CN117603228B - 一种近红外二区有机荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物化学材料技术领域，具体涉及一种近红外二区有机荧光探针及其制备方法和应用。本发明提供的荧光探针和有机包覆剂混合制备纳米成像试剂，具有良好的生物相容性和生物稳定性；本发明所述纳米成像试剂具有高的摩尔消光系数和量子产率，在白光激发下具有明亮的近红外二区荧光。进一步地，该纳米成像试剂能够在白光激发下实现血管的高分辨成像；此外，在成像过程中使用白光作为激发光源可以有效避免单波长激发光源造成的光子吸收有限、激光诱导生物损伤、辐照不均匀等问题，并且激光光源成本高，而白光光源更便宜易得；因此，本发明所述的纳米成像试剂可用于构建高性能生物成像造影剂，在非治疗目的且非检测目的的活体成像领域前景广阔。
Description
技术领域
本发明属于生物化学材料技术领域，具体涉及一种近红外二区有机荧光探针及其制备方法和应用。
背景技术
活体成像技术是指应用影像学方法，在不损伤动物的前提下，对活体状态下的生物过程进行组织、细胞和分子水平的定性和定量研究的技术。这项技术可以非侵入式、直观地观测活体动物体的各种生物学过程，以其高灵敏度、高时空分辨率和实时监测能力等特点受到广泛关注，对于生命科学、医学等领域意义重大。作为活体荧光成像技术的核心，高性能荧光成像试剂一直是科研人员研究的重点。近红外二区（NIR-II）有机荧光分子因其具有较深的组织穿透深度和较低的自发荧光干扰，成为了高性能荧光成像试剂的理想选择。然而，NIR-II有机荧光分子的吸收和发射波长较长，带隙较小，激发态能量易通过非辐射跃迁衰减，发光效率较低。因此，开发高发光效率的NIR-II有机纳米成像试剂具有重要意义。
另一方面，由于NIR-II有机荧光分子的吸收波长较长，量子产率低，摩尔消光系数有限，在使用NIR-II有机纳米成像试剂进行活体荧光成像时，需要使用昂贵的特定波长激光作为激发光源，但单波长激光的使用同时会带来光子吸收有限、激光诱导生物损伤等问题。此外，单波长激光不能提供均匀辐照，其提供的能量会从光斑中心向四周衰减，这也会影响活体成像的成像质量。相比之下，白光包含普通照明灯、手术无影灯和腹腔镜光源等，作为一种安全可见的激发光，具有较宽的连续光谱、廉价易得等特点，是活体荧光成像激发光源的理想选择，但在NIR-II荧光成像中应用白光作为激发光源还未被报道，这需要NIR-II有机纳米成像试剂具有高的量子产率和摩尔消光系数。因此，开发白光激发的高性能NIR-II有机纳米成像试剂是迫切需要的，但面临着较大的挑战。
发明内容
本发明的目的在于提供一种白光激发的A-D-A型近红外二区有机荧光探针的制备方法及其应用。本发明提供的荧光探针和有机包覆剂混合制备纳米成像试剂，具有良好的生物相容性和生物稳定性；同时具有高的摩尔消光系数和量子产率，在白光激发下具有明亮的近红外二区荧光，可用于构建高性能生物成像造影剂，在非治疗目的的活体成像、成像引导的手术等领域前景广阔。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供了一种近红外二区有机荧光探针，具有式I所示结构：
式I；
式I中，所述R1和R2独立的为C1~16支链或直链烷基；
所述R3为或/>，R3中的X为H和/或卤素。
优选的，R1和R2独立的为C1~11支链或直链烷基；
所述R3中的多个X为H、F、Cl和Br中的一种或多种。
优选的，具有式I-a，I-b或式I-c所示结构；
式I-a；
式I-b；
式I-c。
本发明提供了上述技术方案所述的近红外二区有机荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
将式II所示结构的化合物、式III所示结构的化合物、式IV所示结构化合物或式V所示结构化合物、有机碱催化剂和有机溶剂混合，进行脑文格反应，得到具有式I所示结构的近红外二区有机荧光探针；
式II；
式III；
式IV；/>式V。
优选的，所述式II所示结构的化合物、式III所示结构的化合物与式IV所示结构化合物或式V所示结构化合物的摩尔比为1：1：1；
