CN117624134B - 一种靶向降解hdac4的化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种靶向降解HDAC4的化合物及其制备方法和应用，所述靶向降解HDAC4的化合物包括式（I）所示的化合物或其药学上可接受的盐，（I）。本发明提供的靶向降解HDAC4的化合物是一种由他喹莫德和E3泛素连接酶CRBN蛋白配体拼接在一起的PROTAC类化合物，能靶向降解HDAC4，特异性高且药效好，用于制备抗肿瘤药物，能有效地降低肿瘤细胞中HDAC4的蛋白水平，从而抑制肿瘤细胞的增殖。

Description

一种靶向降解HDAC4的化合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种靶向降解HDAC4的化合物及其制备方法和应用。
背景技术
组蛋白去乙酰化酶4（histone deacetylase 4，HDAC4）是依赖锌的去乙酰化酶，属于Ⅱa类去乙酰化酶，由去乙酰化酶结构域发挥去乙酰化酶的作用，通过蛋白翻译后的修饰，在细胞核和细胞质之间穿梭，进一步参与多种调节过程。此外，HDAC4还有苏木化（sumoylation，SUMO）E3泛素连接酶的作用，当其与人核因子κB抑制蛋白α（IκBα）结合后，IκBα蛋白在第21位的赖氨酸（Lys21，K21）处被SUMO修饰。HDAC4通过去乙酰化作用和苏木化作用参与基因的转录调控、细胞凋亡、代谢等诸多生物进程，在多种疾病的发生发展中发挥重要作用。
研究发现，组蛋白去乙酰化酶抑制剂（histone deacetylase inhibitor，HDACi）对癌症有一定疗效。HDACi的结构由表面识别区（CAP）、连接区（Linker）和锌离子结合区（ZBG）3部分组成，通过抑制肿瘤细胞内组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDACs)活性，使肿瘤细胞内组蛋白的乙酰化程度增加，重新活化受抑制的抑癌基因，并诱导肿瘤细胞分化、促进细胞凋亡。因此，开发特异性HDACi，通过抑制HDAC活性以实现癌症治疗成为新的方向。迄今为止，美国食品药品监督管理局（FDA）批准上市的小分子HDACis药物有伏立诺他（vorinostat）、罗米地辛（romidepsin）、贝林司他（belinostat）和帕比司他（panobinostat）。其中，针对HDAC4的抑制剂他喹莫德（tasquinimod）在锌结合调节区域与HDAC4结合，阻止HDAC4/nuclear receptor co-repressor(N-CoR)/HDAC3复合物的形成，从而达到抗癌的作用，其治疗前列腺癌症已到达Ⅱ期临床试验阶段，但是tasquinimod仅抑制了HDAC4的去乙酰化作用，并没有抑制SUMO活性，药物效率低。
发明内容
基于此，本发明实施例提供了一种靶向降解HDAC4的化合物及其制备方法和应用。该化合物是一种由他喹莫德和E3泛素连接酶Cereblon（CRBN）蛋白配体拼接在一起的蛋白降解靶向嵌合体（PROTAC）化合物，能靶向降解HDAC4，特异性高且药效好，用作制备抗肿瘤药物，能有效地降低肿瘤细胞中HDAC4的蛋白水平，从而抑制肿瘤细胞的增殖。
第一方面，本发明实施例提供了一种靶向降解HDAC4的化合物，所述靶向降解HDAC4的化合物包括式（I）所示的化合物或其药学上可接受的盐，
（I）。
本发明实施例提供的靶向降解HDAC4的化合物是一种PROTAC化合物，由HDAC4抑制剂他喹莫德、E3泛素连接酶CRBN蛋白配体以及连接子组成，能特异性识别HDAC4并使其被泛素化标记，从而使HDAC4被蛋白酶体识别并降解。该靶向降解HDAC4的化合物的特异性高且药效好，用作制备抗肿瘤药物，能有效地降低肿瘤细胞中HDAC4的蛋白水平，从而抑制肿瘤细胞的增殖。
第二方面，本发明实施例提供了一种靶向降解HDAC4的化合物的制备方法，包括：
将式（V）所示的化合物、式（VI）所示的化合物和缩合剂混合形成缩合反应液，经缩合反应得到第一方面所述的靶向降解HDAC4的化合物，
（V），/>（VI）。
本发明实施方式中，所述式（V）所示的化合物的制备方法包括：
将式（VII）所示的化合物、醇和酸催化剂混合形成酯化反应液，经酯化反应得到式（II）所示的化合物，其中，X选自Br、Cl或I，Y选自甲基或乙基，
（VII），/>（II）；
将所述式（II）所示的化合物、式（III）所示的化合物和无机碱混合形成取代反应液，在惰性气氛下进行取代反应得到式（IV）所示的化合物，
（III），/>（IV）；
将所述式（IV）所示的化合物和碱催化剂混合形成水解反应液，经水解反应得到所述式（V）所示的化合物。
本发明实施方式中，所述酯化反应液中所述式（VII）所示的化合物与所述醇的摩尔比小于1:20；所述醇包括甲醇和乙醇中的至少一种；所述酸催化剂包括H2SO4、H3PO3和HCl中的至少一种；所述酯化反应的温度为40℃-80℃，所述酯化反应的时间为12h-20h。
本发明实施方式中，所述取代反应液中所述式（II）所示的化合物和所述式（III）所示的化合物的摩尔比为（1-5）:1；所述无机碱包括碳酸铯、碳酸钾和碳酸钠中的至少一种；所述取代反应的温度为80℃-120℃，所述取代反应的时间为10h-20h。
本发明实施方式中，所述水解反应液中所述式（IV）所示的化合物的浓度为10mg/mL-100mg/mL；所述碱催化剂包括氢氧化锂和氢氧化钠中的至少一种；所述水解反应的温度为0℃-50℃，所述水解反应的时间为0.5h-5h。
本发明实施方式中，所述缩合反应液中所述式（V）所示的化合物和所述式（VI）所示的化合物的摩尔比为（1-2）:1；所述缩合剂包括2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯、N,N-二异丙基乙胺、丙基膦酸酐和N,N-碳酰二咪唑中的至少一种；所述缩合反应的温度为20℃-30℃，所述缩合反应的时间为1h-6h。
本发明实施例提供的靶向降解HDAC4的化合物的制备方法简单，操作方便，合成难度较小，有利于靶向降解HDAC4的化合物的使用。
第三方面，本发明实施例提供了一种用于治疗与HDAC4活性或表达异常相关的疾病的药物，包括第一方面所述的靶向降解HDAC4的化合物或第二方面所述的制备方法制得的靶向降解HDAC4的化合物。
本发明实施方式中，所述用于治疗与HDAC4活性或表达异常相关的疾病的药物还包括药学上可接受的载体和辅料中的至少一种。
本发明实施例提供的用于治疗与HDAC4活性或表达异常相关的疾病的药物具有靶向降解HDAC4的化合物，能有效地降低细胞中HDAC4的蛋白水平，对HDAC4的抑制效果好。
