CN117607447A - 筛选抗体的方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及一种筛选抗体的方法及其应用。所述方法包括以下三个步骤：提供源自第一抗体的抗体突变体文库；添加抗原和经标记的第二抗体，以标记所述抗体突变体文库；和，筛选与所述抗原结合亲和力提高的抗体突变体。通过本公开的方法，获得了与抗原结合水平提高的来源于第一抗体的突变体。获得的第一抗体的突变体能够与所述第二抗体进行改善的夹心双抗体检测。

Description

筛选抗体的方法及其应用
技术领域
本公开涉及生物技术领域，特别涉及一种筛选用于双抗体夹心检测的抗体的方法及其应用。
背景技术
抗体在临床诊断和临床治疗领域的应用越来越受到关注。传统的抗体制备技术是杂交瘤技术。之后出现了抗体的体外进化技术，这是抗体生产技术上的一次重大突破。抗体的体外进化是指从抗体基因出发，通过引入突变及多轮分选，最终获得具有更好性能的抗体。
体外免疫诊断中，“抗体-抗原-抗体”双抗夹心检测模式应用非常广泛，不仅用于ELISA中，也见于化学发光检测、免疫荧光层析和流式检测等。如果抗体A和抗体B都和抗原有高亲和力，并不能说明抗体A和抗体B可以配对检测抗原，“抗体A-抗原-抗体B”的作用特性不等于“抗体A-抗原”和“抗体B-抗原”作用特性的简单组合。
诊断抗体的研发中还有一个常见的瓶颈问题，许多抗体配对后检测重组抗原十分灵敏，但用于检测人体样本中的天然蛋白时，灵敏度会明显下降，有时甚至没有检测活性。造成这个现象的原因比较多，可能是基质原因，也可能是重组蛋白和天然蛋白翻译后修饰的差异造成。这是开发临床检测抗体中一个非常严重的问题，因为要分离纯化获得足够量的具有天然修饰抗原是非常困难的。
因此，需要一种抗体筛选系统，其能够针对天然蛋白抗原进行双抗体夹心检测的抗体优化。
发明内容
为了解决现有技术中存在的上述技术问题之一，本公开提供了一种筛选高亲和力抗体对的方法及其应用。
根据本公开的一个方面，提供了一种筛选具有高亲和力的抗体对的方法，所述方法包括以下步骤：1)提供源自第一抗体的抗体突变体文库；2)添加抗原和经标记的第二抗体，以标记所述第一抗体的抗体突变体文库；和，3)筛选与所述抗原结合亲和力提高的第一抗体的抗体突变体。
在一些实施方式中，所述抗体突变体文库可以是展示在噬菌体上或者展示在细胞表面上的。在一些实施方式中，所述细胞可以包括哺乳动物细胞、真核细胞、原核细胞或昆虫细胞。在一些实施方式中，所述细胞可以选自，但不限于，中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、幼年仓鼠肾细胞(BHK)、小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)、人类胚胎肾细胞(HEK293)、成年非洲绿猴肾细胞(Vero)、SV40转化的绿猴肾细胞(COS)、酵母细胞、大肠杆菌(E.coli)等。
在一些实施方式中，所述抗体突变体文库通过体细胞高频突变(SHM)获得。在这些实施方式中，所述抗体突变体文库通过以下步骤获得：在表达所述第一抗体的细胞中引入活化诱导的胞嘧啶脱氨酶(AID)，以诱导所述第一抗体的产生点突变，得到所述抗体突变体文库。
在一些实施方式中，所述第一抗体和所述第二抗体均能特异性结合所述抗原。在一些实施方式中，所述第一抗体和所述第二抗体能特异性结合所述抗原的不同表位。
在一些实施方式中，在步骤3)中，通过流式细胞术来筛选与所述抗原结合亲和力提高的抗体突变体。在一些实施方式中，在步骤3)中，通过流式细胞术，筛选与所述抗原的结合亲和力是所述第一抗体的至少1.1倍的抗体突变体。在一些实施方式中，在步骤3)中，通过流式细胞术，筛选与所述抗原的结合亲和力是所述第一抗体的至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少1.6倍、至少1.7倍、至少1.8倍、至少1.9倍或至少2.0倍的抗体突变体。
在一些实施方式中，在步骤3)中，通过流式细胞术，筛选与所述抗原的解离常数(KD)≤1μM、≤10.0nM、≤8.0nM、≤7.0nM、≤6.0nM、≤5.0nM、≤4.0nM、≤3.0nM、≤2.0nM、≤1.0nM、≤0.5nM、≤0.1nM、≤10.0pM或≤1.0pM的抗体突变体。
在一些实施方式中，所述抗原来源于或存在于天然样本中。在一些实施方式中，所述天然样本可以包括，但不限于，实体样本，例如组织样本、活检样本、穿刺样本；血液或血液的任何组分；体液，例如尿液、脑脊液、羊膜液、腹膜液等。在一些实施方式中，在步骤2)中，可以直接添加天然样本，例如血液、血浆等。
在一些实施方式中，所述第二抗体可以是经荧光基团标记的。在一些实施方式中，所述荧光基团可以是本领域常规使用的，例如，但不限于生物素、FITC、PE、TRITC、APC、Alexa Fluor 405、Alexa Fluor 430、AlexaFluor 488、AlexaFluor 532、AlexaFluor 546、Alexa Fluor 594、AlexaFluor 633、AlexaFluor 647、AlexaFluor660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700、Alexa Fluor 750、APC、APC/Alexa Fluor750、APC/Cy7、APC/eflour750、APC/FireTM750、PerCP/Cy5.5、PerCP、PerCP-eFlour 710、PE/Cy7、PE、PE/Cy5、PE/Dazzle 594、PE-CF594、Pacific Blue、Brilliant Violet 421、Brilliant Violet 510、Brilliant Violet 570、Brilliant Violet 605、BrilliantViolet 650、BrilliantViolet 711、BrilliantViolet 750、Brilliant Violet 785、Super Bright436、SuperBright 600、Super Bright 645、Super Bright 702、eFluor450、eFluor 506、eFluor 660、eFluor 710、eFluor 780、BD Horizon BB515、BD HorizonPE-CF594、BD Horizon BV421、BDHorizon BV480、BD Horizon BV510、BD Horizon BV605、BD Horizon BV650、BD HorizonBV711、BD Horizon BV786、BD Horizon BUV395、BDHorizon BUV496、BD Horizon BUV737、BD Horizon BUV805、BD HorizonAPC R700、Cy3、Cy5、Cy7等。
在一些实施方式中，每一个所述第二抗体标记有一个荧光基团。可以使用本领域熟知的方式对所述第二抗体进行标记，优选对每一个第二抗体标记一个荧光基团。
在一些实施方式中，所述方法可以包括重复步骤2)和3)，以进行两轮或更多轮的筛选，得到与所述抗原结合亲和力进一步提高的抗体突变体。
