CN117589984A - 一种检测鸡滑液囊支原体的胶体金试纸条 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测鸡滑液囊支原体的胶体金试纸条，包括底板，所述底板上依次设置有样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸收垫，所述硝酸纤维素膜上相邻设置有检测线和质控线，所述金标垫为胶体金标记抗鸡滑液囊支原体单克隆抗体G1；检测线为抗鸡滑液囊支原体单克隆抗体H9，质控线为羊抗小鼠IgG，本发明提供了一种检测鸡滑液囊支原体的胶体金试纸条，可采集鸡的鼻拭子样品直接进行检测，具有良好的敏感性、特异性，操作方便，20min之内即可检测出结果。
Description
技术领域
本发明属于鸡滑液囊支原体领域，具体涉及一种检测鸡滑液囊支原体的胶体金试纸条。
背景技术
鸡滑液支原体感染是由滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae，MS)引起的关节渗出性滑膜炎、滑液囊和腱鞘发炎为主要特征的急性或慢性传染性疾病，也可引起气囊炎，甚至导致全身感染，常常与新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、大肠杆菌等致病微生物或混合感染。其膜上含有丰富的脂蛋白，称为脂质相关膜蛋白(Lipid associated membraneproteins，LAMPs)，具有很强的免疫原性。同时脂蛋白易发生相位、抗原变异，造成支原体表面种类丰富多样化。虽然人们对支原体致病机理尚不明确，但越来越多的研究表明脂蛋白在其致病过程中扮演重要的角色。LP78蛋白是滑液囊支原体膜上的一种脂蛋白，具有很强的免疫原性。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明提供了一种检测鸡滑液囊支原体的胶体金试纸条，本发明成功制备了两株能稳定分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株G1和H9。经过间接ELISA和Western-blot检测结果表明，2株单克隆抗体均可与滑液囊支原体发生特异性地结合，并且与禽类其他病原体不发生反应。基于此，本发明研究和设计出了一种检测鸡滑液囊支原体的胶体金试纸条及其应用。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种检测鸡滑液囊支原体的胶体金试纸条，包括底板，所述底板上依次设置有样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸收垫，所述硝酸纤维素膜上相邻设置有检测线和质控线，所述金标垫为胶体金标记抗鸡滑液囊支原体单克隆抗体G1；检测线为抗鸡滑液囊支原体单克隆抗体H9，质控线为羊抗小鼠IgG。
作为本发明进一步的方案，所述单克隆抗体G1和单克隆抗体H9为鸡滑液囊支原体纯化的LP78蛋白免疫小鼠后获得的杂交瘤细胞，免疫小鼠产生的腹水纯化制成，其中单克隆抗体H9单抗重链分子量为45kDa，单克隆抗体G1单抗重链分子量为52kDa，两株单抗重链均为IgG1型，轻链均为κ链；使用间接法对单克隆抗体G1和单克隆抗体H9单抗进行检测，抗体效价均不低于1:128000。
作为本发明进一步的方案，所述金标垫上铺有金标溶液。
作为本发明进一步的方案，在制备的金标溶液中加入单克隆抗体G1，使其终浓度为25～30μg/ml，搅拌均匀后加BSA至终浓度为1％、以及终浓度质量体积分数为0.3％的PEG-2000进行融合，使用PEG-2000可提高金标溶液和单克隆抗体的结合度。
作为本发明进一步的方案，所述羊抗小鼠IgG使用浓度为1mg/ml，划为质控线，鸡滑液囊支原体单克隆抗体H9使用浓度为0.5～1mg/ml，划为检测线，质控线靠近吸收垫。
作为本发明进一步的方案，还包括样品处理液，所述样品处理液为PBS缓冲液。
本发明具有以下有益效果：
本发明的胶体金试纸条具有良好的敏感性、特异性，可以快速检测鸡滑液囊支原体抗原，并且不与其他禽类病原体产生反应。
本发明提供了一种检测鸡滑液囊支原体的胶体金试纸条，可采集鸡的鼻拭子样品直接进行检测，具有良好的敏感性、特异性，操作方便，20min之内即可检测出结果；解决了传统方法使用PCR或荧光PCR方法检测鸡滑液支原体，需要专业的检测人员和设备，费时费力，不适用于中小养殖户进行检测的问题。