第四方面，本发明实施例提供了第一方面所述的靶向降解HDAC4的化合物或第二方面所述的制备方法制得的靶向降解HDAC4的化合物在制备治疗与HDAC4活性或表达异常相关的疾病的药物中的应用。
本发明实施方式中，所述与HDAC4活性或表达异常相关的疾病包括肺癌、鼻咽癌、胶质瘤、甲状腺癌、结直肠癌、头颈癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、肾癌、前列腺癌、睾丸癌、乳腺癌、宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌、皮肤癌（如黑素瘤）和淋巴癌中的至少一种。
本发明实施方式中，所述靶向降解HDAC4的化合物作为单一活性成分或与其他药学上可接受的活性成分构成所述治疗与HDAC4活性或表达异常相关的疾病的药物。
本发明实施例第四方面所述的应用中，所述靶向降解HDAC4的化合物或所述药物可应用于制备治疗与HDAC4去乙酰化活性相关的疾病的药物，也可应用于制备治疗与HDAC4苏木化（SUMO）活性相关的疾病的药物，还可应用于制备治疗与HDAC4表达异常相关的疾病的药物。所述靶向降解HDAC4的化合物能选择性地降解HDAC4，且具有较高的抑制活性，用于制备与HDAC4活性或表达异常相关疾病的药物，尤其是抗肿瘤活性药物方面具有较高的药用价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图进行说明。
图1是本发明实施例1合成的式（Ⅳ-1）所示的化合物的LC-MS图谱；
图2是本发明实施例1合成的式（Ⅴ）所示的化合物的LC-MS图谱；
图3是本发明实施例1合成的化合物SCT-1的LC-MS图谱；
图4是本发明实施例1合成的式（Ⅳ-1）所示的化合物的核磁氢图谱；
图5是本发明实施例1合成的式（Ⅴ）所示的化合物的核磁氢图谱；
图6是本发明实施例1合成的化合物SCT-1的核磁氢图谱；
图7是本发明实施例1合成的化合物SCT-1的HPLC图谱；
图8是本发明实施例1合成的化合物SCT-1的SPPIER实验结果图，其中，（a）是各组细胞的荧光图，（b）是（a）中箭头指向区域的荧光峰图；
图9是本发明实施例1合成的化合物SCT-1的细胞毒性检测结果图；
图10是本发明实施例1合成的化合物SCT-1对HDAC4蛋白的降解活性结果图；
图11是本发明实施例1合成的化合物SCT-1抗肿瘤细胞活性测试结果图；
图12是本发明实施例1合成的化合物SCT-1抑制肿瘤细胞增殖的结果图；
图13是本发明实施例1合成的化合物SCT-1抑制肿瘤细胞克隆形成的结果图，其中，（a）是肿瘤细胞经SCT-1处理后在平板上的克隆形成情况，（b）是肿瘤细胞经SCT-1处理后的克隆形成数量统计结果；
图14是肿瘤细胞经本发明实施例1合成的化合物SCT-1处理后的细胞周期检测结果图，其中，（a）肿瘤细胞经SCT-1处理后的细胞周期检测图，（b）肿瘤细胞经SCT-1处理后处于不同细胞周期的细胞数量统计结果；
图15是本发明实施例1合成的化合物SCT-1在小鼠移植瘤模型实验中抑制肿瘤生长的结果图，其中，（a）为各组小鼠切除的肿瘤，（b）为各组肿瘤重量的统计结果；
图16是对比例1合成的式（Ⅹ）所示的化合物的LC-MS图谱；
图17是对比例1合成的式（XI）所示的化合物的LC-MS图谱；
图18是对比例1合成的化合物SCT-2的LC-MS图谱；
图19是本发明对比例1合成的化合物SCT-2的核磁氢图谱；
图20是本发明对比例1合成的化合物SCT-2对HDAC4蛋白的降解活性结果图；
图21是本发明实施例1合成的化合物SCT-1分子的三维结构图；
图22是本发明对比例1合成的化合物SCT-2分子的三维结构图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例提供了一种靶向降解HDAC4的化合物，靶向降解HDAC4的化合物包括式（I）所示的化合物或其药学上可接受的盐，
（I）。
需要说明的是，本发明所描述的结构式包括所有的同分异构形式（如对映异构，非对映异构，和几何异构（或构象异构））：例如含有不对称中心的R、S构型，双键的（Z）、（E）异构体，和（Z）、（E）的构象异构体。因此，本发明的化合物的单个立体化学异构体或其对映异构体，非对映异构体，或几何异构体（或构象异构体）的混合物都属于本发明的范围。
本发明实施方式中，其药学上可接受的盐包括式（I）所示的化合物与下列至少一种酸形成的酸加成盐：盐酸、氢溴酸、硫酸。一些实施例中，靶向降解HDAC4的化合物包括式（I）所示的化合物、式（I）所示的化合物的盐酸盐、式（I）所示的化合物的氢溴酸盐和式（I）所示的化合物的硫酸盐中的至少一种。
本发明实施方式中，式（I）所示的化合物或其药学上可接受的盐抑制肿瘤细胞生长的IC50可以为0.86 μmol/L。一实施例中，式（I）所示的化合物抑制人大细胞肺癌细胞H460生长的IC50为0.86 μmol/L。
本发明实施例提供的靶向降解HDAC4的化合物是一种PROTAC化合物，由HDAC4抑制剂他喹莫德、E3泛素连接酶CRBN蛋白配体以及连接子组成，能特异性识别HDAC4并将其打上泛素化的标签，泛素化的HDAC4进而被细胞内的蛋白酶体26S识别并降解。相较于E3泛素连接酶von Hippel-Lindau（VHL）蛋白配体和凋亡蛋白抑制因子家族（IAP）的E3泛素连接酶的蛋白配体，本申请采用的CRBN蛋白配体组成的PROTAC化合物对组蛋白去乙酰化酶的降解效率更高，且本申请采用的连接子分子链长度适中，既能实现CRBN蛋白配体和他喹莫德的结合，又不影响两者的结构，有利于提升靶向降解HDAC4的化合物的活性。该靶向降解HDAC4的化合物对HDAC4的酶活性和非酶活性均能起到清除作用，其疗效不易受到HDAC4的增加或突变的影响，在一定程度上能克服现有HDAC4的耐药性。
相对于传统的HDAC4抑制剂和抗体，该靶向降解HDAC4的化合物能够利用机体内天然存在的蛋白清理系统，降低蛋白水平而非抑制蛋白的功能，发挥治疗疾病的目的，不仅能抑制HDAC4的去乙酰化作用，还实现了靶向降解HDAC4蛋白SUMO活性的问题，具有更加显著的优势。首先，传统的小分子HDAC4抑制剂和抗体等都是通过“占据驱动”的作用模式抑制靶蛋白的功能发挥治疗疾病的作用。该靶向降解HDAC4的化合物不是影响蛋白的功能，而是介导降解致病靶蛋白。其次，该靶向降解HDAC4的化合物对于没有活性位点的HDAC4蛋白，只要能够产生结合作用就可以诱导相关蛋白被降解，可以大大提高靶点的范围。