在一些实施方式中，筛选到的所述第一抗体的突变体和所述第二抗体可以用于双抗夹心检测，例如，但不限于，酶联免疫吸附试验(ELISA)、光学发光检测、流式细胞术等。在一些实施方式中，在双抗夹心检测中，筛选到的所述第一抗体的突变体作为捕获抗体，所述第二抗体用作检测抗体。
在具体的实施方式中，所述方法的步骤1)包括：将编码第一抗体的核酸序列整合到细胞的基因组中进行表达，以在所述细胞的表面上展示所述第一抗体；然后在所述细胞中引入AID，诱导所述抗体的编码核酸序列产生突变，得到源自第一抗体的抗体突变体文库。
在一些实施方式中，所述第一抗体和所述第二抗体可组合用于夹心法检测。在一些实施方式中，所述第一抗体可用作捕获抗体，且所述第二抗体可用作检测抗体。在一些实施方式中，所述第一抗体可用作检测抗体，且所述第二抗体可用作捕获抗体。
根据本公开的另一方面，提供了一种通过本公开的上述方法获得的具有高亲和力的抗体对。
通过本公开的上述方法获得的抗体突变体与所述抗原的结合亲和力得到了明显提高。而且这些抗体突变体能够与第二抗体进行效果改善的双抗夹心检测。
本公开构建了细胞抗体库，依次用含有天然抗原的血浆、荧光偶联的第二抗体(检测抗体)标记抗体库展示细胞，通过流式细胞仪分选(FACS)荧光信号高(即抗原结合水平高)的抗体突变体。通过本公开的方法，获得了与抗原结合水平提高的来源于第一抗体的突变体。获得的第一抗体的突变体能够与所述第二抗体进行改善的夹心双抗体检测。
附图说明
图1示出了根据本公开的双抗夹心流式的抗体体外进化流程的示意图。
图2示例性示出了根据本公开一个实施方式标记的抗体4C8-singlePE的HPLC检测结果。
图3示出了根据本公开一个实施方式对抗体7G3进行体外进化得到的细胞与抗原结合水平的流式检测结果。图3A示出了7G3-S0细胞及其经四轮进化获得的细胞与重组抗原sST2-His结合水平的流式检测结果。图3B示出了在不存在重组抗原sST2-His的情况下，7G3-S0细胞与四轮进化获得的细胞的流式检测结果。对照为无抗体展示的细胞。
图4示出了抗体7G3野生型(7G3-WT)及其根据本公开一个实施方式获得的突变体与重组抗原sST2-His结合水平的流式检测结果。
图5示出了根据本公开一个实施方式的抗体7G3野生型(7G3-WT)及其根据本公开一个实施方式获得的突变体与不同抗原样品的双抗夹心ELISA检测结果。
图6示出了根据本公开一个实施方式对抗体7G3进行双夹心抗体进化获得的细胞与抗原结合水平的流式检测结果。图6A示出了7G3-S0细胞及其经三轮进化获得的细胞与心衰病人的混合血浆Pool结合水平的流式检测结果。图6B示出了在不存在抗原的情况下，7G3-S0细胞与三轮进化获得的细胞的流式检测结果。对照为无抗体展示的细胞。
图7示出了抗体7G3野生型(7G3-WT)及其根据本公开一个实施方式获得的突变体与抗原结合水平的流式检测结果。图7A示出了7G3-WT及其突变体与心衰病人的混合血浆Pool结合水平的流式检测结果。图7B示出了在不存在抗原的情况下，7G3-WT及其突变体的流式检测结果。对照为无抗体展示的细胞。
图8示出了抗体7G3野生型(7G3-WT)及其根据本公开一个实施方式获得的突变体与不同抗原样品的双抗夹心ELISA检测结果。
图9示出了根据本公开一个实施方式的细胞7G3-S0与不同荧光标记的检测抗体4C8结合抗原水平的流式检测结果。
图10示出了根据本公开一个实施方式对抗体7G3进行双夹心抗体进化获得的细胞与抗原结合水平的流式检测结果。图10A示出了7G3-S0细胞及其经四轮进化获得的细胞与心衰病人的混合血浆Pool结合水平的流式检测结果。图10B示出了在不存在抗原的情况下，抗体7G3-S0细胞与四轮进化获得的细胞的流式检测结果。对照为无抗体展示的细胞。
图11示出了根据本公开一个实施方式对抗体4C8进行双夹心抗体进化获得的细胞与抗原结合水平的流式检测结果。图11A示出了4C8-S0细胞及其经四轮进化获得的细胞与心衰病人的混合血浆Pool结合水平的流式检测结果。图11B示出了在不存在抗原的情况下，4C8-S0细胞与四轮进化获得的细胞的流式检测结果。对照为无抗体展示的细胞。
图12示出了7G3 scFv野生型及其根据本公开一个实施方式获得的突变体与心衰病人的混合血浆Pool结合水平的流式检测结果。
图13示出了4C8 scFv野生型及其根据本公开一个实施方式获得的突变体与心衰病人的混合血浆Pool结合水平的流式检测结果。
图14示出了7G3野生型及其根据本公开一个实施方式获得的突变体作为捕获抗体对梯度稀释的重组抗原生物素-His-sST2的ELISA检测结果。
图15示出了4C8野生型及其根据本公开一个实施方式获得的突变体作为捕获抗体对梯度稀释的重组抗原生物素-His-sST2的ELISA检测结果。
图16示出了7G3野生型及其根据本公开一个实施方式获得的突变体对重组抗原His-sST2和心衰病人的混合血浆Pool分别进行双抗夹心ELISA的检测结果。
图17示出了4C8野生型及其根据本公开一个实施方式获得的突变体对重组抗原His-sST2和心衰病人的混合血浆Pool分别进行双抗夹心ELISA的检测结果。
图18示出了7G3野生型及其突变体7R40对梯度稀释的重组抗原His-sST2和心衰病人的混合血浆Pool分别进行双抗夹心ELISA的检测结果。
图19示出了4C8野生型及其突变体4H2对梯度稀释的重组抗原His-sST2和心衰病人的混合血浆Pool分别进行双抗夹心ELISA的检测结果。
图20示出了7G3野生型及其突变体与4C8野生型及其突变体的不同组合对心衰病人的混合血浆Pool进行双抗夹心ELISA的检测结果。
图21示出了7G3野生型及其突变体与4C8野生型及其突变体的不同组合对重组抗原His-sST2和心衰病人的混合血浆Pool分别进行双抗夹心ELISA的检测结果。
图22示出了7G3野生型及其突变体与4C8野生型及其突变体的不同组合对梯度稀释的重组抗原His-sST2和心衰病人的混合血浆Pool分别进行双抗夹心ELISA的检测结果。
具体实施方式
现有的哺乳动物细胞、细菌和酵母这三个展示系统的抗体筛选方式一方面没有考虑到抗体配对的因素，另一方面需要使用直接标记荧光的重组抗原或者使用带有标签的重组抗原，针对重组抗原优化获得的抗体可能仍然不能有效检测天然抗原，不能用于诊断。如果希望针对天然蛋白抗原进行抗体优化，需要从人体样本中提取、纯化大量抗原，这在大多数情况下是非常困难的或不可能的。
对此，本公开提出了“抗体-抗原-抗体”进化模式，使用这一模式进化抗体，不仅可以考虑到配对因素，而且抗原用量小(小到纳克甚至到皮克量级)、无需带标签也不用进行纯化。这样，使用临床样本，针对天然蛋白进行进化就成为了可能。
在具体的实施方式中，将待优化的第一抗体稳定整合到细胞基因组中并展示于细胞表面，然后用AID(激活诱导的胞嘧啶脱氨酶)表达质粒转染细胞，AID可介导突变细胞中的第一抗体基因，抗体突变随着细胞增殖而积累，由此构建了抗体突变体文库；依次用含有天然抗原的血浆、荧光偶联的检测抗体标记抗体库展示细胞，通过流式细胞仪分选(FACS)荧光信号高即抗原结合水平高的细胞即更好的抗体突变体。将分选的细胞扩增后，可再检测其与抗原的结合信号，若无明显增强，再继续转染AID突变抗体基因并分选好的突变体；最后将优化后的抗体基因克隆出来，测序、表达并鉴定突变体。图1示例性示出了本公开的一种筛选抗体的示意图。