为更清楚地阐述本发明的结构特征和功效，下面结合附图与具体实施例来对本发明进行详细说明。
附图说明
图1为本发明提到的一种检测鸡滑液囊支原体的胶体金试纸条结构示意图。
图2是本发明提到的H9单抗接种的小鼠腹水SDS-PAGE分析示意图。
图3为本发明提到的试纸条敏感性测定结果示意图。
图4为本发明提到的试纸条特异性测定结果示意图。
具体实施方式
下面将结合附图和有关知识对本发明作出进一步的说明，进行清楚、完整地描述，显然，所描述的应用仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。
参照图1-图4所示，本发明涉及的一种检测鸡滑液囊支原体的胶体金试纸条。包含棉签，试纸条和样品处理液，其中胶体金试纸条包含底板1、样品垫2、金标垫3、吸收垫(吸水纸)4和硝酸纤维素膜5组合制成，金标垫3为胶体金标记抗鸡滑液囊支原体单克隆抗体G1；检测线6为抗鸡滑液囊支原体单克隆抗体H9，质控线7为羊抗小鼠IgG；样品处理液为PBS缓冲液；本发明基于双抗体夹心法，可采集鸡的鼻拭子样品直接进行检测，具有良好的敏感性、特异性，操作方便，20min之内即可检测出结果。本发明的胶体金试纸条具有良好的敏感性、特异性，可以快速检测鸡滑液囊支原体抗原，并且不与其他禽类病原体产生反应。
具体由以下构成：单克隆抗体G1和H9为鸡滑液囊支原体纯化的LP78蛋白免疫小鼠后获得的杂交瘤细胞，免疫小鼠产生的腹水纯化制成。H9单抗重链分子量为45kDa，G1单抗重链分子量为52kDa，两株单抗重链均为IgG1型，轻链均为κ链；使用间接法对G1和H9单抗进行检测，抗体效价均不低于1:128000。
在本发明中，金标垫，由金标溶液铺在金标垫中制成。在制备的金标溶液中加入单克隆抗体G1，使其终浓度为25～30μg/ml，搅拌均匀后加BSA至终浓度为1％、以及终浓度质量体积分数为0.3％的PEG-2000进行融合。使用PEG-2000可提高金标溶液和单克隆抗体的结合度。羊抗小鼠IgG使用浓度为1mg/ml，划为质控线(C线)，鸡滑液囊支原体单克隆抗体H9使用浓度为0.5～1mg/ml，划为检测线T线，C线靠近吸收垫。
本发明研究制备了两株能稳定分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株G1和H9。经过间接ELISA和Western-blot检测结果表明，2株单克隆抗体均可与滑液囊支原体发生特异性地结合，并且与禽类其他病原体不发生反应。
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明
1、鸡滑液支原体单克隆抗体的制备
1.1小鼠免疫将纯化后的LP78蛋白与弗氏完全佐剂1:1体积比混合，充分乳化，颈背部、腹部皮下多点免疫BALB/c小鼠(免疫剂量为100μg/只)，此后每隔两周，取首免相同剂量的抗原与等体积不完全弗氏佐剂混合乳化后加强免疫2次；三次免疫后2周，小鼠尾静脉采血，分离血清，以LP78蛋白作为包被抗原检测血清抗体效价，选择血清抗体效价最高的小鼠，腹腔注射加强免疫不含佐剂的2倍初免剂量抗原，免疫后72h内进行细胞融合。
1.2饲养细胞的制备取未免疫的8周龄小鼠，处死后浸泡在75％酒精中消毒5min，用无菌的剪刀和镊子先剪开小鼠腹部皮肤，暴露出腹膜后对其进行消毒，然后于腹部中央的腹膜上剪一小口并用止血钳固定，然后用灭菌的吸管吸取适量的培养基，从剪开的小口处注入小鼠腹腔，轻轻的反复吹吸几次，收集含有饲养层细胞的培养基，1000×g离心10min，轻轻弃去上清，用适量的HAT完全1640培养基将细胞重悬，分装饲养层细胞于96孔细胞培养板中，每孔1×104个细胞，置于37℃，5％ CO2中培养箱备用。
1.3细胞融合无菌取小鼠脾脏，磨碎后过滤即得脾细胞，将免疫脾细胞与骨髓瘤细胞以2-5:1的比例进行混合，使用1640培养基冲洗一遍，离心后在细胞中慢慢加入1ml 37℃预热的50％ PEG2000，边加边旋转离心管；缓慢加入提前预热至37℃的1640培养基，将融合完成的细胞置于37℃，5％ CO2培养箱中静止10min，常温条件下1000×g离心10min，弃上清；加入HAT完全培养基轻轻重悬细胞，分装于含有饲养层细胞的96孔细胞培养板中，每孔100μl，标记后置于37℃，5％ CO2培养箱中培养；5天后置换出一半体积的HAT完全培养基，7-10天后，当细胞集落长至培养孔1/4时取上清进行ELISA检测。