此外，该靶向降解HDAC4的化合物的降解作用的实现是一个催化过程，当HDAC4被泛素化后，该靶向降解HDAC4的化合物就会被剥离进入下一轮循环，可催化降解超化学计量的HDAC4，具有低剂量、高药效的特点。综上，该靶向降解HDAC4的化合物的特异性高且药效好，用作制备抗肿瘤药物，能有效地降低肿瘤细胞中HDAC4的蛋白水平，从而抑制肿瘤细胞的增殖。
本发明实施例还提供了一种靶向降解HDAC4的化合物的制备方法，包括：
将式（V）所示的化合物、式（VI）所示的化合物和缩合剂混合形成缩合反应液，经缩合反应得到上述任一实施方式中的靶向降解HDAC4的化合物，
（V），/>（VI）。
本发明实施例提供的靶向降解HDAC4的化合物的制备方法简单，操作方便，合成难度较小，有利于靶向降解HDAC4的化合物的使用。
一些实施方式中，式（V）所示的化合物、式（VI）所示的化合物和缩合剂可溶于第一有机溶剂中进行缩合反应，第一有机溶剂能够增加反应物分子间的相互作用，从而加快反应速率。一些实施例中，第一有机溶剂可以为二甲基亚砜（DMSO）、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）和N-甲基吡咯烷酮（NMP）中的至少一种。具体地，靶向降解HDAC4的化合物的合成路线如下所示：
。
本发明实施方式中，式（I）所示的化合物的药学上可接受的盐可以由式（I）所示的化合物与酸反应制得，酸可以为盐酸、氢溴酸和硫酸中的至少一种。一实施例中，式（I）所示的化合物的盐酸盐可以由式（I）所示的化合物与盐酸反应制得。另一实施例中，式（I）所示的化合物的氢溴酸盐可以由式（I）所示的化合物与氢溴酸反应制得。又一实施例中，式（I）所示的化合物的硫酸盐可以由式（I）所示的化合物与硫酸反应制得。
本发明实施方式中，式（V）所示的化合物的制备方法包括：
将式（VII）所示的化合物、醇和酸催化剂混合形成酯化反应液，经酯化反应得到式（II）所示的化合物，其中，X选自Br、Cl或I，Y选自甲基或乙基，
（VII）；/>（II）；
将式（II）所示的化合物、式（III）所示的化合物和无机碱混合形成取代反应液，在惰性气氛下进行取代反应得到式（IV）所示的化合物，
（III），/>（IV）；
将式（IV）所示的化合物和碱催化剂混合形成水解反应液，经水解反应得到式（V）所示的化合物。
本发明实施方式中，式（II）所示的化合物的合成路线如下所示：
。
本发明实施方式中，式（II）所示的化合物、式（III）所示的化合物和无机碱可溶于第二有机溶剂中进行取代反应，第二有机溶剂能很好地溶解和分散反应物，有利于取代反应的快速进行。一些实施例中，第二有机溶剂例如可以为二甲基甲酰胺、乙腈和二甲基亚砜中的至少一种。具体地，式（IV）所示的化合物的合成路线如下所示：
。
本发明实施方式中，式（IV）所示的化合物和碱催化剂可溶于第三有机溶剂和无机溶剂中进行水解反应，第三有机溶剂能很好地溶解和分散反应物，无机溶剂能溶解水解反应产生的酸，有利于水解反应的快速进行。一些实施例中，第三有机溶剂例如可以为四氢呋喃、乙腈和二甲基亚砜中的至少一种，无机溶剂例如可以为水。具体地，式（V）所示的化合物的合成路线如下所示：
。
本发明实施方式中，酯化反应液中式（VII）所示的化合物与醇的摩尔比可以小于1:20，既能保证酯化反应的快速进行，又不会造成反应物的浪费，降低药物合成成本。一些实施例中，酯化反应液中式（VII）所示的化合物与醇的摩尔比可以但不限于为1:21、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45或1:50。
本发明实施方式中，醇可以为甲醇和乙醇中的至少一种。上述醇活性高，参与酯化反应的能力强，且价格低廉，有利于降低药物合成成本。
本发明实施方式中，酸催化剂可以H2SO4、H3PO3和HCl中的至少一种。上述酸催化剂具有较高的催化活性，有利于酯化反应的快速进行。
本发明实施方式中，酯化反应的温度可以为40℃-80℃，酯化反应的时间可以为12h-20h，有利于反应物的充分反应，同时又可以避免副反应的发生。一些实施例中，酯化反应的温度可以但不限于为40℃、50℃、60℃、70℃或80℃，酯化反应的时间可以但不限于为12h、13h、14h、15h、16h、17h、18h、19h或20h。
本发明实施方式中，取代反应液中式（II）所示的化合物和式（III）所示的化合物的摩尔比可以为（1-5）:1，既能保证取代反应的快速进行，又不会造成反应物的浪费，降低药物合成成本。一些实施例中，取代反应液中式（II）所示的化合物和式（III）所示的化合物的摩尔比可以但不限于为1:1、2:1、3:1、4:1或5:1。
本发明实施方式中，无机碱可以为碳酸铯、碳酸钾或碳酸钠中的任意一种，无机碱能中和反应生成的氢卤酸，让反应更好地进行。
本发明实施方式中，取代反应的温度可以为80℃-120℃，取代反应的时间可以为10h-20h，有利于充分反应，同时又可以避免副反应的发生。一些实施例中，取代反应的温度可以但不限于为80℃、90℃、100℃、110℃或120℃，取代反应的时间可以但不限于为10h、11h、12h、13h、14h、15h、16h、17h、18h、19h或20h。
本发明实施方式中，水解反应液中式（IV）所示的化合物在水解反应液中的浓度可以为10mg/mL-100mg/mL，既能保证取代反应的快速进行，又不会造成反应物的浪费，降低药物合成成本。一些实施例中，水解反应液中式（IV）所示的化合物的浓度可以为10mg/mL、20mg/mL、30mg/mL、40mg/mL、50mg/mL、60mg/mL、70mg/mL、80mg/mL、90mg/mL或100mg/mL。
本发明实施方式中，碱催化剂可以为氢氧化锂或氢氧化钠。上述碱催化剂具有较高的催化活性，有利于水解反应的快速进行。
本发明实施方式中，水解反应的温度可以为0℃-50℃，水解反应的时间为0.5h-5h，有利于反应物的充分水解，同时又可以避免副反应的发生。一些实施例中，水解反应的温度可以但不限于为10℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃或50℃，水解反应的时间可以但不限于为0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h、3h、3.5h、4h、4.5h或5h。
本发明实施方式中，缩合反应液中式（V）所示的化合物和式（VI）所示的化合物的摩尔比可以为（1-2）:1，既能保证缩合反应的快速进行，又不会造成反应物的浪费，降低药物合成成本。一些实施例中，缩合反应液中式（V）所示的化合物和式（VI）所示的化合物的摩尔比可以但不限于为1:1、1.5:1、1.8:1或2:1。