为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步的详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于构成对本发明的任何限制。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本公开的概念。这样的结构和技术在许多出版物中也进行了描述。
定义
除非另有定义，否则本发明使用的所有技术术语和科技术语都具有如在本发明所属领域中通常使用的相同含义。出于解释本说明书的目的，将应用以下定义，并且在适当时，以单数形式使用的术语也将包括复数形式，反之亦然。
除非上下文另有明确说明，否则本文所用的表述“一种”和“一个”包括复数指代。例如，提及“一个细胞”包括多个这样的细胞及本领域技术人员可知晓的等同物等等。
本文所用的术语“约”表示其后的数值的±20％的范围。在一些实施方式中，术语“约”表示其后的数值的±10％的范围。在一些实施方式中，术语“约”表示其后的数值的±5％的范围。
活化诱导的胞嘧啶脱氨酶(activation-induced cytidine deaminase，AID)是在抗体产生过程中催化DNA中的脱氧胞嘧啶脱氨为脱氧尿嘧啶。正常情况下，DNA会准确修复，但在抗体形成时，对于出现的尿嘧啶，DNA常会采取碱基切除修复和错配修复等出错的处理方式。通过这些被称为体细胞高频突变(somatic hypermutation)和类别转换重组(CSR)的机制，增强抗体识别抗原的能力，并引起抗体的多样性。因此，AID在引起与抗体的多样性、亲和性的成熟有关的体细胞高频突变、抗体恒定区的类别发生变化的类别转换重组(classswitch recombination，CSR)和基因转换(GC)方面发挥重要的功能。AID通过在免疫球蛋白(Ig)可变区产生点突变和在Ig转换区(switch region)产生DNA双链断裂(DSB)来促进SHM和CSR。
在具体的实施方式中，表达所述抗体突变体文库的细胞是只含有单拷贝重组替换位点的CHO细胞系PuroR-14(CN104531623A)。
本文所用的术语“抗体”涵盖免疫球蛋白(无论是天然产生的还是部分或完全合成产生的)及其片段。所述术语还覆盖具有与免疫球蛋白结合结构域同源的结合结构域的任何蛋白质。“抗体”还包括多肽，所述多肽包含来自免疫球蛋白基因或其片段的特异性结合和识别抗原的互补决定区(CDR)。术语抗体的使用意在包括完全抗体、多克隆抗体、单克隆抗体和重组抗体、它们的片段，并且还包括单链抗体、人源化抗体、鼠抗体、嵌合单克隆抗体、小鼠-人单克隆抗体、小鼠-灵长类动物单克隆抗体、灵长类动物-人单克隆抗体、抗独特型抗体、抗体片段(诸如，例如scFv、(scFv)2、Fab、Fab'和F(ab')2、F(ab1)2、Fv、dAb和Fd片段)、双功能抗体和抗体相关多肽。抗体包括双特异性抗体和多特异性抗体，只要它们表现出所需的生物活性或功能即可。在具体的实施方式中，所述第一抗体展示在细胞表面。在具体的实施方式中，所述第一抗体是单链抗体(scFv)的形式。
本文所用的术语“抗体突变体”指抗体的氨基酸序列的变体，其中一个或多个氨基酸残基已被修饰。这些突变体与起始抗体的氨基酸序列同一性低于100％。在一些实施方式中，所述抗体突变体与起始抗体(例如第一抗体)的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。
两个抗体或其片段的氨基酸序列之间的“序列同一性百分比”或“同一性百分比”是指在考虑到了为了两个序列的最佳比对而必须引入的添加或缺失(即，空位)的情况下，比较窗口内序列所共有的相同匹配位置的数量。匹配位置是其中在靶序列和参考序列中都存在相同氨基酸的任何位置。由于空位不是氨基酸，所以靶序列中存在的空位不计在内。同样，由于计入靶序列氨基酸，而不计来自参考序列的氨基酸，所以不计参考序列中存在的空位。
可以通过以下过程来计算序列同一性百分比：确定其中两个序列中都出现相同氨基酸残基的位置数，以得到匹配位置数，将匹配位置数除以比较窗口中的位置总数，并将结果乘以100，得到序列同一性百分比。序列的比较和两个序列之间序列同一性百分比的确定可使用易用于在线使用和下载的软件来完成。合适的软件程序可从各种来源获得，用于蛋白质序列的比对。确定序列同一性百分比的一个合适的程序是bl2seq，其为可从美国政府的国家生物技术信息中心BLAST网站(blast.ncbi.nlm.nih.gov)上获得的BLAST程序套件的一部分。Bl2seq使用BLASTN或BLASTP算法进行两个序列之间的比较。BLASTP用于比较氨基酸序列。其它合适的程序是，例如，Needle、Stretcher、Water或Matcher、生物信息学程序的EMBOSS套件的一部分，并且也可在www.ebi.ac.uk/Tools/psa上从欧洲生物信息学研究所(EBI)获得。
本文所用的术语“亲和力”或“结合亲和力”是指抗体的单个结合位点与其抗原之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明，否则如本文所用，“结合亲和力”是指内在结合亲和力，其反映了结合对的成员(例如抗体和抗原)之间的1:1相互作用。抗体与抗原的亲和力通常可以用解离常数(KD)表示，解离常数(KD)是解离速率常数koff与结合kon速率常数的比率。因此，等效亲和力可以包括不同的速率常数，只要速率常数的比率保持相同即可。亲和力可以通过本领域已知的常规方法测量，包括本文所述的那些方法。可以使用本领域的常规方法来测量亲和力，例如表面等离子体共振(SPR)、Biacore或生物膜干涉技术(BLI)。
本文所用的术语“抗原”是指能够介导免疫应答的任何分子(例如蛋白质、肽、多糖、糖蛋白、糖脂、核酸、其部分或它们的组合)。示例性免疫应答包括抗体产生和免疫细胞诸如T细胞、B细胞或NK细胞的活化。在示例性实施方式中，所述抗原可以为存在于血液中的生长刺激表达基因2(ST2)蛋白。ST2存在两个主要亚型：跨膜型或细胞型(ST2L)和可溶性型或循环型(sST2)。ST2是白介素33(IL-33)的受体，IL-33被认为是一种核因子，通过结合心肌细胞膜表面受体ST2L，启动下游信号传导通路，保护心肌，改善心肌功能。
本文所用的术语“抗体”广义上是指并包括免疫球蛋白分子，具体包括单克隆抗体(包括鼠科动物单克隆抗体、人单克隆抗体、人源化单克隆抗体和嵌合单克隆抗体)，抗原结合片段，多特异性抗体(诸如双特异性抗体、三特异性抗体、四特异性抗体等)，二聚、四聚或多聚抗体，单链抗体、结构域抗体，以及包含具有所需特异性的抗原结合位点的免疫球蛋白分子的任何其他经修饰构型。“全长抗体”包含由二硫键互连的两条重链(HC)与两条轻链(LC)以及它们的多聚体(例如IgM)。每条重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(由结构域CH1、铰链、CH2和CH3构成)构成。每条轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)构成。VH区和VL区可进一步细分为超变区，该超变区称为互补决定区(CDR)并间插有框架区(FR)。各个VH和VL由三个CDR和四个FR片段构成，并按以下顺序从氨基端至羧基端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。免疫球蛋白可根据重链恒定结构域氨基酸序列被指定为五种主要种类，即IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。IgA和IgG进一步亚分类为同种型IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。基于其恒定域的氨基酸序列，可将任何脊椎物种的抗体轻链指定为两种完全不同的类型即κ和λ中的一种。
