、4h、8h、12h的CLSM分析。
图8：不同条件处理E.coli ATCC 259222h后细菌形态变化的TEM图。(a)PBS处理的对照组E.coliATCC 25922；(b)4×MIC糖脂肽GLIP处理的E.coli ATCC 25922。
图9：体内抗菌活性测定。(a)使用NS和糖脂肽GLIP(6mg/kg)处理的小鼠急性腹膜炎模型的存活率；(b)使用NS和糖脂肽GLIP(6mg/kg)处理小鼠急性腹膜炎不同时间后，小鼠腹腔液菌落计数；(c)感染S.aureusATCC 29213致小鼠角膜炎后，用NS和GLIP处理不同时间的小鼠眼睛恢复情况；(d)NS和GLIP处理的小鼠金黄色葡萄球菌感染伤口的照片；(e)不同条件处理10天的小鼠金黄色葡萄球菌感染伤口H&E染色的组织学分析。蓝色箭头：淋巴细胞；红色箭头：红细胞；灰色箭头：成纤维细胞。
具体实施方式
以下给出本发明的具体实施方式，用来对本发明的构成作进一步的说明，但并不认为本发明仅局限于下述的实施方式。
实施例1：本发明抗菌糖脂肽GLIP的合成
(1)Fmoc-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Leu-Leu-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Phe-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Leu-Asp(OtBu)-2-ChlorotrityResin的合成：以Fmoc-Asp(OtBu)-2-Chlorotrity Resin为载体，通过固相合成法合成：首先，称取Fmoc-Asp(OtBu)-2-Chlorotrity Resin(负载量0.386mmol/g)，加入DMF溶胀30min。溶胀完成后加入含有20％哌啶的DMF溶液搅拌30min，依次用DMF、DCM、DMF各冲洗抽滤4次，以脱除Fmoc保护基团。加入无水DMF重新溶胀上述Asp(OtBu)-2-ChlorotrityResin，然后加入2倍摩尔量的Fmoc-Leu-OH，并以2.6倍摩尔量的DCC、HOBT、DIEA为缩合剂，搅拌反应48h。反应完成后依次用DMF、DCM、DMF、无水乙醇各冲洗抽滤4次，随后将多肽树脂转移至透析袋(MW 8000-14000)内，用乙醇透析20次，每次30min。冷冻干燥得到Fmoc-Leu-Asp(OtBu)-2-Chlorotrity Resin。通过重复上述步骤由C端至N端依次偶联余下的Fmoc氨基酸得到Fmoc-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Leu-Leu-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Phe-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Leu-Asp(OtBu)-2-ChlorotrityResin。
(2)离子液C12H21N2O2的制备：称取8-溴辛酸溶于24mL无水THF和6mL无水乙醇的混合溶液，然后在搅拌下加入10倍摩尔量的N-甲基咪唑，密封，60℃反应32-48h。反应完成后，40℃减压旋蒸除去挥发性成分，待旋蒸至溶液体积不变(油状物)，加入6倍量的冰乙醚沉淀粗产物。最后再用冰乙醚离心洗涤沉淀四次，冷冻干燥得到目标产物。