本发明实施方式中，缩合剂可以为2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯、N,N-二异丙基乙胺、丙基膦酸酐和N,N-碳酰二咪唑中的至少一种。上述缩合剂既能促进缩合反应的快速进行，又不会污染反应产物。
本发明实施方式中，缩合反应的温度可以为20℃-30℃，缩合反应的时间可以为1h-6h，有利于反应物的充分反应，同时又可以避免副反应的发生。一些实施例中，缩合反应的温度可以但不限于为20℃、22℃、25℃或30℃，缩合反应的时间可以但不限于为1h、2h、3h、4h、5h或6h。
本发明实施例还提供了一种用于治疗与HDAC4活性或表达异常相关的疾病的药物，包括上述任一实施方式中的靶向降解HDAC4的化合物或上述任一实施方式中的制备方法制得的靶向降解HDAC4的化合物。该药物具有靶向降解HDAC4的化合物，能够有效地抑制肿瘤细胞内组蛋白去乙酰化酶4活性，使肿瘤细胞内组蛋白的乙酰化程度增加，并能重新活化受抑制的抑癌基因，从而诱导肿瘤细胞分化，促进肿瘤细胞凋亡，进而达到治疗肿瘤的效果。
本发明实施方式中，用于治疗与HDAC4活性或表达异常相关的疾病的药物还包括药学上可接受的载体和辅料中的至少一种。此时该药物中同时含有靶向降解HDAC4的化合物，以及药学上可接受的载体和/或辅料。在本发明中，“药学上可接受的载体”的作用是运输本发明中的药物，使其发挥应有的作用。一般而言，运输是从一个器官或者某一部分到达另外一个器官或者另外一个部分，载体必须和药物成分相兼容，不影响药物的生物学活性，而且相对是无毒的，比如该载体进入体内而不会引起毒副作用或和其携带的药物发生严重的反应，其对患者不产生负面影响。
本发明实施方式中，药学上可接受的载体包括溶剂、聚合物、脂质体、重组病毒载体和真核重组表达载体中的至少一种，但不限于此。在一实施例中，溶剂包括但不限于水、生理盐水，以及其他非水性溶剂中的至少一种。在另一实施例中，聚合物包括聚赖氨酸、聚乙烯亚胺（支状和/或链状）及其改性物、聚酰胺-胺型树枝状高分子（PAMAM）及其衍生物、聚丙烯亚胺树枝状高分子（PPI）及其衍生物、壳聚糖、聚乳酸-羟基乙酸（PLGA）、聚乳酸、明胶、环糊精、海藻酸钠、白蛋白和血红蛋白中的一种或多种，但不限于此。其中，聚乙烯亚胺及其改性物、PAMAM及其衍生物、PPI及其衍生物、壳聚糖等可称为阳离子聚合物。在另一实施例中，脂质体可以由阳离子类脂、中性辅助类脂、胆固醇、磷脂（如豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、脑磷脂等）自组装而成，也可以由二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇（DSPE-PEG）穿插于磷脂分子形成的磷脂层中形成。在另一实施例中，重组病毒载体可以包括慢病毒载体、腺病毒载体和逆转录病毒载体中的一种或多种，但不限于此。
本发明中，用于治疗与HDAC4活性或表达异常相关的疾病的药物中的靶向降解HDAC4的化合物可以通过分散或吸附在上述载体中而形成分散体系，也可以被上述脂质体、聚合物等包覆/包封起来，形成球状结构（例如纳米囊或微米囊）。
本发明实施方式中，辅料包括稀释剂和赋形剂中的至少一种。稀释剂的主要作用为填充片剂的重量或体积从而便于压片。在一些实施例中，稀释剂包括淀粉类、糖类、纤维素类和无机盐中的一种或多种。赋形剂是指在药物中的除了主要药物活性成以外的附加物。在一些实施例中，赋形剂包括如片剂中的黏合剂、填充剂、崩解剂、润滑剂，丸剂中的酒、醋、药汁等，半固体制剂软膏剂、霜剂中的基质部分，液体制剂中的防腐剂、抗氧剂、矫味剂、芳香剂、助溶剂、乳化剂、增溶剂、渗透压调节剂、着色剂等。
本发明实施方式中，用于治疗与HDAC4活性或表达异常相关的疾病的药物的形式包括片剂、胶囊、粉剂、颗粒剂、丸剂、糖浆剂、溶液剂或混悬剂。具体应用形式取决于实际情况。一些实施方式中，用于治疗与HDAC4活性或表达异常相关的疾病的药物可以通过口服或注射的方式施用。注射施用时，用于治疗与HDAC4活性或表达异常相关的疾病的药物的形式最好为溶液剂，例如溶解在水中或生理盐水中。在一实施例中，注射可以通过腹腔注射、皮下注射、肌肉注射或静脉注射的方式施用。在本发明实施方式中，用于治疗与HDAC4活性或表达异常相关的疾病的药物可以通过局部给药或全身给药。用于治疗与HDAC4活性或表达异常相关的疾病的药物的用量取决于多种因素，包括但不限于所需的生物学活性以及实施对象对药物耐受性，一实施方式中，用于治疗与HDAC4活性或表达异常相关的疾病的药物的用量可以为10毫克/公斤体重，每隔3天给药。
本发明实施例提供的用于治疗与HDAC4活性或表达异常相关的疾病的药物具有靶向降解HDAC4的化合物，能有效地降低细胞中HDAC4的蛋白水平，对HDAC4的抑制效果好。
本发明实施例还提供了上述任一实施方式中的靶向降解HDAC4的化合物或上述任一实施方式中的制备方法制得的靶向降解HDAC4的化合物在制备治疗与HDAC4活性或表达异常相关的疾病的药物中的应用。
本发明实施方式中，与HDAC4活性或表达异常相关的疾病包括肿瘤。一些实施方式中，肿瘤包括肺癌、鼻咽癌、胶质瘤、甲状腺癌、结直肠癌、头颈癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、肾癌、前列腺癌、睾丸癌、乳腺癌、宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌、皮肤癌（如黑素瘤）和淋巴癌中的至少一种。一实施例中，肿瘤包括肺癌。
本发明实施方式中，靶向降解HDAC4的化合物可作为单一活性成分或与其他药学上可接受的活性成分构成所述治疗与HDAC4活性或表达异常相关的疾病的药物。一实施例中，药物中的其他药学上可接受的活性成分包括他喹莫德。
本发明实施例所述的应用中，靶向降解HDAC4的化合物可应用于制备治疗与HDAC4去乙酰化活性相关的疾病的药物，也可应用于制备治疗与HDAC4苏木化（SUMO）活性相关的疾病的药物，还可应用于制备治疗与HDAC4表达异常相关的疾病的药物。靶向降解HDAC4的化合物能选择性地降解HDAC4，且具有较高的抑制活性，用于制备与HDAC4活性或表达异常相关的疾病的药物，尤其是抗肿瘤活性药物方面具有较高的药用价值。
下面通过具体示例对本发明技术方案的效果进一步说明。
实施例1
靶向降解HDAC4的式（I）所示的化合物（SCT-1）的制备
（1）式（Ⅱ-1）所示的化合物的合成