本文所用的术语“抗原结合片段”或″抗原结合结构域”是指蛋白质的结合抗原的部分。抗原结合片段可以是合成的、可酶促获得的或经遗传工程化的多肽，并且包括免疫球蛋白的结合抗原的部分，诸如VH、VL、VH和VL、Fab、Fab′、F(ab′)2、Fd和Fv片段，由一个VH结构域或一个VL结构域组成的结构域抗体(dAb)，驼峰化VH结构域，VHH结构域，由模拟抗体的CDR诸如FR3-CDR3-FR4部分、HCDR1、HCDR2和/或HCDR3以及LCDR1、LCDR2和/或LCDR3的氨基酸残基组成的最小识别单元，结合抗原的替代性支架，以及包含抗原结合片段的多特异性蛋白质。抗原结合片段(诸如VH和VL)可经由合成接头连接在一起以形成各种类型的单抗体设计，其中在VH和VL结构域由单独的单链表达的那些情况下，VH/VL结构域可在分子内或分子间配对，以形成单价抗原结合结构域，诸如单链Fv(scFv)或双价抗体。抗原结合片段也可以缀合至其它抗体、蛋白质、抗原结合片段或替代性支架缀合，所述支架可以是单特异性或多特异性的以工程化双特异性和多特异性蛋白质。在具体的实施方式中，所述第一抗体和/或所述第二抗体可以是单链抗体(scFv)。
在本公开下面的实施例中，以CN113846066A中的杂交瘤细胞7G3和4C8分泌获得的抗体7G3和4C8为例，示出了本公开的抗体筛选系统。本领域技术人员应理解，本公开的方法适用于任何抗体的体外进化，特别适用于双抗体夹心检测中的抗体组的体外进化。
在示例性的实施方式中，所述第一抗体和所述第二抗体是特异性结合ST2的抗体。在示例性的实施方式中，所述第一抗体可以是分别由CN113846066A中的杂交瘤细胞7G3和4C8分泌获得的抗体7G3和4C8。CN113846066A通过引用全文并入本文中。
在示例性的实施方式中，与从杂交瘤细胞7G3获得的单链抗体7G3相比，通过本公开的方法获得了与血浆样品中的天然抗原ST2亲和力得到提高的单链抗体7G3突变体(重链可变区为aa1～120，轻链可变区为aa136～242)，其可以在氨基酸序列的第30位、第56位、第100位和/或第209位发生突变。在示例性的实施方式中，所述单链抗体7G3突变体的氨基酸序列可以具有T30I、G56D、D100N和/或T209N的突变。在示例性的实施方式中，所述抗体7G3突变体还可以在氨基酸序列的第16位、第74位和/或第75位发生突变。在示例性的实施方式中，所述抗体7G3突变体的氨基酸序列可以具有A16T、K74N和/或S75A的突变。
在示例性的实施方式中，与从杂交瘤细胞4C8获得的单链抗体4C8相比，通过本公开的方法获得了与血浆样品中天然抗原ST2亲和力得到提高的单链抗体4C8突变体(在重链可变区为aa1～118，轻链可变区为aa134～246)，其可以在氨基酸序列的第110位发生突变。在示例性的实施方式中，所述抗体4C8突变体的氨基酸序列可以具有A110N的突变。在示例性的实施方式中，所述抗体4C8突变体还可以在氨基酸序列的第36位、第104位、第143位和/或第241位发生突变。在示例性的实施方式中，所述抗体4C8突变体的氨基酸序列可以具有W36R、Y104N、S143N和/或K241N的突变。
在示例性的实施方式中，与从杂交瘤细胞4C8获得的单链抗体4C8相比，通过本公开的方法获得了与ST2亲和力得到提高的抗体4C8突变体，其可以在氨基酸序列的第70位和/或第246位发生突变。在示例性的实施方式中，所述抗体4C8突变体的氨基酸序列可以具有S70N和/或R246W的突变。
下面提供实施例和附图以帮助理解本发明。但应理解，这些实施例和附图仅用于说明本发明，但不构成任何限制。本发明的实际保护范围在权利要求书中进行阐述。应理解，在不脱离本发明精神的情况下，可以进行任何修改和改变。
材料和方法
1.杂交瘤细胞7G3，4C8
杂交瘤细胞7G3，4C8见CN113846066A。
2.单链抗体的制备
使用Genomic DNA purification system(Promega)试剂盒分别提取杂交瘤细胞7G3和4C8的基因组DNA，以此为模板，使用本领域常规使用的引物簇扩增得到抗体7G3和4C8的重链可变区和轻链可变区的片段。按照CN104531623A中描述的方法，将单链抗体7G3和单链抗体4C8的编码序列，插入到瞬时转染质粒pCDNA3.1-Ab或稳定转染质粒pFAbL中，得到单链抗体7G3和单链抗体4C8的表达载体pCDNA3.1-Ab-7G3scFv、pCDNA3.1-Ab-4C8scFv、pFAbL-7G3scFv、pFAbL-4C8scFv。将表达载体pCDNA3.1-Ab-7G3scFv和pCDNA3.1-Ab-4C8scFv导入PuroR-14细胞中，分别获得瞬时表达抗体7G3 scFv的细胞和表达抗体4C8scFv的细胞。表达载体pFAbL-7G3scFv和pFAbL-4C8scFv分别导入PuroR-14细胞后，能获得稳定展示抗体7G3 scFv的细胞7G3-S0和稳定展示抗体4C8 scFv的细胞4C8-S0。
3.全长抗体的表达
分别基于pCDNA3.1-Ab-7G3scFv和pCDNA3.1-Ab-4C8scFv，使用下表1所示的引物对扩增得到7G3和4C8的重链可变区和轻链可变区片段，分别插入到重链表达载体pCNDA3.1-VH-mCH和轻链表达载体pCNDA3.1-VL-mCL(KONG B,CAO Y,WU D,et al.Affinitymaturation of an antibody for the UV-induced DNA lesions 6,4pyrimidine-pyrimidones[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2018,102(15):6409-24)中，通过共转染来表达全长抗体。
表1.7G3和4C8的重链可变区和轻链可变区的扩增引物
4.血浆样本
混合血浆Pool是心衰病人混合血浆Pool，采集于郑州大学第一附属医院的心衰病人。采用Presage ST2 kit(Critical Diagnostics,USA)测定了血浆中的sST2浓度。
5.抗体偶联PE荧光：
以为0.6mg抗体标记PE荧光为例，操作步骤如下：
(1)首先吸取2.1mg R-Phycoerythrin(PE)荧光染料(Agilent Technologies)，用脱盐柱HiTrap Desalting(cytiva)去除溶液里硫酸铵杂质；
(2)用微量天平秤取极少量活化剂SMCC(Thermo scientific)，用DMSO溶解SMCC成10mg/mL储液(现用现配)，取7.5μL SMCC溶液与上述已脱盐的PE溶液混合，25℃旋转孵育1小时，PE上的氨基与SMCC反应发生偶联，然后用填有葡聚糖Sephadex G-25(cytiva)重力柱去除多余活化剂，获得已活化的SMCC-PE；