所述有机碱催化剂为吡啶；所述式II所示结构的化合物与所述有机碱催化剂的摩尔比为1：3~10；
所述脑文格反应的温度为25~70 ℃，时间为8~24 h。
本发明提供了一种荧光探针包覆型纳米颗粒，包括上述技术方案所述的近红外二区有机荧光探针或上述技术方案所述的制备方法制备得到的近红外二区有机荧光探针，以及包覆在所述近红外二区有机荧光探针表面的有机包覆剂。
本发明提供了上述技术方案所述的荧光探针包覆型纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
将上述技术方案所述的近红外二区有机荧光探针或上述技术方案所述的制备方法制备得到的近红外二区有机荧光探针、有机包覆剂和有机溶剂混合，得到混合液；
将所述混合液与水混合，进行超声共沉淀，得到荧光探针包覆型纳米颗粒。
本发明提供了上述技术方案所述的近红外二区有机荧光探针或上述技术方案所述的制备方法制备得到的近红外二区有机荧光探针或上述技术方案所述的荧光探针包覆型纳米颗粒或上述技术方案所述的制备方法制备得到的荧光探针包覆型纳米颗粒在制备生物成像造影剂中的应用。
本发明提供了上述技术方案所述的近红外二区有机荧光探针或上述技术方案所述的制备方法制备得到的近红外二区有机荧光探针或上述技术方案所述的荧光探针包覆型纳米颗粒或上述技术方案所述的制备方法制备得到的荧光探针包覆型纳米颗粒在非治疗目的且非诊断目的的荧光成像中的应用。
本发明提供了一种近红外二区有机荧光探针，具有式I所示结构。本发明提供的荧光探针具有A-D-A（受体-给体-受体结构）型大π共轭平面结构，本发明提供的荧光探针和有机包覆剂混合制备纳米颗粒应用于成像试剂，具有良好的生物相容性和生物稳定性；本发明提供的荧光探针以及纳米颗粒作为纳米成像试剂具有高的摩尔消光系数和量子产率，在白光激发下具有明亮的近红外二区荧光。进一步地，本发明提供的荧光探针能够实现白光激发下血管的高分辨成像；此外，在成像过程中使用白光作为激发光源可以有效避免单波长激发光源造成的光子吸收有限、激光诱导生物损伤、辐照不均匀等问题；因此，本发明提供的式I所示结构的荧光探针作为纳米成像试剂可用于构建高性能生物成像造影剂，在非治疗目的的活体成像、成像引导的手术等领域前景广阔。
由实施例的结果表明：本发明提供的式I所示结构的荧光探针分子为受体-给体-受体结构，可以有效延长吸收和发射甚至近红外窗口，同时具有高摩尔消光系数和宽吸收带的特点，大大提高了荧光探针的白光吸收能力。本发明所述的纳米成像试剂在白光激发下发出明亮的近红外二区荧光，其发射波长可延伸至1400 nm，能够有效避免自吸收，降低背景干扰。
本发明提供了上述技术方案所述的近红外二区有机荧光探针的制备方法。本发明提供的制备方法合成简单，只需要通过一步无金属催化的脑文格反应获得，易于操作，适合工业化生产。
附图说明
图1纳米成像试剂HY6CT-NPs，FY6CT-NPs和CY6CT-NPs的粒径图以及纳米成像试剂HY6CT-NPs的透射电镜图，其中，图1中的A为纳米成像试剂HY6CT-NPs的透射电镜图；图1中B、C和D分别为纳米成像试剂HY6CT-NPs，FY6CT-NPs和CY6CT-NPs的粒径图；
图2为纳米成像试剂HY6CT-NPs，FY6CT-NPs和CY6CT-NPs在水溶液中的吸收光谱；
图3为纳米成像试剂HY6CT-NPs，FY6CT-NPs和CY6CT-NPs水溶液在白光激发下的发射光谱；
图4为纳米成像试剂HY6CT-NPs，FY6CT-NPs和CY6CT-NPs以商业染料IR26为参比时的相对量子产率测试结果；
图5为同一浓度HY6CT-NPs，FY6CT-NPs，CY6CT-NPs和ICG水溶液在白光激发下的NIR-II成像图片；
图6为纳米成像试剂FY6CT-NPs在不同滤光片条件下对正常小鼠腹部血管的NIR-II荧光成像图以及不同滤光片条件下的分辨率分析图；其中图6中的A为纳米成像试剂Y6CT-NPs在不同滤光片条件下对正常小鼠腹部血管的NIR-II荧光成像图；图6中的B、C和D为不同滤光片条件下的分辨率分析图。