1.4阳性杂交瘤细胞筛选将LP78蛋白包被酶标板，取细胞上清液加入，同时以免疫小鼠的血清作为阳性对照，未免疫的小鼠血清作为为阴性对照，建立的间接ELISA方法对杂交瘤细胞上清进行检测，经检测G1和H9抗体效价最高。将阳性值较高的阳性杂交瘤细胞扩大培养到6孔细胞培养板内，经过3次亚克隆，至阳性检出率达到100％，即可确定获得稳定分泌单克隆抗体的细胞株，将细胞株进行扩大培养和冻存。
1.5腹水制备和纯化选择5只8-10周龄健康的雌性BALB/c小鼠，腹腔注射灭菌的液体石蜡进行致敏，0.3ml/只。7d后将处于对数生长期且生长状态良好的杂交瘤细胞从细胞培养瓶中冲洗下来，1000×g离心10min，弃掉上清，向离心管里加入6ml无血清的1640培养基将细胞沉淀悬起，经细胞计数后，使细胞密度为1×106个/0.5ml，每只小鼠腹腔注射0.2ml此细胞悬液。在注射7-12d后观察小鼠的腹部状态，若小鼠腹部明显膨大，使用酒精棉球对小鼠下腹部皮肤进行消毒，用5ml的注射器刺入小鼠腹腔，开始收集腹水。吸取中间层澄清透明的液体，通过proteinG层析柱纯化抗体，使用Binding/Wash Buffer洗涤，1/10洗脱液体积，收集洗脱液，加入中和Buffer，调节pH到7.4，制得鸡滑液囊支原体单克隆抗体。
2、单克隆抗体的鉴定
2.1浓度测定采用核酸蛋白浓度测定仪对纯化后的单克隆抗体进行浓度测定，结果G1单抗体浓度为10.5mg/ml；H9单抗浓度为12.2mg/ml。
2.2纯度测定对纯化后的单克隆抗体进行SDS-PAGE电泳分析。如图2所示H9单抗接种的小鼠腹水SDS-PAGE分析示意图，H9单抗在45kD和23kD出现2条清晰条带，23kDa处为抗体轻链，45kDa处为抗体重链，没有其他杂带，纯度达到预期要求。
2.3效价测定使用间接ELISA方法对两株单抗进行效价测定。使用LP78蛋白包被酶标板，封闭洗涤后将纯化后的单克隆抗体进行倍比稀释后加入，100μl/孔，孵育洗涤，加入1∶50000倍稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG，100μl/孔，37℃反应30min，洗涤3次后，加入底物显色液，50μl/孔，浓硫酸终止反应之后，用酶标仪测每孔OD450nm读值。同时设阴性小鼠血清作为阴性对照，单克隆抗体OD450nm值高于阴性对照的判为阳性。检测结果如表1所示，G1单抗和H9单抗ELISA效价均为128000。
表1单抗ELISA效价测定
| G1单抗稀释倍数 | OD450nm值 | H9单抗稀释倍数 | OD450nm值 |
| 1000 | 1.998 | 1000 | 2.472 |
| 2000 | 1.762 | 2000 | 2.198 |
| 4000 | 1.589 | 4000 | 1.842 |
| 8000 | 1.373 | 8000 | 1.533 |
| 16000 | 0.972 | 16000 | 1.276 |
| 32000 | 0.794 | 32000 | 0.988 |
| 64000 | 0.563 | 64000 | 0.745 |
| 128000 | 0.389 | 128000 | 0.423 |
| 256000 | 0.208 | 256000 | 0.214 |
| 阴性对照 | 0.210 | 阴性对照 | 0.209 |
2.4亚型测定使用鼠源单抗IgG类/亚类鉴定用的ELISA试剂盒，检测单抗的亚类。结果显示，两株单抗重链均为IgG1型，轻链均为κ链。
3、胶体金试纸条的制备和组装
采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒溶液，将100ml纯水加热至沸腾后加入1％氯化金溶液，煮沸后缓慢加入1ml 1％氯金酸溶液，再次沸腾后加入1％的柠檬酸钠溶液1.5ml，冷却后调整PH值为9.0。在制备的金标溶液中加入单克隆抗体G1，使其终浓度为25～30μg/ml，搅拌均匀后加BSA至终浓度为1％、以及终浓度质量体积分数为0.3％的PEG-2000，以2500r/min 4℃离心20min，再将上清转移到另一新的离心管中，8000r/min、4℃离心1h后，弃上清，再用含有质量体积分数为1％的BSA溶液进行重悬，最终沉淀用重悬液稀释至原体积的10％；将标记好的胶体金溶液均匀涂布于金标垫上，37℃烘干30min备用。
将羊抗小鼠IgG二抗和鸡滑液囊支原体单克隆抗体H9分别以1mg/ml、0.5～1mg/ml浓度包被硝酸纤维素膜作为质控线C线和检测线T线，2％的BSA封闭1h后37℃烘干30min备用；将准备好的硝酸纤维素膜、样品垫、金标垫和吸水纸按顺序各部分重叠2mm粘贴到背衬板上，切条机切割成4mm条，组装成检测试纸条。