在式（Ⅶ-1）所示的化合物（9-溴壬酸，500.00 mg，2.108 mmol，1.0 eq）的甲醇（MeOH，5.00 mL）溶液中加入硫酸（H2SO4，3.00 g，16.864 mmol，8.0 eq），将反应液在80℃下搅拌16h。薄层色谱（TLC）显示反应完成。将反应混合物用饱和碳酸钠淬灭，在减压下浓缩。粗产物通过硅胶色谱（石油醚（PE）/乙酸乙酯（EA）=10:1）纯化，得到无色油状的式（Ⅱ-1）所示的化合物（9-溴壬酸甲酯，204.19 mg, 0.813 mmol），收率为56.7%。
式（Ⅱ-1）所示的化合物的结构表征数据如下：
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.67 (s, 3H), 3.40 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.31(t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.85 (m, 2H), 1.62 (m, 2H), 1.42 (m, 2H), 1.32 (s, 6H)。
（2）式（Ⅳ-1）所示的化合物的合成
在氩气保护条件下，将碳酸铯（Cs2CO3, 177.00 mg, 0.542 mmol, 2.0 eq）和式（Ⅱ-1）所示的化合物（9-溴壬酸甲酯，204.19 mg, 0.813 mmol, 3.0 eq）加入到式（Ⅲ）所示的化合物（110.00 mg, 0.271 mmol, 1.0 eq）的N,N-二甲基甲酰胺（DMF，5.00 mL）溶液中，在100°C下搅拌16h。如图1所示，液相色谱串联质谱（LC-MS）结果显示反应完成。反应混合物在减压下过滤浓缩。粗产物经C18反相柱，用0-95%的乙腈水溶液洗脱得到无色油状的式（Ⅳ-1）所示的化合物（100.00 mg, 0.173 mmol），收率为64.1%。
式（Ⅳ-1）所示的化合物的LC-MS图谱如图1所示，MS:m/z=577.4 (M+1, ESI+)。
式（Ⅳ-1）所示的化合物的核磁氢谱图如图4所示，结构表征数据如下：
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.02 (s, 1H), 7.70-7.42 (m, 4H), 7.06-6.89 (m, 1H), 6.80-6.67 (m, 1H), 4.15-3.36 (m, 20H), 2.34-2.71 (m, 2H), 1.89-1.74 (m, 2H), 1.59-1.24 (m, 10H)。
（3）式（Ⅴ）所示的化合物的合成
在式（Ⅳ-1）所示的化合物（100.00 mg, 0.173 mmol, 1.0 eq）的四氢呋喃水溶液（THF/H2O, 5.00 mL）溶液中加入氢氧化锂（LiOH, 21.85 mg, 0.520 mmol, 3.0 eq），在室温（Room Temperature，RT）下搅拌1h。如图2所示，液相色谱串联质谱（LC-MS）结果显示反应完成。反应混合物在减压下浓缩，得到黄色油状的式（Ⅴ）所示的化合物（100.00 mg）。
式（Ⅴ）所示的化合物的LC-MS图谱如图2所示，MS: m/z = 561.1 (M-1, ESI+)。
式（Ⅴ）所示的化合物的核磁氢谱图如图5所示，结构表征数据如下：
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.96 (s, 1H), δ 7.82-7.64 (m, 3H), 7.57-7.43 (m, 2H), 7.22-7.06 (m, 1H), 6.97-6.84 (m, 1H), 4.09-3.50 (m, 14H), 2.23-2.13 (m, 2H), 1.81-1.66 (m, 2H), 1.81-1.34 (m, 10H)。
（4）化合物SCT-1的合成
在式（Ⅴ）所示的化合物（100.00 mg, 0.177 mmol, 1.0 eq）和式（Ⅵ）所示的化合物（60.80 mg, 0.177 mmol, 1.0 eq）的N,N-二甲基甲酰胺（DMF, 5.00 mL）溶液中加入2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯（HATU, 80.71 mg, 0.212 mmol,1.2 eq）和N,N-二异丙基乙胺（DIEA, 68.49 mg, 0.531 mmol, 3.0 eq），然后在室温（RoomTemperature，RT）下搅拌1h。如图3所示，液相色谱串联质谱（LC-MS）结果显示反应完成。反应液通过高效液相色谱（HPLC）纯化，用0-95%的乙腈水溶液（含0.1%甲酸）洗脱，得到黄色固体的目标化合物SCT-1（40.00 mg，0.04 mmol），收率为25.4%，图7为SCT-1的HPLC图谱。
化合物SCT-1的LC-MS图谱如图3所示，MS: m/z = 887.45 (M+1, ESI+)。
化合物SCT-1的核磁氢谱图如图6所示，结构表征数据如下：
1H NMR (400 MHz, MeOD) δ 7.70 (dt,J= 15.2, 12.0 Hz, 1H), 7.53 (dt,J=12.9, 7.7 Hz, 5H), 7.35 (t,J= 2.2 Hz, 1H), 7.23 (m, 1H), 7.09 (d,J= 8.5 Hz,1H), 6.86 (d,J= 8.3 Hz, 1H), 5.07 (dd,J= 12.5, 5.4 Hz, 1H), 4.15 (dd,J= 14.3,6.1 Hz, 1H), 3.91 (d,J= 10.4 Hz, 3H), 3.76-3.72 (m, 4H), 3.58 (s, 3H), 3.50(dd,J= 9.5, 5.1 Hz, 3H), 3.46 (s, 3H), 2.78-2.70 (m, 4H), 2.46 (dd,J= 18.5,10.9 Hz, 2H), 2.10 -1.85 (m, 4H), 1.68-1.65 (m, 2H), 1.58-1.55 (m, 2H), 1.40(d,J= 12 Hz, 6H)。
化合物SCT-1分子的三维结构如图21所示，SCT-1的合成路线如下所示：
实施例2
靶向降解HDAC4的式（I）所示的化合物（SCT-1）的制备
（1）式（Ⅱ-1）所示的化合物的合成
在式（Ⅶ-1）所示的化合物（9-溴壬酸，500.00 mg，2.108 mmol，1.0 eq）的甲醇（MeOH，10.00 mL）溶液中加入硫酸（H2SO4，3.00 g，16.864 mmol，8.0 eq），将反应液在60℃下搅拌16h。薄层色谱（TLC）显示反应完成。将反应混合物用饱和碳酸钠淬灭，在减压下浓缩。粗产物通过硅胶色谱（石油醚（PE）/乙酸乙酯（EA）=10:1）纯化，得到无色油状的式（Ⅱ-1）所示的化合物（9-溴壬酸甲酯）。