(3)抗菌脂肽C12H20N2O-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Leu-Leu-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Phe-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Leu-Asp(OtBu)-COOH的合成：首先，脱除(1)中多肽树脂的Fmoc保护基团并进行冷冻干燥。称取1.5倍摩尔量上述(2)中离子液C12H21N2O2和2.5倍摩尔量的NHS、EDC置于无水DMF中搅拌5-6h以活化离子液的羧基，将冷冻干燥好的树脂加入搅拌反应48h。反应完成后依次用DMF、DCM、DMF各冲洗抽滤3次，装入透析袋(MW:8000-14000)用乙醇透析20次。透析完成后加入裂解液(DCM：TFA＝99：1，V/V)搅拌反应1.5h以脱除树脂，减压抽滤收集肽溶液。用饱和NaHCO3萃取肽溶液中和TFA后收集DCM相，随后用纯水多次萃取DCM相，最后收集DCM溶液减压蒸发浓缩，经冷冻干燥后得到C12H21N2O-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Leu-Leu-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Phe-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Leu-Asp(OtBu)-COOH。
(4)抗菌糖脂肽GLIP(C12H20N2O-Trp-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Trp-Trp-Leu-Lys-Lys-Phe-Lys-Lys-Leu-Asp-C6H12NO5)的制备：将上述(3)中脂肽与3倍摩尔量的NHS和EDC溶于无水DMF搅拌反应5-6h，以活化肽链羧基。然后加入3倍摩尔量的C6H13NO5·HCl同时迅速地加入3倍摩尔量的三乙胺，搅拌反应48h。反应完成后装入透析袋中(MW 1500)用纯水透析数次，冷冻干燥得到C12H21N2O-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Leu-Leu-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Phe-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Leu-Asp(OtBu)-C6H11NO5。最后用切割液(TFA:H2O:Tis＝95:2.5:2.5，V/V)搅拌反应1.5h以脱除侧链保护基，取滤液减压蒸发浓缩，加入冰乙醚沉淀，再用冰乙醚离心洗涤3-4次，冷冻干燥得到糖脂肽C12H20N2O-Trp-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Trp-Trp-Leu-Lys-Lys-Phe-Lys-Lys-Leu-Asp-C6H12NO5。
实施例2：抗菌糖脂肽GLIP二级结构表征
采用圆二色谱法(CD)测定糖脂肽GLIP的二级结构。分别将抗菌糖脂肽GLIP溶解于纯水(模拟亲水环境)和30mM SDS溶液(模拟带负电的微生物膜)中配制150μM的糖脂肽溶液。将样品加入石英池(0.5mm路径长度)中，并在180～260nm的波长范围内扫描记录数据。最后，通过以下公式将获得的CD光谱转换为平均残余椭圆度：
θM＝(θobs×1000)/cln
其中，θM是残余椭圆度(deg·cm2 ·dmol-1)，θobs是在给定波长下针对缓冲液校正的观察椭圆度(mdeg)，c是肽浓度(mM)，l是路径长度(mm)，n是氨基酸个数。
实施例3：抗菌糖脂肽GLIP的体外抗菌活性测定