(3)同时向0.6mg抗体中加入4μL的1M浓度的DTT溶液(凯基生物)在25℃孵育半小时以还原抗体重链之间的二硫键，不可旋转以尽量减少半胱氨酸再氧化，再用脱盐柱去除多余DTT；
(4)将活化好的SMCC-PE加入打开了二硫键的抗体内，25℃旋转孵育1小时；
(5)称取少量N-Ethylmaleimide(SIGMA)用DMSO溶解为10/mL后取3.4μL加入到上述SMCC-PE-IgG混合液以封闭抗体上未反应的游离巯基，室温旋转孵育20分钟；
(6)最后用分子筛层析柱Superdex 200Increase(cytiva)分离已偶联了PE荧光的抗体，即抗体-singlePE；
(7)关于保存：根据后续需求，将获得的PE荧光抗体浓缩到一定浓度并加入适量BSA以增加蛋白溶液稳定性，BSA终浓度为1％(w/v)，PE荧光抗体溶液在4℃避光保存，不可冻融。
图2示例性示出了抗体4C8-singlePE的HPLC检测结果。
6.双抗夹心流式的细胞标记方法：
在双抗夹心流式中，使用能同时结合在sST2蛋白不同抗原表位的一对抗体进行。以单链抗体7G3作为捕获抗体，全长抗体4C8-PE作为检测抗体，使用含天然抗原的血浆作为抗原为例，流式检测步骤如下。用胰酶(Gibco)消化展示单链抗体7G3-scFv抗体的细胞7G3-S0和PuroR-14(阴性对照)。收集细胞后，用PBS洗一次。先分别将细胞与经培养基Opti-MEM稀释的含有天然抗原的血浆于4℃孵育30分钟，清洗一次后，再将细胞与经Opti-MEM稀释的流式抗体Rb.anti-HAAPC(COLUMBIABIOSCIENCES)和荧光检测抗体4C8-PE于4℃孵育30分钟。使用不含血浆的培养基Opti-MEM作为对照。清洗两次后，重悬细胞并转移到流式管中待测。标记后的细胞样品分别在Aria III流式细胞仪上，检测APC荧光信号表示抗体展示水平，PE荧光信号表示抗体抗原结合水平。
7.抗体体外进化过程：
在此以展示单链抗体7G3的细胞(命名为“7G3-S0”)作为起始细胞为例，给出了抗体体外进化的步骤。
将7G3-S0细胞铺在6cm盘中，转染pCEP4-Neo-mAIDplus质粒(CN109402096A)。24小时后，培养基中加入1/mLG418抗生素(AMRESCO)，培养12天左右(细胞数大约1亿)。
通过双抗夹心流式细胞标记方法，分选亲和力高的抗体细胞约20000个，命名为7G3-S1。将分选得到的细胞置于不含G418抗生素的培养基中继续培养，进行第二轮富集分选，得到约2000个高亲和力高的抗体细胞，命名为7G3-S2。
进行第三轮富集分选时，为了避免耐药性，使用pCEP-BSD-mAID质粒(LUO R,ZHA OY,FAN Y,et al.High efficiency CHO cell display-based antibodymaturation.Scientific Reports,2020,10(1).)转染细胞7G3-S2，在细胞培养基中加入10μg/mL杀稻瘟菌素(Blasticidi n，gibco)。培养12天左右，再通过通过双抗夹心流式细胞标记方法分选亲和力高的抗体细胞约20000个，命名为7G3-S3。
将分选得到的细胞7G3-S3置于不含Blasticidin抗生素的培养基中继续培养，第四轮再富集分选2000个高亲和力高的抗体细胞，命名为7G3-S4。
实施例
实施例1：使用重组抗原对7G3抗体进行体外进化
本实施例以重组蛋白sST2-His为抗原，使用Anti-His FITC荧光抗体的方式标记抗体展示细胞。其中所述重组蛋白sST2-His是根据NCBI数据库上ST2序列(NM_003856.2)进行基因合成，于C端加上His标签序列构建为重组蛋白sST2-His，将其编码核酸序列克隆入pCDNA3.1表达载体中，得到sST2-His的表达载体pCDNA3.1-ST2-His。使用得到的表达载体pCDNA3.1-ST2-His，瞬时转染293F细胞中表达，7天后收集培养上清液，通过镍柱(生工生物)进行纯化，获得抗原蛋白sST2-His。
使用pFAbL-7G3scFv转染PuroR-14细胞，得到7G3 scFv展示细胞(7G3-S0)，使用单链4C8抗体作为检测抗体，对抗sST2的单链抗体7G3进化分选，共进行了4轮体外分选，分别得到细胞群7G3-S1、7G3-S2、7G3-S3和7G3-S4。
将上述每一轮细胞分选均进行流式检测，结果如图3A和图3B所示。经过4轮进化分选后，与抗原的结合水平约有6倍提高，从7G3-S0的约4.2％升高至7G3-S4的约25.0％。
在7G3-S4的抗体库中筛选得到与抗原结合水平较高的4个突变体M1、M2、M11、M15。对抗体完成了几轮进化分选后，提取细胞基因组DNA，以此为模板，用下表2所示引物对扩增得到单链抗体片段，插入到pCDNA3.1-Ab中，随机挑40～50个克隆进行测序，分析统计抗体基因突变及其频率。将7G3scFv及其突变体M1、M2、M11、M15抗体展示质粒转染CHO细胞。
表2.PCR克隆引物对的序列表
序列名称 5’-3’序列
Ab-SP-F TATATAAGCTTGCCACCATGACCCGGCTGAC(SEQ ID NO:9)
Ab-TM-R CTAACGTGGCTTCTTCTGCCAAAGC(SEQ ID NO:10)
将这些含有抗体突变体基因的质粒瞬时转染CHO细胞表达并展示相应的抗体。2天后，收集细胞，并以重组抗原蛋白sST2-His和荧光标签抗体anti-His FITC(Abcam)标记进行流式检测，然后比较突变体和7G3野生型抗体与重组抗原结合水平。结果示于图4中。由图4流式检测结果分析，用sST2-His和Anti-His FITC标记7G3抗体库筛选得到的4种突变体中，突变体M1、M2、M11的表达水平明显增加。与野生型7G3-WT与抗原结合水平相比，突变体M1、M2、M11与抗原结合水平分别提高了约1.24％、0.3％、1.37％。
然后，构建7G3-WT和突变体M1、M2、M11的全长抗体。简单来讲，分别利用表1所示的引物对，扩增7G3-WT及其突变体M1、M2、M11的抗体重链可变区VH和轻链可变区VL，并将扩增的片段克隆到重链表达载体pCNDA3.1-VH-mCH、轻链表达载体pCNDA3.1-VL-mCL中。将相应的重链和轻链表达载体共转染人293F悬浮细胞，收集细胞悬液，经Protein A预装重力柱(生工生物)纯化获得全长的抗体蛋白。
再分别以获得的7G3-WT及其突变体M1、M2、M11的全长抗体蛋白作为捕获抗体，以生物素标记的抗体4C8为检测抗体，对重组抗原蛋白His-sST2(2ng/mL)、稀释的心衰病人混合血浆样本和健康人血浆做了双抗夹心ELISA检测，结果示于图5中。从图5的结果发现，突变体M1、M2、M11在双抗夹心ELISA中对重组抗原蛋白His-sST2检测灵敏度略有提升，但对血浆样品的检测灵敏度反而明显下降。这说明使用重组抗原进行抗体进化获得的抗体并不适用于检测天然抗原，或者不适于与4C8抗体进行双抗夹心检测。
实施例2.采用双抗夹心流式对7G3抗体进行体外进化
本实施例采用单链抗体7G3作为捕获抗体，抗体4C8-PE作为检测抗体，使用天然抗原(3倍稀释的心衰病人混合血浆样本)以双抗夹心的方式，对抗体7G3进行了体外进化筛选。