具体实施方式
本发明提供了一种近红外二区有机荧光探针，具有式I所示结构：
式I；
式I中，所述R1和R2独立的为C1~16支链或直链烷基；
所述R3为或/>，R3中的X为H和/或卤素。
在本发明中，R1优选为C1~11支链或直链烷基，更优选为C3~11支链或直链烷基，进一步优选为C5~11支链或直链烷基。
在本发明的具体实施例中，R1优选为C11H23直链烷基。
在本发明中，R2优选为C1~11支链或直链烷基，更优选为C3~11支链或直链烷基，进一步优选为C5~8支链或直链烷基。
在本发明的具体实施例中，R2优选为。
在本发明中，所述R3优选为。
在本发明中，所述R3中的X优选为H、F、Cl和Br中的一种或多种，更优选为H、F和Cl中的一种或多种。
在本发明的具体实施例中，所述R3中的X优选为H，或者为H和F，或者为H和Cl。
在本发明中，式I所示结构的近红外二区有机荧光探针优选具有式I-a，I-b或式I-c所示结构；
式I-a；
式I-b；
式I-c；
式I-a，I-b或式I-c中的R1为C11H23的直链烷基。
本发明提供了上述技术方案所述的近红外二区有机荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
将式II所示结构的化合物、式III所示结构的化合物、式IV所示结构化合物或式V所示结构化合物、有机碱催化剂和有机溶剂混合，进行脑文格反应，得到具有式I所示结构的近红外二区有机荧光探针；
式II；
式III；
式IV；/>式V。
在本发明中，若无特殊说明，所有制备原料/组分均为本领域技术人员熟知的市售产品。
在本发明中，式IV所示结构化合物具体优选为式IV-a所示结构的双氰基茚酮类化合物、式IV-b所示结构的双氰基茚酮类化合物或IV-c所示结构的双氰基茚酮类化合物；
式IV-a；/>式IV-b；/>式IV-c。
在本发明，所述式II所示结构的化合物、式III所示结构的化合物与式IV所示结构化合物或式V所示结构化合物的摩尔比优选为1：1：1。
在本发明中，所述有机碱催化剂优选为吡啶。所述式II所示结构的化合物与所述有机碱催化剂的摩尔比优选为1：3~10，更优选的为1：5。
在本发明中，所述有机溶剂优选为三氯甲烷。本发明对所述有机溶剂的用量没有特殊限定，能够使反应顺利进行即可。本发明对所述混合的具体实施方式没有特殊要求。
在本发明中，所述脑文格反应的温度优选为25~70 ℃，更优选为40~60 ℃。在本发明中，所述脑文格反应的时间优选为8~24 h，更优选为12~24 h。
在本发明中，所述脑文格反应优选在保护气体氛围下进行，所述保护气体氛围优选为氮气或氩气。本发明优选使用TLC板(即薄层色谱点板)对反应进行监控。
所述脑文格反应后，本发明优选对所得脑文格反应液进行后处理，所述后处理优选包括以下步骤：
对所述脑文格反应液进行萃取和浓缩，得到浓缩液。
对所述浓缩液进行柱层析分离和重结晶，得到具有式I所示结构的近红外二区有机荧光探针的纯品。
在本发明中，所述萃取优选包括如下步骤：待反应体系冷却至室温后，将水加入到反应液中，用二氯甲烷对水相进行多次萃取。本发明对所述萃取得到的有机相进行浓缩。本发明对所述浓缩的方式没有特殊的要求，使用本领域技术人员熟知的浓缩方式即可。
在本发明中，所述柱层析分离的洗脱剂优选为二氯甲烷和石油醚的混合液，其中二氯甲烷和石油醚的体积比优选为2:1。柱层析完成后，本发明优选将柱层析产物中的溶剂去除。本发明对所述溶剂去除的方式没有特殊限定，采用常规的去除溶剂的方式即可，如旋蒸。
在本发明中，所述的重结晶的溶剂优选为二氯甲烷和正己烷。所述二氯甲烷和正己烷的体积比优选为1：3~6。所述重结晶的具体实施方式优选包括：将所述柱层析分离的粗产物溶解在二氯甲烷中，并在超声条件下缓慢的加入正己烷，目标产物析出后抽滤，得到的固体即为目标产物。
本发明提供了一种荧光探针包覆型纳米颗粒，包括上述技术方案所述的近红外二区有机荧光探针或上述技术方案所述的制备方法制备得到的近红外二区有机荧光探针，以及包覆在所述近红外二区有机荧光探针表面的有机包覆剂。