最低抑菌浓度(MIC)测定：将E.coliATCC 25922和S.aureusATCC 29213接种到LB培养基中37℃培养过夜，并转移到新鲜LB中培养至对数生长期。取菌液离心，用PBS洗涤菌体沉淀两次，以新鲜LB重悬细菌，制备成浓度约为1×105CFU/mL的菌悬液。将糖脂肽GLIP母液进行一系列倍比稀释获得浓度为2～256μM。将50μL菌悬液与倍比稀释后不同浓度的50μL肽溶液加入96孔板，每个浓度至少设置3个重复。以只含有LB的孔为阴性性对照组，含有菌而不含肽溶液的孔为阳性对照组，置于37℃培养12～16h。通过目视观察到96孔板底部未见浑浊的的最小浓度为糖脂肽GLIP的最低抑菌浓度。
最低杀菌浓度(MBC)测定：将MIC 96孔板中清澈孔的细菌悬浮液置于LB平板，无需进一步稀释，并在37℃下培养18小时观察结果。LB培养基中的MBC被定义为消除99.9％的活菌所需的最低药物浓度。
杀菌动力学：将革兰氏阴性菌E.coli ATCC 25922置于LB培养基中37℃培养过夜，取菌液用PBS离心洗3次，随后用新鲜LB稀释重悬获得浓度为×105～106CFU/mL的菌悬液。将浓度为8×MIC、4×MIC和2×MIC的糖脂肽GLIP溶液与同等体积上述菌悬液置于37℃共培养，随后于培养时间的0h、0.5h、1h、2h、3h、6h分别吸取混合物，稀释数倍后，进行LB琼脂平板涂布，在37℃培养24h。PBS组为对照组，通过观察LB琼脂平板的菌落产生情况，来测定糖脂肽GLIP的体外杀菌动力学。
实施例4：抗菌糖脂肽GLIP体外稳定性测定
血清稳定性：将不同浓度的糖脂肽GLIP溶液与50％FBS(FBS:PBS＝1:1,V/V)等体积混合后置于37℃恒温培养箱孵育30min。通过与上述MIC相同的实验方法，在96孔板中测定在血清影响下糖脂肽MIC值的变化。
胰蛋白酶稳定性：将25％胰蛋白酶母液用PBS稀释配制成浓度为0.002-2000μg/mL的胰蛋白酶溶液。然后将4×MIC浓度的糖脂肽GLIP溶液(100μL)与上述不同浓度的胰蛋白酶溶液等体积混合，并在37℃孵育1h后，然后60℃灭活15min。E.coli ATCC 25922培养至对数生长期，PBS洗涤后用新鲜LB培养基配制成浓度为1×105～106CFU/mL的细菌培养基。将100μL细菌培养基与上述100μL糖脂肽GLIP溶液加入无菌96孔聚丙烯微孔板中37℃孵育18h。用微孔板阅读器测定600nm处的吸光度值。
实施例5：抗菌糖脂肽GLIP生物相容性测定
细胞毒性实验：通过MTT还原法测定抗菌糖脂肽对小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞(小鼠单核巨噬细胞白血病细胞)的细胞毒性。将RPMI 1640培养基(补充有10％FBS和1％青-链霉素双抗)中的RAW264.7细胞接种到96孔板，浓度为1×105/孔，然后将其置于37℃培养箱在95％空气和5％CO2的加湿条件下中孵育24h。向96孔板中加入100μL糖脂肽GLIP溶液(终浓度为1-128μM)并孵育24h。然后向每孔中加入20μL MTT(5mg/mL)在37℃孵育4h。随后弃掉上清液，加入150μL DMSO，置于微孔板振荡器振摇5min使形成的甲瓒充分溶解。使用微孔板阅读器测定485nm处的吸光度。
溶血性测定：红细胞裂解释放的血红蛋白量用于测定肽的溶血活性。用抗凝管收集小鼠新鲜血液，1000rpm离心10min获得小鼠红细胞，并用0.9％NaCl离心洗涤三次。将100μL不同浓度的糖脂肽溶液与100μL 0.9％NaCl稀释的红细胞溶液在37℃恒温培养箱中孵育1h。将混合液以1000rpm离心5min，并将上清液转移到另一新的96孔板中。0.9％NaCl和无菌水中的红细胞分别为阴性对照和阳性对照。通过微板阅读器测量540nm处的吸光度来监测血红蛋白的释放。溶血百分比使用以下公式计算：
Hemolysis(％)＝[(A-A0)/(A100-A0)]×100
其中，A表示在糖脂肽GLIP溶液测定的吸光度，A0和A100分别表示在0.9％NaCl和无菌水中测定的0％和100％溶血时的吸光度。