以7G3-S0细胞作为起始细胞，按照图1的方式，与抗原、检测抗体4C8-PE(使用Abcam PE荧光标记试剂盒对4C8全长抗体标记了PE荧光)以双抗夹心标记的方式体外进化，分选了3轮，每轮分别获得的7G3-scFv抗体展示细胞群称为7G3-TryS1、7G3-TryS2和7G3-TryS3。使用流式细胞仪鉴定了每轮分选得到的细胞结合抗原的能力，流式结果如图6所示。
如图6A所示，7G3-scFv抗体野生型展示细胞7G3-S0结合抗原的比例很低(0.5％)，经三轮突变分选后，能与抗原结合的展示7G3-scFv抗体的细胞比例由0.5％提高到了67.4％。
但是，同时发现进化的抗体的非特异性结合增加。将每轮进化得到的细胞只标记抗HA标签的抗体(检测细胞的抗体展示水平)和检测抗体4C8-PE(检测细胞的抗原结合水平)。如图6B所示，横坐标方向为非特异抗原结合信号，随着抗体进化轮数的增加，在不加入抗原血浆的情况下，细胞的PE荧光信号也随之增强，说明这些细胞与荧光二抗的结合增强了，这样会干扰细胞上展示的7G3抗体与抗原结合信号的检测，从而影响抗体进化分选的效率。
实施例3.鉴定与抗原结合的能力增强了的抗体突变体
取实施例2获得的7G3-TryS3细胞群中的500万～1000万个的细胞，提取基因组DNA，利用引物对Ab-SP-F和Ab-TM-R，通过PCR克隆得到单链抗体编码基因，然后将单链抗体编码基因插入到真核表达质粒pCDNA3.1-Ab中，用于瞬时转染CHO细胞，用于对抗体编码基因进行测序。
随机挑选50个克隆测序，以野生型抗体的氨基酸序列为参考，比对测序结果分析抗体突变位点。分析有效测序的49个抗体序列，发现经过3轮进化分选仅获得3种含有不同氨基酸突变的抗体突变体，即突变体7M19、7M4、7M10。
将对应的质粒pCDNA3.1-Ab-7G3scFv、pCDNA3.1-Ab-7M19scFv、pCDNA3.1-Ab-7M4scFv和pCDNA3.1-Ab-7M10scFv分别瞬时转染CHO细胞并展示抗体，以用于后续流式检测。转染48小时后收集细胞，并孵育心衰病人混合血浆Pool和荧光抗体再通过流式检测，比较野生型抗体及其突变体结合抗原的水平。结果如图7所示。
图7A示出了，用心衰病人混合血浆Pool、荧光二抗4C8-PE及抗HA标签APC荧光抗体标记细胞后，相比于阴性对照，7G3野生型抗体及其突变体都有一定抗体展示率和抗原结合能力，野生型7G3-WT和抗原血浆孵育后在第二象限约有9.7％阳性率，突变体7M4的抗原结合水平较低(2.9％)表明该突变是不利于结合抗原的，另两个突变体7M10(15.8％)和7M19(17.4％)与抗原结合水平比野生型高，它们可能是与抗原结合能力增强了的突变体。
图7B示出了，只用荧光二抗4C8-PE及抗HA标签的APC荧光抗体标记细胞，可以看到相比于阴性对照，7G3野生型抗体及其突变体都有一定抗体展示率，且都无抗原结合信号。
上述流式检测结果表明突变体7M10、7M19可能与血浆中天然抗原sST2亲和力提高了。为了进一步测试突变体在双抗夹心ELISA检测中的表现，需要获得突变体抗体蛋白。
于是分别基于质粒pCDNA3.1-Ab-7M19scFv和pCDNA3.1-Ab-7M10scFv，利用表1所示引物对，将突变体7M10、7M19的抗体重链可变区VH、轻链可变区VL克隆到重链表达载体pCNDA3.1-VH-mCH、轻链表达载体pCNDA3.1-VL-mCL上，将轻、重链表达载体共同瞬时转染人293F细胞，7天后收集细胞上清并纯化，获得了全长形式的抗体突变体。
比较7G3抗体野生型及其突变体7M10、7M19在双抗夹心ELISA中对抗原检测的灵敏度。分别将上述全长抗体蛋白7G3-WT、7M10、7M19铺板作为捕获抗体，封闭后，均以生物素-4C8作为检测抗体，分别对重组抗原蛋白His-sST2(2ng/mL)、稀释的心衰病人混合血浆Pool和健康人血浆这3种抗原样品做了双抗夹心ELISA的检测，结果如图8所示。对于不同抗原样品，突变体7M10的表现不如野生型抗体7G3-WT；对于重组抗原蛋白，突变体7M19与野生型7G3-WT检测能力相近；对于心衰病人或健康人血浆，突变体7M19比野生型7G3-WT检测信号更高。
实施例4.改进的荧光检测抗体
实施例3中通过三轮进化和分选，获得的抗体突变种类和个数非常少，仅鉴定到一个对血浆样品检测信号稍有提高的突变体7M19。分析效率低的原因可能是因为流式检测的非特异抗原结合信号较多(即背景噪音较高)。从图6B也可以看到，经过三轮抗体突变和分选，非特异结合信号逐渐增多。
为了改善这一现象，用化学偶联的方法给4C8抗体标记了PE荧光，然后用分子筛层析柱Superdex 200Increase(cytiva)将只标记了一个PE荧光的4C8抗体分离出来，将其命名为4C8-SinglePE。4C8-singlePE的制备如材料与方法中关于抗体偶联PE荧光的描述。
分别以4C8-PE和4C8-singlePE为检测抗体，在存在或不存在心衰病人的混合血浆Pool的情况下，对抗体展示细胞7G3-S0进行流式检测，结果如图9所示。4C8-singlePE对细胞的非特异结合更少，对于已经结合了相同心衰病人的混合血浆Pool(6倍稀释)的细胞7G3-S0，标记4C8-singlePE的细胞抗原结合信号(56.6％)比用4C8-PE的(1.9％)高很多，说明4C8-singlePE标记细胞更高效且噪音低。在下面的双抗夹心流式检测实验中，使用4C8-singlePE作为荧光检测抗体来标记待测细胞。
实施例5.使用天然抗原对捕获抗体7G3进行体外进化
本实施例采用了实施例4制备的4C8-singlePE作为荧光检测抗体，以展示单链抗体7G3的细胞(命名为“7G3-S0”)作为起始细胞，对抗体7G3进行了体外进化。
用心衰病人混合血浆Pool、荧光二抗4C8-singlePE和抗HA标签的APC荧光抗体Rb.anti-HAAPC(COLUMBIABIOSCIENCES)，标记上述细胞，经过四轮双抗夹心流式抗体分选步骤，将每一轮分选的细胞进行流式检测，对抗体7G3进行了分选，结果如图10A和图10B所示。
在图10A和图10B中，对照是不展示抗体的细胞，7G3-S0是展示野生型抗体7G3scFv的初始细胞，Sort1、Sort2、Sort3、Sort4分别是第一、二、三、四轮分选的细胞。这些细胞都稳定保持着抗体展示能力，抗原结合水平提高的细胞逐渐富集，从S0的约4.2％提高到Sort4的约50.0％。
实施例6.使用天然抗原对检测抗体4C8进行体外进化
本实施例采用了实施例4制备的7G3-singlePE作为荧光检测抗体，以展示单链抗体4C8的细胞(命名为“4C8-S0”)作为起始细胞，对抗体4C8进行了体外进化。结果示于图11中。
在图11A和图11B中，对照是不展示抗体的细胞，4C8-S0是展示野生型抗体4C8scFv的初始细胞，Sort1、Sort2、Sort3和Sort4分别是每一轮分选的细胞。用心衰病人混合血浆样本、荧光标记抗体7G3-singlePE和抗HA标签的APC荧光抗体标记上述细胞，经过四轮抗体突变和分选，这些细胞都稳定保持着抗体展示能力，抗原结合水平提高的细胞逐渐富集，从S0的约2.2％提高到Sort4的约78.5％。