在本发明中，所述有机包覆剂优选为甲氧基聚乙二醇胺、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺、二硬酯酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-叶酸、二硬酯酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-巯基、二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-聚乙二醇-羧酸、二硬酯酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-叠氮、二硬酯酰乙醇胺-聚乙二醇-生物素、1-棕榈酰基-2-油酰基乙醇胺、1-硬脂酰基-2-油酰基卵磷脂、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、聚苯乙烯-g-聚乙二醇、甲氧基PEG聚乳酸-羟基乙酸共聚物和泊洛沙姆F127中的一种或多种。
在本发明中，所述荧光探针包覆型纳米颗粒的粒径优选为50~200 nm，更优选为100~200 nm。
本发明提供了一种荧光探针包覆型纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
将上述技术方案所述的近红外二区有机荧光探针或上述技术方案所述的制备方法制备得到的近红外二区有机荧光探针、有机包覆剂和有机溶剂混合，得到混合液；
将所述混合液与水混合，进行超声共沉淀，得到荧光探针包覆型纳米颗粒。
本发明将上述技术方案所述的近红外二区有机荧光探针或上述技术方案所述的制备方法制备得到的近红外二区有机荧光探针、有机包覆剂和有机溶剂混合，得到混合液。在本发明中，所述荧光探针和有机包覆剂的质量比优选为1：3~8，更优选为1：5~6。所述有机溶剂为四氢呋喃。本发明对所述有机溶剂的用量没有特殊要求。
得到混合液后，本发明将所述混合液与水混合，进行超声共沉淀，得到荧光探针包覆型纳米颗粒。在本发明中，所述超声共沉淀的功率优选为100~200 W，更优选为150 W，时间优选为3~10 min，更优选为5 min。
在本发明中，所述超声共沉淀后直接得到组装料液，本发明优选还包括：将所述组装料液装入透析袋中进行透析，得到纯化组装物料；将所述纯化组装物料浓缩后，得到所述纳米成像试剂的溶液。在本发明中，所述透析袋的截留分子量优选为3500；所述透析的时间优选为48~72h。在本发明中，所述浓缩优选采用聚乙二醇进行吸水浓缩，所述聚乙二醇的平均分子量优选为100000。所述浓缩得到浓缩液，本发明优选采用针筒式过滤器对浓缩液过滤杂质，得到所述纳米成像试剂的溶液。
本发明将荧光探针制备成包覆型纳米颗粒，有利于在白光激发下对非治疗目且非诊断目的的血管进行成像。
本发明提供了上述技术方案所述的近红外二区有机荧光探针或上述技术方案所述的制备方法制备得到的近红外二区有机荧光探针或上述技术方案所述的制备方法制备得到的荧光探针包覆型纳米颗粒在制备生物成像造影剂中的应用。
在本发明中，所述生物成像造影剂优选为监测肝缺血再灌注过程中的血管成像的生物成像造影剂，或者用于监测肾移植过程中的血管成像的生物成像造影剂，或者用于荧光成像引导的手术中的血管成像生物成像造影剂。
本发明提供了上述技术方案所述的近红外二区有机荧光探针或上述技术方案所述的制备方法制备得到的近红外二区有机荧光探针或上述技术方案所述的制备方法制备得到的荧光探针包覆型纳米颗粒在非治疗目的且诊断目的的荧光成像中的应用。
在本发明中，所述非诊断目的且非治疗目的的荧光成像优选为血管荧光成像。
在本发明中，所述非诊断目的且非治疗目的的荧光成像优选为活体成像。
在本发明的具体实施例中，所述荧光成像中的应用优选包括监测肝缺血再灌注过程中的血管荧光成像，或者监测肾移植过程中的血管荧光成像，或者荧光成像引导的手术中的血管荧光成像。
在本发明中，所述血管成像的设备为近红外二区活体成像仪；所述白光激发光源为近红外二区活体成像仪照明灯，波长范围为400-800 nm。