（2）式（Ⅳ-1）所示的化合物的合成
在氩气保护条件下，将碳酸铯（Cs2CO3, 177.00 mg, 0.542 mmol, 2.0 eq）和式（Ⅱ-1）所示的化合物（9-溴酸壬甲酯，340.32 mg, 1.355 mmol, 5.0 eq）加入到式（Ⅲ）所示的化合物（110.00 mg, 0.271 mmol, 1.0 eq）的N,N-二甲基甲酰胺（DMF，5.00 mL）溶液中，在110°C下搅拌12h。反应混合物在减压下过滤浓缩。粗产物经C18反相柱，用0-95%的乙腈水溶液洗脱得到无色油状的式（Ⅳ-1）所示的化合物。
（3）式（Ⅴ）所示的化合物的合成
在式（Ⅳ-1）所示的化合物（200.00 mg, 0.346 mmol, 1.0 eq）的四氢呋喃水溶液（THF/H2O, 5.00 mL）溶液中加入氢氧化锂（LiOH, 43.7 mg, 1.04 mmol, 3.0 eq），在40℃下搅拌5h。反应混合物在减压下浓缩，得到黄色油状的式（Ⅴ）所示的化合物。
（4）化合物SCT-1的合成
在式（Ⅴ）所示的化合物（200.00 mg, 0.354 mmol, 2.0 eq）和式（Ⅵ）所示的化合物（60.80 mg, 0.177 mmol, 1.0 eq）的N,N-二甲基甲酰胺（DMF, 5.00 mL）溶液中加入2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯（HATU, 80.71 mg, 0.212 mmol,1.2 eq）和N,N-二异丙基乙胺（DIEA, 68.49 mg, 0.531 mmol, 3.0 eq），然后在室温下搅拌6h。反应液通过高效液相色谱（HPLC）纯化，用0-95%的乙腈水溶液（含0.1%甲酸）洗脱，得到黄色固体的目标化合物SCT-1。
将实施例1制得的化合物SCT-1进行以下测试：
（1）基于相分离的蛋白相互作用实验（SPPIER）
参考文献（DOI：10.1038/s41467-020-17997-6）中的SPPIER方法，使用denovo设计的卷曲螺旋作为同源寡聚标签（HO-Tag），采用增强型绿色荧光蛋白（EGFP）和红色荧光蛋白变种（mCherry）荧光标签作为报告基因。为了设计检测小分子诱导的CRBN和HDAC4之间的相互作用，将基于短螺旋的同源寡聚标签3（HOTag3，六聚体，30个氨基酸）与HDAC4基因融合；将另一种基于卷曲螺旋的同源寡聚标签6（HOTag6，四聚体，33个氨基酸）与CRBN基因融合。当小分子诱导HDAC4和CRBN相互作用时，每个六聚体HDAC4-mCherry-HOTag3招募六个CRBN-EGFP-HOTag6。然后每个四聚体CRBN-EGFP-HOTag6招募四个HDAC4-mCherry-HOTag3，依此类推。最终HO-Tag引入多价性以及HDAC4与CRBN的相互作用导致荧光相分离的发生，形成高荧光强度的黄色液滴。具体转染步骤如下：分别将1.0 μg HDAC4-mCherry-HOTag3和1.0 μgCRBN-EGFP-HOTag6，共转入HEK293T细胞24 h，平行两份，然后分别加入0μmol/L SCT-1（对照组）和5μmol/L SCT-1处理6h。将细胞用4%多聚甲醛固定15min，0.2%曲拉通100穿孔30min，DNA荧光染料Hoechst33342染核处理5min，抗荧光淬灭剂进行封片。再利用激光共聚焦显微镜进行免疫荧光分析，采用ImageJ软件进行共定位荧光强度分析。
结果如图8所示，SCT-1诱导HDAC4与CRBN形成复合物，即HDAC4与CRBN在SCT-1的作用下存在相互作用。
（2）SCT-1细胞毒性检测
将人正常肺上皮细胞BEAS-2B细胞以2000个细胞/孔的密度接种在96孔板中，分成三组：0μmol/L SCT-1（对照组）、1μmol/L SCT-1和2μmol/L SCT-1，孵育1、2、3、4和5天，每组三个重复；然后向每个孔中加入10 µl CCK8试剂，并在37°C下孵育1h。使用酶标仪，在450nm处测量每个孔的吸光度值（光密度），结果如图9所示，与对照组相比，孵育1-5天，浓度为1μmol/L和2μmol/L的SCT-1对BESA-2B细胞均无毒性。
（3）蛋白免疫印迹实验测定SCT-1对肿瘤细胞HDAC4蛋白的降解活性
1）SCT-1处理人大细胞肺癌细胞H460细胞：收集对数期H460细胞，调整细胞悬液浓度，6孔板每孔加入100μL细胞悬液，使待测细胞密度为50000-100000细胞/孔，补充完全培养基至2 ml，5% CO2，37℃培养细胞24h后，加入不同浓度的SCT-1处理48h：0μmol/L（对照组）、2.5μmol/L、5μmol/L、10μmol/L。
2）收集蛋白质样品：取生长状态良好的细胞，轻轻倒掉培养瓶中的培养基；加2ml预冷的磷酸盐缓冲溶液（PBS），洗2次，去掉死细胞；加入胰酶消化细胞；加入完全培养基终止消化，收集细胞悬液，离心收集细胞沉淀；（悬浮细胞直接离心收集细胞沉淀，不需要消化）PBS漂洗，离心，重复两遍，洗掉残余培养基，弃残余的PBS，只留细胞沉淀（可冻存于-80℃后一起提蛋白）；裂解取上一步收集的细胞沉淀，加入RIPA裂解液（RadioImmunoprecipitation Assay Lysis buffer，放射免疫沉淀法裂解缓冲液），裂解液需要提前加入蛋白酶抑制剂；冰上裂解30min；裂解完成之后收集样品，4℃，高速离心，12000rpm/20min；收集上清，转移至1.5mL EP管中，整个过程需在冰上进行；分装保存于-20℃或者-80℃中备用（贴壁细胞也可用PBS漂洗三遍后直接加入含蛋白酶抑制剂的适量RIPA于冰上裂解，而后用细胞刮刮下裂解细胞，收集上清）。
3）配制合适浓度的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）胶：分离胶的浓度为10%。
4）制备样品：根据实验要求制备蛋白样品，离心、混匀并上样于SDS-PAGE胶上样孔中。根据蛋白定量结果适量调整上样体积。
5）电泳：接通电源，蛋白样品在浓缩胶中电压为80伏特，待蛋白样品进入分离胶时，把电压调整为120伏特继续电泳。待溴酚蓝几乎完全跑出PAGE胶时终止电泳。