这些细胞只标记了荧光标记抗体7G3-singlePE和抗HA标签的APC荧光抗体，经过四轮抗体突变和分选，抗原非特异结合信号逐渐增多(从S0的0％到Sort4的约1.1％)，细胞的抗原荧光非特异结合略有增加。
实施例7.检测7G3和4C8进化的突变体
使用引物对Ab-SP-F和Ab-TM-R，扩增实施例5和实施例6中最后一轮分选得到的细胞7G3-Sort4和4C8-Sort4的单链抗体基因，然后构建到抗体展示质粒上，随机测序40个克隆，将测序结果的抗体序列与野生型比对，对突变种类和频率作了统计，表3和表4示出了几种突变体。
表3.7G3-Sort4获得的抗体7G3scFv突变
表4.4C8-Sort4获得的抗体4C8scFv突变
接着，分别检测了获得的7G3scFv突变体和4C8scFv突变体进行双抗夹心流式的效果。
将7G3scFv及其突变体7R1、7R22、7R40抗体展示质粒转染CHO细胞。2天后，收集细胞，并以血浆Pool和荧光检测抗体4C8-singlePE标记。通过流式细胞仪，检测了突变体和7G3野生型抗体与血浆中抗原结合水平。结果示于图12中。
3种突变体7R1、7R22、7R40的抗体展示水平明显提高，与抗原结合的总体水平(约16.0％、约17.8％、约18.2％)均比野生型(约6.7％)高。
将单链抗体形式的4C8及其突变体抗体展示质粒转染CHO细胞。2天后，收集细胞并以血浆Pool和荧光标记抗体7G3-PE标记。通过流式细胞仪，比较了突变体和4C8野生型抗体与血浆中抗原结合水平，结果示于图13中。
4C8的6种突变体的展示水平和抗原的结合总体水平(约7.3％～13.1％)均比野生型4C8-WT(约1.83％)高。
上面的结果也可以看出，通过改进的进化方法能够得到明显更多的与抗原结合水平较高的抗体突变体。
实施例8.测定亲和力
本实施例检测了7G3及其突变体与4C8及其突变体与重组抗原的亲和力。
利用表1所述的引物对，扩增出7G3及其突变体的抗体重链可变区VH、轻链可变区VL，并将其克隆到重链表达载体pCNDA3.1-VH-mCH和轻链表达载体pCNDA3.1-VL-mCL上，将轻、重链质粒共同瞬时转染人293F细胞，7天后收集细胞上清并纯化，获得了7G3及其突变体的全长抗体蛋白。
类似地，利用表1所述的引物对，扩增出4C8及其突变体的抗体重链可变区VH、轻链可变区VL克隆到重链表达载体pCNDA3.1-VH-mCH和轻链表达载体pCNDA3.1-VL-mCL上，将轻、重链质粒共同瞬时转染人293F细胞，7天后收集细胞上清并纯化，获得了4C8及其突变体的全长抗体蛋白。
使用生物分子相互作用仪Octet Red96测定抗体亲和力。实验过程中的缓冲液为含有0.2％BSA和0.02％Tween-20的PBS溶液，使用8个抗小鼠IgG Fc Biosensors生物检测芯片(Octet)，以浓度为30μg/mL的不同7G3/4C8抗体及其突变体作为固定相，以2倍浓度梯度稀释的重组抗原蛋白His-sST2为流动相来测定抗原抗体之间的动力学常数。实验流程为(1)基线120s；(2)上样180s；(3)基线120s；(4)结合180s；(5)解离300s。Kon和Koff由系统软件根据结合和解离曲线拟合得到，而反映抗体亲和力的KD值是通过Koff/Kon计算得出。结果示于表5和表6。
表5.7G3抗体及其突变体与重组抗原His-sST2的亲和力
表6.4C8抗体及其突变体与重组抗原蛋白His-sST2结合的动力学常数
使用间接ELISA比较了野生型抗体和优化后的突变体对重组抗原蛋白的结合。
将7G3抗体及其突变体铺板，与浓度梯度稀释的生物素化的重组抗原蛋白一起孵育，Biotin-His-sST2浓度分别为9ng/mL、3ng/mL、1ng/mL、0.3ng/mL和0ng/mL。然后由HRP酶标的链霉亲和素(Jackson)催化底物显色，将抗体对不同浓度抗原的检测结果作折线图。结果示于图14中。
将4C8抗体及其突变体铺板，与浓度梯度稀释的生物素化的重组抗原蛋白一起孵育，Biotin-His-sST2浓度为9ng/mL、3ng/mL、1ng/mL、0.3ng/mL、0。然后由HRP酶标的链霉亲和素(Jackson)催化底物显色，将抗体对不同浓度抗原的检测结果作折线图。结果示于图15中。
实施例9.使用双抗夹心ELISA定性比较野生型抗体和优化后的突变体。
比较7G3及其突变体对不同抗原的双抗夹心ELISA检测灵敏度。将7G3及其突变体分别作为捕获抗体铺板，分别孵育重组抗原蛋白His-sST2、心衰病人混合血浆Pool。均以生物素化的野生型4C8抗体(生物素-4C8)作为检测抗体，最后由HRP酶标的链霉亲和素催化底物显色。结果示于图16中，其中突变体7R40对血浆样品中sST2的检测灵敏度相对最高。
将野生型7G3抗体铺板，分别孵育重组抗原蛋白His-sST2(0.5ng/mL)、心衰病人混合血浆Pool(sST2约52ng/mL)，分别以生物素化的野生型4C8抗体及其突变体作为检测抗体，最后由HRP酶标的链霉亲和素催化底物显色。比较了4C8抗体及其突变体对不同样品的双抗夹心ELISA检测灵敏度。结果示于图17中，其中突变体4H2对血浆样品中sST2的检测灵敏度相对最高。
实施例10.梯度稀释样品的双抗夹心ELISA比较突变体和野生型
进一步比较7G3野生型及其突变体7R40对浓度梯度稀释的重组抗原His-sST2、心衰病人混合血浆Pool的双抗夹心ELISA检测结果。将7G3及其突变体7R40铺板作为捕获抗体，分别孵育浓度梯度稀释的重组抗原蛋白His-sST2、心衰病人-健康人的混合血浆Pool，均以野生型4C8抗体作为检测抗体。结果示于图18中。图18示出所有检测结果有良好的线性关系，表明上述抗体均可有效检测到不同样品中的目标抗原蛋白sST2，突变体7R40相比野生型7G3对血浆样品中sST2的检测灵敏度有明显提高。
进一步比较野生型4C8抗体与突变体4H2和对浓度梯度稀释的不同样品的双抗夹心ELISA检测结果。将野生型7G3抗体铺板作为捕获抗体，然后分别孵育浓度梯度稀释的重组抗原蛋白His-sST2、稀释的心衰病人混合血浆Pool，以生物素化的4C8抗体及其突变体4H2作为检测抗体，进行双抗夹心ELISA检测。结果示于图19中。所有检测结果有良好的线性关系，表明上述抗体均可有效检测到不同样品中的目标抗原蛋白sST2，突变体4H2相比野生型4C8对不同样品中sST2的检测灵敏度均有明显提高。
实施例11.突变体组合的双抗夹心ELISA性能
本实施例检测了突变体的组合是否能提高双抗夹心ELISA的检测灵敏度。7G3突变体和4C8突变体组合的双抗夹心ELISA检测灵敏度高。将7G3的3种突变体7R1、7R22、7R40分别作为捕获抗体铺板，孵育稀释的血浆，再分别以生物素化的抗体4C8的6种突变体4B2、4H2、4B5、4B9、4B11、4B20为检测抗体，进行双抗夹心ELISA检测。结果示于图20中。
进一步比较了突变体7R40-4H2和野生型组合检测灵敏度。分别将抗体7G3-WT及其突变体7R40作为捕获抗体铺板，孵育重组抗原蛋白His-sST2(0.5ng/mL)、心衰病人混合血浆Pool(sST2约6.5ng/mL)，分别以生物素化的4C8-WT及其突变体4H2为检测抗体，进行双抗夹心ELISA检测。结果示于图21中。