溶血实验：取雌性小鼠(23～25g)两只，分别尾静脉注射200μL生理盐水(NS)和200μL糖脂肽GLIP(6mg/kg)溶液，两小时后通过小鼠眼眶取血收集血液，通过在荧光显微镜下观察两组小鼠红细胞形态来评价糖脂肽GLIP的溶血情况。
实施例6：抗菌糖脂肽GLIP破膜机制研究
生物膜清除实验：通过结晶紫染色法来检测糖脂肽对细菌生物膜的抑制能力。E.coli ATCC 25922和S.aureus ATCC 29213在LB中培养至对数生长期。取菌液离心，菌体沉淀用培养液重悬，以100μL/孔加入96孔板，37℃培养3天，使其在96孔板底部形成成熟生物膜。除去各孔悬浮细菌，并以PBS洗涤两次，每孔加入100μL倍比稀释后的糖脂肽GLIP溶液(1-64μM)，37℃培养24h。除去糖脂肽GLIP溶液，用PBS清洗两次，每孔加入100μL甲醇固定生物膜15min，除去甲醇溶液，置于室温下干燥。用100μL 0.1％结晶紫染色液染色10min，随后用PBS清洗五次，室温干燥。最后加入100μL 95％乙醇，轻轻摇晃几次。使用酶标仪检测595nm处的吸光度，并用以下公式计算生物膜清除率：
生物膜清除率(％)＝[(A100-A)/(A100-A0)]×100
其中，A表示抗菌糖脂肽GLIP在给定浓度下的吸光度，A0表示阴性对照的吸光度，A100表示阳性对照组的吸光度。
内膜渗透实验：通过ONPG摄取实验测定细菌内β-半乳糖苷酶的活性来检测内膜的通透性。将E.coli ATCC 25922和S.aureus ATCC 29213培养至对数生长期，然后以3600rpm离心5min获得细菌沉淀，并以无菌PBS离心洗涤沉淀两次。随后用含有1.5mM ONPG的无菌PBS重新悬浮细菌，并将细菌浓度调整为OD600＝0.05。将50μL菌悬液与倍比稀释后不同浓度50μL糖脂肽GLIP溶液(终浓度为1～64μM)共同孵育，使用酶标仪于420nm波长处每5min连续40min测定吸光度。
外膜渗透实验：使用荧光染料NPN(N-苯基-1-萘胺)测定糖脂肽GLIP对E.coliATCC 25922外膜通透性的影响。将E.coli ATCC 25922置于LB培养基中37℃培养过夜，然后再将其置于新鲜LB培养3-6h。取菌液以3600rpm离心5min，菌体沉淀用PBS离心清洗两次，最后用PBS重悬细菌获得OD600为0.5的细菌悬液。将终浓度为10μM的NPN加入细菌混悬液中，使用荧光分光光度计在入射波长为350nm、激发波长为420nm条件下测定背景荧光强度。将倍比稀释后的不同浓度的糖脂肽GLIP溶液(终浓度为2～64μM)加入至菌悬液，检测荧光，直至荧光强度不在发生显著增加。由于多粘菌素B(10mg/L)具有较强的外膜通透性，因此被用作阳性对照。将10min内的荧光强度取平均，根据以下公式计算NPN摄取百分比：
NPN uptake(％)＝(Fobs-F0)/(F100-F0)×100
其中，Fobs是在给定肽浓度下观察到的荧光，F0是在没有肽的情况下NPN的初始荧光，F100是在添加10μg/mL多粘菌素B后NPN的荧光。“100％”表示阳性对照多粘菌素B的NPN摄取量。
FCM实验：将E.coli ATCC 25922置于LB培养基中37℃培养至对数生长期，取菌液用PBS离心洗3次，用新鲜LB稀释至×105CFU/mL。将菌悬液与相同体积的8×MIC糖脂肽GLIP溶液在37℃分别培养0h、2h、4h、6h、10h。离心收集菌体，随后用PBS离心洗涤3次，加入50μg/mL PI室温下避光孵育20min。孵育完成后用PBS离心洗去未结合的PI染料，并用PBS重新悬浮细菌。使用流式细胞仪(FCM)记录激发波长488nm处的数据。