在本发明中，所述血管荧光成像时注射到小鼠体内的纳米成像试剂的有效浓度不低于500 µmol L-1，体积不低于100 µL。
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
按照以下反应流程制备：
；
将TPB-CHO (103 mg, 0.1 mmol)、CPT30 (20 mg, 0.1 mmol) 和HIC (20 mg,0.1 mmol) 溶解在10 mL三氯甲烷中。将吡啶 (40 mg，0.5 mmol) 滴加到溶液中，混合物在50℃下反应12 h。将溶液冷却至室温后，真空蒸发溶剂，将残余物溶解在二氯甲烷(30 mL)中并用水(30 mL)萃取。将有机相合并后用无水Na2SO4干燥，并通过硅胶柱色谱法使用石油醚/二氯甲烷2: 1作为洗脱剂进行纯化。粗产物用二氯甲烷溶解，在超声条件下缓慢加入正己烷重结晶，固体析出后抽滤，得到棕黑色粉末HY6CT (产率：78 mg，55%)。
1H NMR (600 MHz, Chloroform-d) δ 9.11 (s, 1H), 9.00 (s, 1H), 8.66 (d,J = 7.0 Hz, 1H), 8.33 (s, 1H), 7.98 – 7.96 (m, 2H), 7.78 – 7.74 (m, 2H), 4.80(t, J = 8.7 Hz, 4H), 3.35 – 3.10 (m, 4H), 2.21 – 2.17 (m, 2H), 1.87 – 1.84(m, 4H), 1.51 – 1.47 (m, 4H), 1.38 – 0.96 (m, 44H), 0.86 – 0.80 (m, 12H),0.71 – 0.65 (m, 6H).
13C NMR (151 MHz, Chloroform-d) δ 188.53, 181.68, 156.66, 153.23,153.01, 147.32, 145.03, 144.93, 142.60, 142.34, 140.04, 137.84, 136.89,136.17, 135.29, 135.04, 134.28, 133.60, 133.32, 133.25, 127.32, 126.98,125.18, 123.63, 120.86, 115.35, 113.63, 113.50, 68.28, 55.67, 40.38, 40.32,31.91, 31.14, 29.82, 29.64, 29.62, 29.52, 29.50, 29.33, 27.63, 27.55, 23.29,22.89, 22.84, 22.67, 14.10, 13.75, 13.71, 10.38, 10.34.
实施例2
按照以下反应流程制备：
；
将TPB-CHO (103 mg, 0.1 mmol)、CPT30 (20 mg, 0.1 mmol) 和FIC (23 mg,0.1 mmol) 溶解在10 mL三氯甲烷中。将吡啶 (40 mg，0.5 mmol) 滴加到溶液中，混合物在50℃ 下反应12 h。将溶液冷却至室温后，真空蒸发溶剂，将残余物溶解在二氯甲烷(30 mL)中并用水(30 mL)萃取。将有机相合并后用无水Na2SO4干燥，并通过硅胶柱色谱法使用石油醚/二氯甲烷2: 1作为洗脱剂进行纯化。粗产物用二氯甲烷溶解，在超声条件下缓慢加入正己烷重结晶，固体析出后抽滤，得到棕黑色粉末FY6CT (产率：82 mg，58％)。
1H NMR (600 MHz, Chloroform-d) δ 9.16 (s, 1H), 9.09 (s, 1H), 8.57 (s,1H), 8.40 (s, 1H), 7.97 (s, 1H), 7.71 (t, J = 7.2, 1H), 4.79 – 4.75 (m, 4H),3.24 – 3.20 (m, 4H), 2.17 – 2.09 (m, 2H), 1.88 – 1.84 (m, 4H), 1.52 – 1.48(m, 4H), 1.37 – 0.96 (m, 44H), 0.87 – 0.74 (m, 12H), 0.67 – 0.64 (m, 6H).