6）转膜：取出凝胶，并裁剪与SDS-PAGE凝胶相同大小的聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，滤纸应与纤维垫相同大小；PVDF膜用甲醇浸泡1min后，和滤纸一同浸泡于电转缓冲液中；按照黑色板-纤维垫-滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸-纤维垫-白色板依次放好，夹紧板后放入湿转电转槽内，黑色板的一面对黑色负极；在转膜槽中加满电转液，开始转膜。（转膜槽置于水中，并放入冰冻结块的冰袋，尽量多放几个冰袋，保证电转一直处于低温下进行。若转膜时间较长，中途温度升高，可更换冰袋）。
7）封闭：转膜结束后，取出PVDF膜，将膜浸没在含5%的脱脂奶粉的Tris缓冲盐水吐温-20（Tris-buffered saline tween-20, TBST）缓冲液里，室温下摇床振荡1h。
8）一抗孵育：封闭结束后，用TBST缓冲液荡洗3次，然后加入适度稀释比例的一抗，4℃过夜。将PVDF膜用TBST缓冲液荡洗3次，每次振荡10min。
9）二抗孵育：弃去TBST缓冲液，加入稀释的二抗，室温下摇床振荡1h。弃去二抗，将PVDF膜用TBST缓冲液荡洗3次，每次振荡10min。
10）曝光：将ECL显色底物均匀覆盖在PVDF膜上，曝光成像。
SCT-1对HDAC4蛋白的降解活性测试结果如图10所示，β-肌动蛋白（β-actin）作为内参，其在对照组和SCT-1处理的细胞中的蛋白量是恒定的，而HDAC4蛋白在SCT-1浓度为5μmol/L和10μmol/L的细胞中的蛋白量明显低于对照组，表明在H460细胞系中，SCT-1可以促进HDAC4蛋白的降解。
（4）CCK8法测定肿瘤细胞IC50
收集对数期H460细胞，调整细胞悬液浓度，96孔板每孔加入100μL，使待测细胞密度为1000-10000细胞/孔。5% CO2，37℃培养细胞24h后，加入不同浓度梯度的SCT-1处理48h，每个浓度三个重复。每孔加入10μL CCK-8溶液。如果起始的培养体积200μL，则需加入20μL CCK-8溶液，其它情况以此类推。在细胞培养箱内继续孵育1h。酶标仪于450nm测定每孔吸光度。
如图11所示，SCT-1表现出较好的抗肿瘤活性，IC50值为0.86 μmol/L。
（5）CCK-8法测定肿瘤细胞增殖情况
将H460细胞以2000个细胞/孔的密度接种在96孔板中，分成三组：0μmol/L SCT-1（对照组）、0.8μmol/L SCT-1和0.8μmol/L TasQ（他喹莫德，Tasquinimod），孵育1、2、3、4和5天，每组三个重复；然后向每个孔中加入10 µl CCK8试剂，并在37°C下孵育1h。使用酶标仪，在450nm处测量每个孔的吸光度值（光密度），结果如图12所示，SCT-1和TasQ均能够抑制肿瘤细胞增殖，其中SCT-1的抑制效果更显著。
（6）克隆形成实验观察SCT-1抑制肿瘤细胞增殖情况
将H460细胞以5×103个细胞/孔的密度接种在六孔培养板中，分成三组：0μmol/LSCT-1（对照组）、0.5μmol/L SCT-1和0.5μmol/L TasQ（他喹莫德，Tasquinimod）。每组包括三个孔，处理48h，然后更换为正常培养基。细胞在37℃下孵育15天，用PBS洗涤两次，用甲醇孵育15min，并用0.1％结晶紫染色60min。通过光学显微镜评估簇，每个包含≥50个细胞的簇被计为一个单克隆菌落。
如图13所示，SCT-1和TasQ均能够抑制单克隆菌落形成，其中SCT-1的抑制效果更显著。
（7）流式细胞术检测SCT-1对肿瘤细胞周期的影响
将H460细胞分成三组：0μmol/L SCT-1（对照组）、5μmol/L SCT-1和5μmol/L TasQ（他喹莫德，Tasquinimod），干预48h后，用胰酶消化细胞，然后以1000g的转速离心5min，弃上清，收集细胞。再用预冷的75%酒精重悬固定细胞，置于4℃过夜。以1000g的转速离心5min，去除75%的酒精，并用1ml 1×PBS清洗三次。加入200μL PBS和2μL RNA酶再加入2μL碘化丙碇（PI），37℃孵育30min。无须洗涤，充分混匀细胞，转移至5毫升流式管中。上机检测，低速上样，总共记录10000个细胞。数据的收集和分析。
如图14所示，图中G1指的是DNA合成前期，S指的是DNA合成期，G2/M指的是DNA合成后期和细胞分裂期，从图14中可知，SCT-1能够有效抑制肿瘤细胞的增殖，并使细胞周期阻滞在S期。
（8）小鼠移植瘤模型实验
1）样本前处理：准备足够量的人大细胞肺癌细胞（H460）在培养皿中扩大培养后准备接种。
2）样本接种：固定器固定小鼠，酒精棉球消毒，在小鼠腋下偏下部位注射0.2mL高活力肿瘤细胞悬液（3×106个/mL)。
3）分组：当肿瘤体积达到30mm3-50mm3时，将肿瘤均一性好的小鼠随机分组，分为对照组（含0.1%二甲基亚砜（DMSO））和药物干预组（TasQ组和SCT-1组），每组6只。小鼠每三天给药一次，剂量为10mg/kg，灌胃给药。
4）实验终点：i）药物干预后21天；ii）小鼠肿瘤体积>1500mm3；iii）小鼠肿瘤溃疡坏死；iv）小鼠减轻的体重超过正常动物体重的20%（应考虑到肿瘤所占分量）。最后剥取完成实验的小鼠的肿瘤并称重。
结果如图15所示，SCT-1和TasQ均能够抑制小鼠肿瘤的生长，其中SCT-1的抑制效果更好。
对比例1
式（VIII）所示的化合物SCT-2的制备：
（VIII）。
（1）式（Ⅹ）所示的化合物的合成
在氩气保护下，向式（Ⅲ）所示的化合物(110.00 mg, 0.271 mmol, 1.0 eq)的N,N-二甲基甲酰胺(DMF，5.00 mL)溶液中加入碳酸铯(Cs2CO3, 177.00 mg, 0.542 mmol, 2.0eq)和式（Ⅸ）所示的化合物(2-(2-(2-溴乙氧基)乙氧基)乙酸叔丁酯, 230 mg, 0.813mmol, 3.0 eq)，然后加热至100℃搅拌16h。如图16所示，液相色谱串联质谱（LC-MS）显示反应完成。过滤反应混合物并在减压下浓缩。粗产物通过C18反相柱纯化，用0-95%的乙腈和水溶液洗脱，得到无色油状的式（Ⅹ）所示的化合物（160.00mg，0.263mmol），收率为97.0%。
式（Ⅹ）所示的化合物的LC-MS图谱如图16所示，MS: m/z = 609.2 (M+1, ESI+)。
（2）式（XI）所示的化合物的合成
在式（Ⅹ）所示的化合物(160.00 mg, 0.263 mmol, 1.0 eq)的二氯甲烷溶液(DCM, 5.00 mL)中加入三乙胺(TFA, 1.48 g, 1.00 mL, 13.0 mmol)，并在室温下搅拌1h。如图17所示，液相色谱串联质谱（LC-MS）显示反应完成。反应混合物在减压下浓缩，得到黄色油状的式（XI）所示的化合物(200.00 mg)。
式（XI）所示的化合物的LC-MS图谱如图17所示，MS: m/z = 553.1 (M+1, ESI+)。