CLSM实验：将处于对数生长期的E.coli ATCC 25922，用PBS离心清洗3次，用新鲜LB稀释至×105CFU/mL。将菌悬液与相同体积的8×MIC脂肽-荧光素溶液在37℃分别培养0h、4h、8h、12h。离心收集菌体，随后用PBS离心洗涤3次，加入50μg/mL碘化丙啶(PI)室温下避光孵育20min。孵育完成后用PBS离心洗去未结合的PI染料，并用PBS重新悬浮细菌。取20μL涂板，使用激光共聚焦扫描显微镜(CLSM)记录数据。
TEM实验：使用透射电子显微镜(TEM)来评估糖脂肽GLIP处理后E.coli ATCC25922细胞形态和细胞内变化。取对数生长期E.coli ATCC 25922，用PBS离心洗涤两次，并用PBS重悬至OD600＝0.2。将4×MIC糖脂肽GLIP溶液与菌悬液等体积混合，37℃孵育2h，并以PBS组为阴性对照组。孵育完成后，离心收集细菌颗粒，用PBS离心清洗两次后，加入2.5％戊二醛固定液在4℃固定4h。之后用PBS清洗5次，加入1％锇酸固定90min，PBS清洗3次。用分级乙醇(50％、70％、80％、95％、100％)中各脱水15min，丙酮置换处理2次。丙酮和浸透剂混合物处理3h，在纯浸透剂中过夜。将细菌样品用包埋剂进行包埋，最后使用超薄切片机对细菌样品进行切片，用乙酸铀酰和柠檬酸铅染色，并用TEM进行观察。
实施例7：体内抗菌实验
小鼠急性腹膜炎模型：通过以E.coli ATCC 25922为模型菌建立小鼠急性腹膜炎模型，来测定所合成糖脂肽GLIP的体内抗菌效果。将E.coli ATCC 25922用无菌PBS离心清洗两次，并用NS重悬，调至浓度为OD600≈0.4。随机选取小鼠平均分为2组，分别记为NS组和糖脂肽GLIP组，对每只小鼠腹腔注射200μL菌液，观察记录小鼠出现急性腹膜炎典型症状时(腹泻、蜷缩少动、倒毛、精神萎靡、食欲废绝)各组小鼠分别通过腹腔注射200μL NS和200μL糖脂肽GLIP(6mg/kg)。记录48h内各组小鼠死亡情况，做小鼠生存率曲线，并分别于治疗的0h、12h、24h、48h处死小鼠取腹腔液进行平板计数。
小鼠细菌性角膜炎模型：取对数生长期的S.aureus ATCC 29213用PBS离心洗涤三次，最后用NS重悬(OD600≈0.5)备用。将小鼠随机平分为NS组和糖脂肽GLIP组，实验前用裂隙灯显微镜对每只小鼠的眼睛进行观察，均呈现正常生理状态。小鼠腹腔注射4％水合氯醛全身麻醉后，向小鼠眼部滴入一滴1％利多卡因并静置1min，用吸水纸从眼角吸掉多余的利多，再用NS清洗3-4次。用无菌刀片划伤小鼠眼角膜，并向伤口滴加40μL菌液。感染12h后拍照观察小鼠眼睛，各组小鼠分别用20μL NS和20μL糖脂肽GLIP(0.003g/mL)进行治疗,每天一次连续三天，并拍照观察记录小鼠眼睛的恢复情况。
小鼠背部全层创伤感染模型：为了进一步评估糖脂肽GLIP的体内抗菌活性，在小鼠背部建立了伤口感染模型。小鼠腹腔注射4％水合氯醛进行全身麻醉后，脱去背部毛发对皮肤进行消毒，在小鼠背部切掉直径6mm的全层皮肤，并将S.aureus ATCC 29213(3×107CFU/mL,40μL)注射到伤口，以构建感染的伤口模型。感染24小时后，分别用20μL PBS和20μL GLIP(0.004g/mL)隔天(第1、3、5、7、9天)处理小鼠感染伤口，与此同时，拍摄小鼠伤口照片，记录小鼠伤口愈合情况。然后在治疗后的第10天切除小鼠伤口及周围皮肤组织置于4％多聚甲醛溶液中固定24h，制成石蜡切片，通过H&E染色进行组织病理学分析。
本发明方法制备的抗菌糖脂肽，具有良好的生物医学性能：
(1)本抗菌糖脂肽GLIP在原核生物膜模拟环境中具有α-螺旋结构
研究表明，抗菌肽在各种环境下的结构变化与其生物活性相关。因此，通过CD谱研究了不同环境下抗菌糖脂肽GLIP的二级结构。由图1可以看出，在带负电的原核生物膜模拟环境30mM SDS溶液中糖脂肽GLIP在约208nm和222nm处有两个负峰，并在约195nm处呈现一个正峰，这表明糖脂肽GLIP在膜模拟环境SDS溶液中呈现典型的α-螺旋结构。而α-螺旋结构是抗菌肽形成两亲性结构的基础，对于抗菌肽发挥抗菌活性至关重要。