13C NMR (151 MHz, Chloroform-d) δ 186.09, 181.60, 158.48, 153.84,153.09, 147.24, 145.12, 138.00, 137.78, 136.05, 136.01, 135.74, 133.34,133.28, 133.16, 130.33, 129.79, 127.02, 125.29, 119.72, 114.96, 114.51,113.77, 113.57, 66.49, 55.74, 40.42, 40.35, 31.90, 31.18, 31.10, 29.81,29.71, 29.63, 29.61, 29.51, 29.46, 29.32, 27.58, 23.35, 23.27, 22.93, 22.85,22.67, 14.09, 13.78, 13.71, 13.68, 10.44, 10.36.
实施例3
按照以下反应流程制备：
；
将TPB-CHO (103 mg, 0.1 mmol)、CPT30 (20 mg, 0.1 mmol) 和CIC (26 mg,0.1 mmol) 溶解在10 mL三氯甲烷中。将吡啶 (40 mg，0.5 mmol) 滴加到溶液中，混合物在50℃ 下反应12 h。将溶液冷却至室温后，真空蒸发溶剂，将残余物溶解在二氯甲烷(30 mL)中并用水(30 mL)萃取。将有机相合并后用无水Na2SO4干燥，并通过硅胶柱色谱法使用石油醚/二氯甲烷2:1作为洗脱剂进行纯化。粗产物用二氯甲烷溶解，在超声条件下缓慢加入正己烷重结晶，固体析出后抽滤，得到棕黑色粉末CY6CT (产率：75 mg，52％)。
1H NMR (600 MHz, Chloroform-d) δ 9.07 (s, 1H), 9.00 (s, 1H), 8.70 (s,1H), 8.33 (s, 1H), 7.97 (d, J = 12.1 Hz, 2H), 4.81 (t, J = 10.6 Hz, 4H), 3.20– 3.14 (m, 4H), 2.20 – 2.17 (m, 2H), 1.86 – 1.84 (m, 4H), 1.49 – 1.46(m, 4H),1.35 – 0.96 (m, 44H), 0.87 – 0.80 (m, 12H), 0.70 – 0.65 (m, 6H).
13C NMR (151 MHz, Chloroform-d) δ 186.12, 181.59, 153.12, 147.39,145.16, 142.60, 139.47, 139.12, 138.72, 138.04, 136.41, 136.11, 135.53,134.03, 133.50, 133.44, 133.35, 130.82, 129.98, 127.34, 127.17, 126.80,125.20, 124.93, 119.73, 115.05, 114.96, 114.55, 113.54, 55.80, 40.46, 40.42,31.89, 31.16, 31.08, 29.80, 29.71, 29.62, 29.59, 29.49, 29.46, 29.43, 29.30,27.73, 27.68, 23.42, 23.34, 22.85, 22.81, 22.65, 14.05, 13.71, 13.67, 10.37,10.31.
实施例4
将2 mg荧光探针（实施例1制备的HY6CT、实施例2制备的FY6CT和实施例3制备的CY6CT）分别和10 mg DSPE-PEG2000溶解于1 mL四氢呋喃中，然后加入到10 mL去离子水中超声组装，结束后转移纳米粒子溶液至截留分子量为3500的透析袋中，透析净化72 h，透析后的纳米粒子溶液用分子量为100000的聚乙二醇吸水浓缩，再用针筒式过滤器过滤杂质，最终制得荧光探针包覆型纳米颗粒（纳米成像试剂，分别记为HY6CT-NPs、FY6CT-NPs和CY6CT-NPs）。通过预先建立的浓度曲线确定纳米成像试剂的有效浓度为500 μmol L-1。
性能测试：
（1）荧光探针包覆型纳米颗粒HY6CT-NPs、FY6CT-NPs和CY6CT-NPs的粒径测试：在3mL 去离子水中加入30 μL纳米荧光探针，然后用透射电镜和动态光散射仪分别测定粒径，结果如图1所示。