（3）化合物SCT-2的合成
在式（XI）所示的化合物（80.10 mg, 0.145 mmol, 1.0 eq）和2-(2,6-二氧哌啶-3-基)-5-(哌嗪-1-基)异吲哚-1,3-二酮(49.60 mg, 0.145 mmol, 1.0 eq)的N,N-二甲基甲酰胺(5.00 mL)溶液中加入2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯（HATU，66.20 mg, 0.174 mmol, 1.2 eq）和N,N-二异丙基乙胺（DIEA, 56.20 mg, 0.435mmol, 3.0 eq），然后在室温下搅拌1h。如图18所示，液相色谱串联质谱（LC-MS）结果显示反应完成。反应液通过高效液相色谱纯化，用0-95%的乙腈和水溶液（含0.1%甲酸）洗脱，得到黄色固体的目标化合物SCT-2（54.24mg，0.06mmol），收率为41.3%。
化合物SCT-2的LC-MS图谱如图18所示，MS: m/z = 877.80 (M+1, ESI+)。
化合物SCT-2的核磁氢谱图如图19所示，结构表征数据如下：
1H NMR (400 MHz, MeOD) δ 7.79 – 7.74 (m, 1H), 7.59 – 7.42 (m, 5H),7.06 – 6.99 (m, 3H), 6.75 (dd, J = 8.1, 5.6 Hz, 1H), 5.05 (dd, J = 12.7, 5.5Hz, 1H), 4.39 – 4.23 (m, 3H), 4.09 – 4.06 (m, 1H), 3.95 (s, 1H), 3.85 (d, J =1.8 Hz, 3H), 3.83 – 3.68 (m, 9H), 3.59 (s, 3H), 3.49 (d, J = 1.6 Hz, 3H),3.48 – 3.43 (m, 2H), 3.37 – 3.34 (m, 2H), 2.87 – 2.68 (m, 3H), 2.11 – 2.10(m, 1H)。
化合物SCT-2分子的三维结构如图22所示，SCT-2的合成路线如下所示：
将对比例1制得的化合物SCT-2进行蛋白免疫印迹实验，以测定其对肿瘤细胞HDAC4蛋白的降解活性，方法同实施例1一致。
SCT-2对HDAC4蛋白的降解活性测试结果如图20所示，在H460细胞系中，SCT-2对HDAC4蛋白无降解活性。SCT-2与SCT-1的区别仅在于采用的连接子不同，但二者对HDAC4蛋白的降解活性截然不同，说明PROTAC化合物设计技术不是将各部分结构简单叠加，在PROTAC的结构优化中，不仅需要协同优化各部分结构以确保三元复合物的稳定形成，还需要综合考量连接位点的合理性。本发明实施例提供的靶向降解HDAC4的化合物是稳定的PROTAC化合物，且具有优异的HDAC4蛋白降解活性。

Claims (10)

1.一种靶向降解HDAC4的化合物，其特征在于，所述靶向降解HDAC4的化合物为式（I）所示的化合物或其药学上可接受的盐，
（I）。
2.一种靶向降解HDAC4的化合物的制备方法，其特征在于，包括：
将式（V）所示的化合物、式（VI）所示的化合物和缩合剂混合形成缩合反应液，经缩合反应得到如权利要求1所述的靶向降解HDAC4的化合物，
（V），/>（VI）。
3.如权利要求2所述的靶向降解HDAC4的化合物的制备方法，其特征在于，所述式（V）所示的化合物的制备方法包括：
将式（VII）所示的化合物、醇和酸催化剂混合形成酯化反应液，经酯化反应得到式（II）所示的化合物，其中，X选自Br、Cl或I，Y选自甲基或乙基，
（VII），/>（II）；
将所述式（II）所示的化合物、式（III）所示的化合物和无机碱混合形成取代反应液，在惰性气氛下进行取代反应得到式（IV）所示的化合物，
（III），/>（Ⅳ）；
将所述式（IV）所示的化合物和碱催化剂混合形成水解反应液，经水解反应得到所述式（V）所示的化合物。
4.如权利要求3所述的靶向降解HDAC4的化合物的制备方法，其特征在于，所述酯化反应液中所述式（VII）所示的化合物与所述醇的摩尔比小于1:20；所述醇为甲醇和乙醇中的至少一种；所述酸催化剂为H2SO4、H3PO3和HCl中的至少一种；所述酯化反应的温度为40℃-80℃，所述酯化反应的时间为12h-20h；
所述取代反应液中所述式（II）所示的化合物和所述式（III）所示的化合物的摩尔比为（1-5）:1；所述无机碱为碳酸铯、碳酸钾和碳酸钠中的至少一种；所述取代反应的温度为80℃-120℃，所述取代反应的时间为10h-20h；
所述水解反应液中所述式（IV）所示的化合物的浓度为10mg/mL-100mg/mL；所述碱催化剂为氢氧化锂和氢氧化钠中的至少一种；所述水解反应的温度为0℃-50℃，所述水解反应的时间为0.5h-5h。
5.如权利要求2所述的靶向降解HDAC4的化合物的制备方法，其特征在于，所述缩合反应液中所述式（V）所示的化合物和所述式（VI）所示的化合物的摩尔比为（1-2）:1；所述缩合剂为2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯、N,N-二异丙基乙胺、丙基膦酸酐和N,N-碳酰二咪唑中的至少一种；所述缩合反应的温度为20℃-30℃，所述缩合反应的时间为1h-6h。
6.一种用于治疗与HDAC4活性或表达异常相关的疾病的药物，其特征在于，包括如权利要求1所述的靶向降解HDAC4的化合物。
7.如权利要求6所述的用于治疗与HDAC4活性或表达异常相关的疾病的药物，其特征在于，还包括药学上可接受的载体和辅料中的至少一种。
8.如权利要求1所述的靶向降解HDAC4的化合物在制备治疗与HDAC4活性或表达异常相关的疾病的药物中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述与HDAC4活性或表达异常相关的疾病为肺癌、鼻咽癌、胶质瘤、甲状腺癌、结直肠癌、头颈癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、肾癌、前列腺癌、睾丸癌、乳腺癌、宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌、皮肤癌和淋巴癌中的至少一种。
10.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述靶向降解HDAC4的化合物作为单一活性成分构成所述治疗与HDAC4活性或表达异常相关的疾病的药物。
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