(2)本抗菌糖脂肽GLIP具有优异的体外抗菌活性
通过微量肉汤稀释法测定了抗菌糖脂肽GLIP对E.coli ATCC 25922和S.aureusATCC 29213的体外抗菌活性。结果如表1所示，本发明抗菌糖脂肽GLIP对E.coli ATCC25922和S.aureus ATCC 29213的MIC值分别为3.5μM和1.5μM，显示出优异的体外抗菌活性。
为了进一步评估所合成糖脂肽GLIP的抗菌活性，进行了MBC测定(表1)。糖脂肽GLIP对E.coli ATCC 25922和S.aureus ATCC 29213的MBC值分别是4μM和3μM，与其MIC相比几乎不变，MBC/MIC比值<4，表明糖脂肽可作为杀菌剂发挥优异的杀菌活性。
表1抗菌糖脂肽GLIP的MIC及MBC。
然后，分别在8×MIC、4×MIC和2×MIC的糖脂肽GLIP浓度下，测定了抗菌糖脂肽对革兰氏阴性菌E.coli ATCC 25922的杀菌动力学。结果如图2所示，糖脂肽的杀菌效果与药物浓度和作用时间密切相关。当4×MIC浓度的糖脂肽GLIP与E.coli ATCC 25922培养2h时细菌被全部杀死；随着糖脂肽浓度的增大，8×MIC糖脂肽GLIP在1h内即可完全杀灭E.coliATCC 25922，展现出了更快、更强的杀菌效果。这些结果表明本发明抗菌糖脂肽可以在较短的时间内以时间和浓度依赖的方式对大肠杆菌E.coli ATCC 25922产生杀灭作用。
(3)本抗菌糖脂肽GLIP具有良好蛋白水解稳定性
用25％FBS检测糖脂肽GLIP的蛋白水解抗性。如表2，糖脂肽GLIP对E.coli ATCC25922和S.aureus ATCC 29213的MIC值分别为3.5μM和1μM与正常MIC相比几乎没有变化，糖脂肽在FBS中保持了其抗菌活性，由此表明该糖脂肽显示出良好的的抗蛋白水解作用，具有优异的血清稳定性。
表2抗菌糖脂肽GLIP在25％FBS中的MIC。
同时，通过测定胰蛋白酶消化后肽对细菌的抗菌活性变化来评估糖脂肽GLIP的体外胰蛋白酶稳定性。如图3所示，随着胰蛋白酶浓度的增大，糖脂肽的抗菌活性随之逐渐降低。在低浓度胰酶作用下，GLIP仍可以抑制约50％的细菌生长，证实了脂化及糖基化修饰后的糖脂肽GLIP对胰蛋白酶具有一定的抗性。
(4)本抗菌糖脂肽GLIP具有良好的生物相容性
膜抗菌剂经常遇到的一个挑战是，除了裂解细菌膜，它们还会裂解细胞膜，导致非特异性毒性。因此，测定了抗菌糖脂肽对RAW264.7细胞系的细胞毒性。结果如图4a，当糖脂肽的浓度低于4μM时，RAW 264.7细胞的相对细胞率高于70％。表明低于4μM时，糖脂肽具有较低的细胞毒性。随着糖脂肽浓度的增加相对细胞存活率持续下降，当脂肽浓度高于8μM时，RAW 264.7细胞的相对细胞存活率下降至低于30％。表明在一定浓度范围内，糖脂肽GLIP发挥抗菌作用同时具有较低的细胞毒性。
为了进一步检测所合成糖脂肽的生物相容性，使用新鲜小鼠红细胞评估了所合成糖脂肽的溶血性。结果如图4b所示，在8μM糖脂肽浓度下，几乎没有溶血现象发生。而当浓度达到16μM时，溶血率也仅为3.7％。尽管随着糖脂肽浓度的增加(8～128μM)，糖脂肽对红细胞表现出轻微的浓度依赖性毒性，但其诱导溶血所需的肽浓度远高于其MIC值，表明所合成的糖脂肽GLIP具有较好的生物安全性。
同时，由图4c和4d小鼠红细胞形态可以看出，NS组小鼠红细胞呈现两面中央凹的圆饼状正常形态，糖脂肽GLIP处理的小鼠红细胞大部分呈现正常形态，只有极少数红细胞破裂呈现不规则形态，与NS组相比几乎无溶血现象发生，表明糖脂肽GLIP基本不会引起溶血。
(5)本抗菌糖脂肽GLIP具有较好的破膜活性