图1中的A为纳米荧光探针HY6CT-NPs的透射电镜图，图1中的B、C和D分别为HY6CT-NPs、FY6CT-NPs和CY6CT-NPs粒径图。从图1可以看出，HY6CT-NPs、FY6CT-NPs和CY6CT-NPs的尺寸分别为130 nm、149 nm 和141 nm。
（2）纳米荧光探针的吸收光谱测试：用搭载了积分球模块的紫外-可见分光光度计分别测试HY6CT-NPs、FY6CT-NPs、CY6CT-NPs和ICG在水溶液中的吸收光谱，测试浓度为10 μmol L-1，结果如图2所示。
图2为荧光探针包覆型纳米颗粒HY6CT-NPs、FY6CT-NPs和CY6CT-NPs在水溶液中的吸收光谱。从图2中可以看出，三种荧光探针包覆型纳米颗粒HY6CT-NPs、FY6CT-NPs和CY6CT-NPs纳米荧光探针在400-1000 nm范围内都表现出高的吸收率，HY6CT-NPs、FY6CT-NPs和CY6CT-NPs在最大吸收处的摩尔消光系数分别为6.35×104（780 nm）、8.38×104（806nm）和7.85×104 L mol-1 cm-1（803 nm）。相比于ICG，纳米荧光探针在白光区域（400-800nm）表现出更广泛的吸收。
（3）荧光探针包覆型纳米颗粒的发射光谱测试：用稳态瞬态荧光光谱仪分别测试HY6CT-NPs、FY6CT-NPs和CY6CT-NPs在水溶液中的发射光谱，测试浓度为10 μmol L-1，结果如图3所示。
值得注意的是，三种荧光探针包覆型纳米颗粒在白光的激发下表现出可延伸至1400 nm的NIR-II区荧光发射，HY6CT-NPs、FY6CT-NPs和CY6CT-NPs的最大发射峰分别为947nm、948 nm和954 nm，这些结果表明HY6CT-NPs、FY6CT-NPs和CY6CT-NPs可在白光激发下发出NIR-II区荧光。相反地，ICG的光谱在相同浓度下几乎检测不到。
荧光探针包覆型纳米颗粒HY6CT-NPs、FY6CT-NPs和CY6CT-NPs在水溶液中的相对量子产率测试：选择NIR-II商业荧光染料IR26作为参比测试HY6CT-NPs、FY6CT-NPs和CY6CT-NPs的相对量子产率。IR26需配制成二氯乙烷溶液。首先分别测试HY6CT-NPs、FY6CT-NPs、CY6CT-NPs和IR26-DCE的吸收光谱，确定它们在808 nm处的吸光度值分别为0.02，0.04，0.06，0.08，0.10时对应的浓度，然后再分别测试在808 nm激发时相应浓度的荧光光谱，对发射波长范围为850-1400 nm的荧光光谱进行面积积分作为纵坐标，以吸光度值为横坐标做线性回归分析求得斜率，再通过公式1所述方程计算HY6CT-NPs、FY6CT-NPs和CY6CT-NPs的相对量子产率。
公式1；
公式1所述方程式中所述的水的折射率为1.333，二氯乙烷的折射率为1.4448。
图4为纳米成像试剂HY6CT-NPs、FY6CT-NPs和CY6CT-NPs以IR26为参比时的相对量子产率测试结果。从图4可以计算出，HY6CT-NPs、FY6CT-NPs和CY6CT-NPs的相对量子产率分别为25.22%、18.85%和9.78%。
图5为同一浓度下纳米成像试剂HY6CT-NPs、FY6CT-NPs、CY6CT-NPs和ICG水溶液在白光（白光照明）激发下的明场图像和NIR-II荧光图像。用NIR-II小动物成像仪对装有同一浓度纳米成像探针的PE管进行成像，测试浓度为10 μmol L-1，结果如图5所示。
从图5可以看出，三种成像探针在白光激发下都可以监测到明显的NIR-II荧光信号，相反地，ICG作为NIR-II商业染料在白光激发下没有检测到荧光信号。
实施例5
荧光探针包覆型纳米颗粒FY6CT-NPs对小鼠腹部血管的高分辨NIR-II荧光成像能力测试：将100 µL浓度为500 µmol/L的FY6CT-NPs通过尾静脉注射到BALBC/b小鼠体内，然后用近红外二区活体成像仪对小鼠进行活体荧光成像，激发光源为近红外二区活体成像照明光源（16.5 mW cm-2），调节不同波长的滤光片进行荧光图像的采集，结果如图6中的A所示。通过成像软件分析不同滤光片条件下的成像分辨率，结果如图6中的B、图6中的C和图6中的D所示。