4、鸡滑液囊支原体胶体金试纸条敏感性检测
4.1阳性质控品制备取鸡滑液囊支原体菌株按照5％比例接种于改良Fray培养基，置37℃培养至培养基颜色变黄、呈轻度混浊时收获培养液，按照倍比稀释法进行活菌计数。当培养的支原体≥108.0CCU时，4℃以8000r/min离心40分钟，弃上清，沉淀菌体用PBS重悬离心一次，配制成原培养物1/50的悬液，进行灭活。灭活步骤如下：加入1％硫柳汞和0.2％甲醛进行灭活，置37℃灭活过夜，用超声波分散，作为阳性质控品。
4.2阳性质控品检测用样品处理液将阳性质控品进行10倍倍比稀释，将103稀释度标记为M1、104稀释度标记为M2、105稀释度标记为M3、106稀释度标记为M4，107稀释度标记为M5。将M1～M5缓慢加到样品孔，加样后将试纸条平放在桌面上，5-15min观察结果，所有检测样品均出现两条红色条带(图3试纸条敏感性测定结果)，表明试纸条敏感度较高。
5、鸡滑液囊支原体胶体金试纸条特异性检测
取试纸条，检测鸡毒支原体、禽大肠杆菌、沙门氏菌、巴氏杆菌、链球菌结果均为阴性，见图4试纸条特异性测定结果，表明试纸条的特异性良好。
6、对临床样本的检测
对临床阳性鸡场采集30份样品进行检测，检测方法为：固定鸡，将棉签插入鸡鼻孔，轻轻转动3圈，将棉签插入样品处理液，搅拌混匀，充分释放棉签上的样品，将样品处理液滴入胶体金是肢体的加样孔，10-15min观察结果，如C线出现条带则检测有效，T线出现条带，判为阳性；T线未出现条带，判为阴性。同时用PCR方法对样品进行检测。
检测结果见表2，PCR检测阳性率18/30，本胶体金试纸条检测阳性率16/30，两者符合率93.33％，表明本试纸条的准确度度较好。
表2胶体金试纸条和PCR方法对临床样本的检测结果
本发明提供了一种检测鸡滑液囊支原体的胶体金试纸条，可采集鸡的鼻拭子样品直接进行检测，具有良好的敏感性、特异性，操作方便，20min之内即可检测出结果；解决了传统方法使用PCR或荧光PCR方法检测鸡滑液支原体，需要专业的检测人员和设备，费时费力，不适用于中小养殖户进行检测的问题。
以上结合具体实施例描述了本发明的技术原理，仅是本发明的优选实施方式。本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。本领域的技术人员不需要付出创造性的劳动即可联想到本发明的其它具体实施方式，这些方式都将落入本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种检测鸡滑液囊支原体的胶体金试纸条，其特征在于，包括底板，所述底板上依次设置有样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸收垫，所述硝酸纤维素膜上相邻设置有检测线和质控线，所述金标垫为胶体金标记抗鸡滑液囊支原体单克隆抗体G1；检测线为抗鸡滑液囊支原体单克隆抗体H9，质控线为羊抗小鼠IgG。
2.如权利要求1所述的一种检测鸡滑液囊支原体的胶体金试纸条，其特征在于，所述单克隆抗体G1和单克隆抗体H9为鸡滑液囊支原体纯化的LP78蛋白免疫小鼠后获得的杂交瘤细胞，免疫小鼠产生的腹水纯化制成，其中单克隆抗体H9单抗重链分子量为45kDa，单克隆抗体G1单抗重链分子量为52kDa，两株单抗重链均为IgG1型，轻链均为κ链；使用间接法对单克隆抗体G1和单克隆抗体H9单抗进行检测，抗体效价均不低于1:128000。
3.如权利要求2所述的一种检测鸡滑液囊支原体的胶体金试纸条，其特征在于，所述金标垫上铺有金标溶液。
4.如权利要求3所述的一种检测鸡滑液囊支原体的胶体金试纸条，其特征在于，在制备的金标溶液中加入单克隆抗体G1，使其终浓度为25～30μg/ml，搅拌均匀后加BSA至终浓度为1％、以及终浓度质量体积分数为0.3％的PEG-2000进行融合，使用PEG-2000可提高金标溶液和单克隆抗体的结合度。
5.如权利要求2所述的一种检测鸡滑液囊支原体的胶体金试纸条，其特征在于，所述羊抗小鼠IgG使用浓度为1mg/ml，划为质控线，鸡滑液囊支原体单克隆抗体H9使用浓度为0.5～1mg/ml，划为检测线，质控线靠近吸收垫。
6.如权利要求1所述的一种检测鸡滑液囊支原体的胶体金试纸条，其特征在于，还包括样品处理液，所述样品处理液为PBS缓冲液。
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