抗菌肽和细菌膜之间的相互作用是肽的膜活性机制的基础。ONPG摄取实验用来测定肽对细菌内膜的破坏能力。由图5a和5b可以看出对于E.coli ATCC 25922和S.aureusATCC 29213，随着糖脂肽GLIP浓度的增大和时间的延长，吸光度不断增大，且均高于阴性对照组，表明糖脂肽GLIP能够以浓度和时间依赖的方式有效地破坏细菌内膜，导致ONPG进入细菌内，生成ONP。此外，糖脂肽GLIP对E.coli ATCC 25922的内膜渗透作用略强于S.aureusATCC 29213。
生物膜是由表面生长的细菌通过自身产生的细胞外基质结合在一起形成的多细菌群落。生物膜赋予了细菌对很多抗生素的抵抗力，抵御细菌外部的侵袭，从而妨碍细菌感染的治疗。以E.coli ATCC 25922和S.aureus ATCC 29213为病原菌模型，通过结晶紫染色法测定了糖脂肽对细菌成熟生物膜的清除能力。图5c所示，在用不同浓度的糖脂肽GLIP处理生物膜24h后，GLIP对E.coli ATCC 25922和S.aureus ATCC 29213的成熟生物膜均有不同程度的抑制作用，并呈现浓度依赖性。在32μM浓度下，糖脂肽对S.aureus ATCC 29213的生物膜具有最大程度上的抑制作用，清除率约为46％；而在16μM浓度下，糖脂肽对E.coliATCC 25922的最大生物膜清除率约为41％。此外，几乎在所有相同药物浓度下，糖脂肽对S.aureus ATCC 29213生物膜清除能力均优于E.coli ATCC 25922。这些结果证实了，所设计糖脂肽GLIP对抗细菌生物膜的能力，这将为生物膜感染提供新的解决方案。
革兰氏阴性菌的外膜为其提供了一种保护屏障，对一系列抗菌药物提供了耐药性保护。NPN是一种疏水荧光染料，在亲水环境中荧光较弱，而在疏水环境(如细菌外膜)中会呈现出较强的荧光。从图5d可以看出，在NPN存在的条件下向菌悬液添加不同浓度的抗菌糖脂肽，使得E.coli ATCC 25922对NPN的摄取显著增加。随着糖脂肽浓度的增大，NPN的摄取逐渐增强，且在32μM时呈现出较高的NPN摄取百分比，表明该抗菌糖脂肽GLIP可以以浓度依赖的方式破坏大肠杆菌的外膜且对其外膜有较强的渗透能力。
使用DNA荧光染料PI检测细菌细胞膜完整性。当抗菌糖脂肽作用于细菌膜时，细菌膜破裂，PI进入菌体与DNA结合，使菌体产生红色荧光。由图6所示，用4×MIC糖脂肽处理E.coli ATCC 259220h、2h、4h、6h、10h时，分别有0％、94.1％、93.6％、86.6％和71.9％的细菌被PI荧光标记。表明糖脂肽GLIP对E.coli ATCC 25922具有较强的膜破坏能力。
为了进一步证实细菌对抗菌糖脂肽的摄取，通过在脂肽C端接入具有绿色荧光信号的荧光素，同时采用PI染色进行激光共聚焦测定。当脂肽被细菌摄取，细菌被脂肽杀灭，同一细菌同时被脂肽--荧光素的绿色荧光和PI的红色荧光信号标记。如图7，可以看出在不同时间点均具有双色荧光的细菌，在4h内被绿色荧光和的红色荧光同时标记的荧光细菌数量最多，而随着时间的延长荧光菌所占比例减少，这与FCM的结果是一致的。由此证实抗菌糖脂肽GLIP可以被细菌摄取内化，发挥较强的抗菌活性。
使用TEM观察2×MIC糖脂肽处理2h后大肠杆菌形态和胞内变化。由图8a，对照组未经处理的大肠杆菌形态完整、菌膜完整光滑、无内容物渗出，呈现正常的杆状或圆球状。而图8b，糖脂肽GLIP处理后的大肠杆菌出现菌膜破裂和细胞内内容物的渗漏，表明糖脂肽GLIP可以通过作用于E.coli ATCC 25922的细菌膜导致细菌膜通透性增加，并裂解细菌膜，发挥抗菌活性。
(5)本抗菌糖脂肽具有优异的体内抗菌活性