图中柱高为3次实验检测结果的平均值，误差线为标准差。突变体7R40与4H2的组合的检测灵敏度相对更高。
另外，还检测了突变体组合的双抗夹心ELISA检测梯度稀释的样品。将抗体7G3-WT及其突变体7R40作为捕获抗体铺板，孵育浓度梯度稀释的重组抗原蛋白His-sST2、稀释的心衰病人混合血浆Pool，分别以相应的生物素化的抗体4C8-WT及其突变体4H2为检测抗体，进行双抗夹心ELISA检测。结果示于图22中。突变体组合7R40-4H2比野生型组合7G3WT-4C8WT对血浆样品中天然抗原sST2的检测灵敏度显著提高。
对于血浆样品中天然sST2蛋白的检测，野生型抗体对7G3WT-4C8WT的sST2检测线性范围为3.0(～(23.6ng/mL(R2(>(0.99)，抗体对7R40--4H2的sST2检测线性范围为0.4(～(11.8ng/mL(R2(>(0.99)。当血浆中天然蛋白sST2浓度为3.0ng/mL时，7R40-4H2的OD值约为0.62，是7G3WT-4C8WT(0.07)的约8.9倍。
相比野生型7G3-4C8组合，突变体组合7R40-4H2的双抗夹心ELISA对不同样品的检测灵敏度均显著提高，所有检测结果有良好的线性关系，表明上述抗体均可有效检测到不同样品中的目标抗原蛋白sST2。
进一步地验证了野生型抗体对与突变的抗体对对血浆中抗原的检测。通过夹心ELISA结果(表7)，发现野生型抗体对7G3-4C8只能勉强检测到8倍稀释的健康人血浆中sST2信号，而突变体对7R40-4H2的双抗夹心ELISA可以检测到128倍稀释的健康人血浆中sST2信号，约提高15倍以上检测灵敏度。
表7.夹心ELISA法检测结果
本发明的技术方案不限于上述具体实施例的限制，凡是根据本发明的技术方案做出的技术变形，均落入本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种筛选具有高亲和力的抗体对的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1)提供源自第一抗体的抗体突变体文库；
2)添加抗原和经标记的第二抗体，以标记所述第一抗体的抗体突变体文库；和，
3)筛选与所述抗原结合亲和力提高的第一抗体的抗体突变体。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗体突变体文库是展示在噬菌体上或者展示在细胞表面上的，
优选地，所述细胞包括哺乳动物细胞、真核细胞、原核细胞或昆虫细胞，
更优选地，所述细胞选自中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、幼年仓鼠肾细胞(BHK)、小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)、人类胚胎肾细胞(HEK293)、成年非洲绿猴肾细胞(Vero)、SV40转化的绿猴肾细胞(COS)、酵母细胞、大肠杆菌(E.coli)。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗体突变体文库通过以下步骤获得：在表达所述第一抗体的细胞中引入活化诱导的胞嘧啶脱氨酶AID，以诱导所述第一抗体的产生点突变，得到所述抗体突变体文库。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一抗体和所述第二抗体均能特异性结合所述抗原，
优选地，所述第一抗体和所述第二抗体分别结合所述抗原的不同表位。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤3)中，通过流式细胞术来筛选与所述抗原结合亲和力提高的抗体突变体，
优选地，通过流式细胞术，筛选与所述抗原的结合亲和力是所述第一抗体的至少1.1倍的抗体突变体，或者
通过流式细胞术，筛选与所述抗原的解离常数(KD)≤1μM、≤10.0nM、≤8.0nM、≤7.0nM、≤6.0nM、≤5.0nM、≤4.0nM、≤3.0nM、≤2.0nM、≤1.0nM、≤0.5nM、≤0.1nM、≤10.0pM或≤1.0pM的抗体突变体。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗原来源于或存在于天然样本中，
优选地，所述天然样本包括实体样本，血液或血液的任何组分，或者体液样本。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二抗体是经荧光基团标记的，
优选地，所述荧光基团选自生物素、FITC、PE、TRITC、APC、Alexa Fluor 405、AlexaFluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor700、Alexa Fluor 750、APC、APC/Alexa Fluor750、APC/Cy7、APC/eflour 750、APC/FireTM750、PerCP/Cy5.5、PerCP、PerCP-eFlour 710、PE/Cy7、PE、PE/Cy5、PE/Dazzle 594、PE-CF594、Pacific Blue、Brilliant Violet 421、Brilliant Violet 510、BrilliantViolet 570、Brilliant Violet 605、BrilliantViolet 650、Brilliant Violet 711、BrilliantViolet 750、BrilliantViolet 785、Super Bright 436、Super Bright 600、Super Bright 645、Super Bright 702、eFluor450、eFluor 506、eFluor 660、eFluor 710、eFluor 780、BD Horizon BB515、BD HorizonPE-CF594、BD Horizon BV421、BD HorizonBV480、BD Horizon BV510、BD Horizon BV605、BD Horizon BV650、BD Horizon BV711、BDHorizon BV786、BD Horizon BUV395、BDHorizon BUV496、BD Horizon BUV737、BD HorizonBUV805、BD HorizonAPC R700、Cy3、Cy5或Cy7，
优选地，每一个所述第二抗体标记有一个荧光基团。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括重复步骤2)和3)，以进行两轮或更多轮的筛选，得到与所述抗原结合亲和力进一步提高的抗体突变体。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法的步骤1)包括：
将编码第一抗体的核酸序列整合到细胞的基因组中进行表达，以在所述细胞的表面上展示所述第一抗体；
在所述细胞中引入AID，诱导所述抗体的编码核酸序列产生突变，得到源自第一抗体的抗体突变体文库。
10.一种通过权利要求1至9中任一项所述的方法获得的具有高亲和力的抗体对。
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