图6中的A为荧光探针包覆型纳米颗粒FY6CT-NPs在不同滤光片条件下对正常小鼠腹部血管的NIR-II荧光成像图。从图6中的A可以看出，尾静脉注射FY6CT-NPs后，小鼠血管迅速被“点亮”，在NIR-II窗口出现荧光信号。调节滤光片从900 nm至1100 nm，荧光图像清晰度逐步提高，在1100 nm滤光片条件下，腹部血管清晰可见，与周围组织区分明显。图6中的B、图6中的C和图6中的D为不同滤光片条件下的分辨率分析图。从图6中的B、图6中的C和图6中的D可以看出，随着滤光片条件的逐步调整，成像的信噪比（SBR）逐步升高，在1100 nm滤光片条件下达到2.94，半峰宽降低至0.1440 mm，这些结果说明FY6CT-NPs具有良好的在白光激发下对小鼠腹部血管的高分辨NIR-II荧光成像能力。
HY6CT-NPs和CY6CT-NPs在白光激发下对小鼠腹部血管的高分辨NIR-II荧光成像能力与FY6CT-NPs相似。
由以上实施例可知，本发明提供的白光激发的用于血管成像的近红外二区有机纳米成像试剂的制备方法简单，具有优异的发光性质，可以在白光激发下实现对小鼠血管的高分辨率NIR-II成像，应用效果良好。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (10)
1.一种近红外二区有机荧光探针，其特征在于，具有式I所示结构：
式I；
式I中，所述R1和R2独立的为C1~16支链或直链烷基；
所述R3为，R3中的X为H和/或卤素。
2.根据权利要求1所述的近红外二区有机荧光探针，其特征在于，R1和R2独立的为C1~11支链或直链烷基；
所述R3中的多个X为H、F、Cl和Br中的一种或多种。
3.根据权利要求1或2所述的近红外二区有机荧光探针，其特征在于，具有式I-a，I-b或式I-c所示结构；
式I-a；
式I-b；
式I-c。
4.权利要求1~3任一项所述的近红外二区有机荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将式II所示结构的化合物、式III所示结构的化合物、式IV所示结构化合物、有机碱催化剂和有机溶剂混合，进行脑文格反应，得到具有式I所示结构的近红外二区有机荧光探针；
式II；
式III；
式IV。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述式II所示结构的化合物、式III所示结构的化合物与式IV所示结构化合物的摩尔比为1：1：1；
所述有机碱催化剂为吡啶；所述式II所示结构的化合物与所述有机碱催化剂的摩尔比为1：3~10；
所述脑文格反应的温度为25~70 ℃，时间为8~24 h。
6.一种荧光探针包覆型纳米颗粒，其特征在于，包括权利要求1~3任一项所述的近红外二区有机荧光探针或权利要求4或5所述的制备方法制备得到的近红外二区有机荧光探针，以及包覆在所述近红外二区有机荧光探针表面的有机包覆剂。
7.权利要求6所述的荧光探针包覆型纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将权利要求1~3任一项所述的近红外二区有机荧光探针或权利要求4或5所述的制备方法制备得到的近红外二区有机荧光探针、有机包覆剂和有机溶剂混合，得到混合液；
将所述混合液与水混合，进行超声共沉淀，得到荧光探针包覆型纳米颗粒。
8.权利要求1~3任一项所述的近红外二区有机荧光探针或权利要求4或5所述的制备方法制备得到的近红外二区有机荧光探针或权利要求6所述的荧光探针包覆型纳米颗粒或权利要求7所述的制备方法制备得到的荧光探针包覆型纳米颗粒在制备生物成像造影剂中的应用。
9.权利要求1~3任一项所述的近红外二区有机荧光探针或权利要求4或5所述的制备方法制备得到的近红外二区有机荧光探针或权利要求6所述的荧光探针包覆型纳米颗粒或权利要求7所述的制备方法制备得到的荧光探针包覆型纳米颗粒在非治疗目的且非诊断目的的荧光成像中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述荧光成像在白光激发条件下进行，白光激发的波长范围为400~800 nm。
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