通过腹腔注射E.coli ATCC 25922构建小鼠急性细菌性腹膜炎模型来测定抗菌糖脂肽的体内抗菌效果。在感染30min后，各组小鼠呈现精神萎靡，蜷缩少动，拒食，反应迟钝等表观症状，并出现严重腹泻症状，证实模型建造成功。对各组小鼠分别注射200μL NS和糖脂肽GLIP(6mg/kg)进行治疗，记录不同时间点各组小鼠的死亡(或存活)情况，并取腹腔液对其菌落进行计数。由图9a，NS组小鼠存活率为17％，糖脂肽GLIP组为83％，这表明糖脂肽可以有效发挥体内抗菌活性，提高小鼠存活率。同时如图9b，在治疗时间内各组小鼠腹腔液细菌数均逐渐减少，但是GLIP组的菌落数要明显低于NS组。在12h内NS组小鼠腹腔液菌落数与初始感染的细菌数相比只有略微的减少，几乎不变；而GLIP组可以观察到细菌菌落数的明显减少，表明糖脂肽GLIP可以在短时间内有效发挥体内抗菌作用。
细菌性角膜炎约占所有微生物性角膜炎病例的90％，而金黄色葡萄球菌是导致角膜炎的最常见病原体之一。通过革兰氏阳性菌S.aureus ATCC 29213构建小鼠细菌性角膜炎模型来进一步评估抗菌糖脂肽的体内抗菌效果。如图9c，实验前用裂隙灯显微镜观察各组小鼠眼睛均呈正常生理状态，角膜清晰完整。感染S.aureus ATCC 2921312h后，NS组和GLIP组小鼠出现角膜水肿、充血等病理状态。对各组小鼠分别采用相应的NS和GLIP(0.003g/mL)治疗48h后，在NS组小鼠眼睛中观察到明显的褐色斑块生成；GLIP组治疗的小鼠眼睛角膜清晰完整，无斑块出现。这表明糖脂肽GLIP可以有效对抗金黄色葡萄球菌引起的眼部感染。
细菌感染经常影响伤口愈合的速度，甚至引起炎症反应，导致严重的健康问题。通过在小鼠背部建立了伤口感染模型，以确定GLIP在治疗金黄色葡萄球菌所致伤口感染及促进伤口愈合的潜力。如图9d所示，随着治疗时间的延长，观察到PBS组小鼠伤口愈合迟缓，且第9天仍有较大的伤口创面。相反地，在GLIP组小鼠伤口愈合较快，在处理的第9天几乎完全愈合。这表明GLIP可以对感染伤口中的金黄色葡萄球菌产生杀灭作用。同时，采集小鼠背部创口皮肤进行了H&E染色组织学分析，如图9e，所有组均可见局部出血，但阴性对照组真皮及皮下组织可见多处明显炎症细胞浸润；GLIP组表皮周围可见一处明显炎细胞浸润，其他部位未见明显病变，并可见成纤维细胞形成，表明伤口发生了恢复过程。以上结果表明抗菌糖脂肽GLIP可以用于抑制金黄色葡萄球菌感染的伤口中的感染、减少炎症，促进伤口愈合。

Claims (5)

1.一种抗菌糖脂肽GLIP，其特征在于，所述抗菌糖脂肽GLIP从N端到C端序列为C12H20N2O-Trp-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Trp-Trp-Leu-Lys-Lys-Phe-Lys-Lys-Leu-Asp-C6H12NO5(简写为C12H20N2O-WKKLLKWWLKKFKKLD-C6H12NO5)，其中，Trp(W)为色氨酸，Lys(K)为赖氨酸，Leu(L)为亮氨酸，Phe(F)为苯丙氨酸，Asp(D)为天冬氨酸，其N端所连接修饰为C12H21N2O2，C端连接单糖分子为C6H13NO5(D-(+)-葡萄糖胺)，结构式如下所示:
2.根据权利要求1的一种抗菌糖脂肽GLIP，其特征在于，其制备方法包括：
按所述抗菌糖脂肽的氨基酸序列，采用多肽固相合成法合成所述抗菌糖脂肽的肽骨架。
3.根据权利要求1的一种抗菌糖脂肽GLIP，其特征在于，其制备方法包括：
所述抗菌糖脂肽的肽骨架N末端修饰分子离子液C12H21N2O2的合成。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述抗菌糖脂肽制备方法还包括对抗菌肽骨架N端进行脂化修饰和对C末端进行糖基化修饰的步骤。
5.根据权利要求1的一种抗菌糖脂肽GLIP，其特征在于，所述抗菌糖脂肽在制备抗菌剂中及制备治疗细菌感染药物的应用。
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