CN117586318A - 从银杏叶提取物中制备酰化黄酮苷a的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于中草药领域，从银杏叶提取物中制备酰化黄酮苷A(槲皮素‑3‑O‑[6″′‑O‑E‑p‑香豆酰基‑β‑D‑葡萄糖基‑(1→2)‑α‑L‑鼠李糖苷])的方法，该方法首先运用大孔吸附树脂对银杏叶提取物进行初步纯化，经活性白土进行脱色后，将脱色流份采用Flash中压制备色谱、重结晶手段，分离得到的酰化黄酮苷A纯度达到UV≥98％、ELSD≥98％，回收率高，其中酰化黄酮苷A为70％；具有制备量大、稳定性高、重复性强、工艺步骤简单、分离获得单体化合物纯度高等优点，是一种理想的从银杏叶提取物中制备酰化黄酮苷A的分离工艺，为后续工业放大生产奠定了基础。

Description

从银杏叶提取物中制备酰化黄酮苷A的方法
技术领域
本发明属于中草药领域，银杏叶提取物中酰化黄酮苷A(槲皮素-3-O-[6″′-O-E-p-香豆酰基-β-D-葡萄糖基-(1→2)-α-L-鼠李糖苷])的制备工艺技术，尤其涉及大孔吸附树脂的分离纯化，活性白土的脱色工艺，Flash中压制备色谱、重结晶等技术手段的运用。
背景技术
银杏(Ginkgo biloba L.)是一种裸子植物、银杏科、银杏属的单科单属单种植物，又称鸭脚子、公孙树、白果。银杏在3亿多年前的石炭纪首次出现，主要分布于北半球，由于冰川期的影响，银杏曾濒临灭绝，仅我国部分地区得以保存，成为世界上最古老的孑遗植物之一。
银杏叶及其提取物含有多种化学成分，包括黄酮类、萜类内酯类、银杏酸等其中黄酮类和萜类内酯类是银杏叶提取物的主要活性成分。
文献调研表明，槲皮素-3-O-[6″′-O-E-p-香豆酰基-β-D-葡萄糖基-(1→2)-α-L-鼠李糖苷](酰化黄酮苷A)为含有香豆酰基的酰化黄酮苷，是银杏叶提取物中主要成分之一，含量较高，在其他植物中少见报道，为银杏叶提取物中比较“特有成分”，并且在来源于银杏叶提取物制备的银杏叶临床药品中皆含有酰化黄酮苷A。现代药理活性研究表明酰化黄酮苷A能够刺激生长激素分泌，富含酰化黄酮苷A的复合物拥有良好的活性，如缓解动脉粥样硬化、神经保护、抗肿瘤、抗衰老等。可见，酰化黄酮苷A拥有潜在优良的药理活性，但尚未见其制备工艺报道。
大孔吸附树脂(Macroporous Adsorbing Resins，MAR)是一种高分子吸附剂，其结构特点为无交换基团的大孔结构，该吸附树脂具有良好的大孔网络结构和较大的比表面积，能够通过物理吸附水溶液中的有机物进行筛选，这种新型有机高分子吸附剂于20世纪60年代开始发展，现广泛运用于中草药有效成分的分离及新药的开发与研制。
中压制备色谱(Medium Pressure Liquid Chromatography，MPLC)被广泛应用于天然产物化学、生物化学、药物化学及有机合成等领域的分离纯化，MPLC具有快速分离、高效率等优点，能够快速制备克级样品。相对于传统柱色谱，MPLC具备实时检测的检测器和流动相推动的计量泵，因此分离更准确、速度更快。相对于高效液相制备，MPLC可以处理更大的样品量并且用时更短。此外，使用不同类型的填料可以进一步提高分离的选择性，因此MPLC经常用于天然产物的分离纯化。特别适用于工业生产中的大规模富集化合物。
发明内容
为了克服现有技术的缺点，本发明的技术方案提供一种从银杏叶提取物中制备酰化黄酮苷A单体的纯化工艺，具有工艺简单方便、重复性强的特点。为了达到上述目的，本发明采用了如下技术方案：
银杏叶提取物中酰化黄酮苷A的制备工艺，该工艺包括如下步骤：
(1)运用大孔吸附树脂对银杏叶提取物进行初步纯化，具体步骤为：将大孔吸附树脂预处理，装柱；取银杏叶提取物配制为一定浓度的供试品溶液，上样，运用乙醇水洗脱；
(2)将步骤(1)中获得的含有酰化黄酮苷A的富集流份运用活性白土进行脱色，具体步骤为：将脱色剂预处理，备用；取大孔吸附树脂富集流份配制为供试品溶液，加入预处理后的脱色剂，调节温度，时间进行脱色；
(3)将步骤(2)中获得的脱色流份运用Flash中压制备色谱进行富集纯化，获得较高纯度的酰化黄酮苷A粗品；具体步骤为：将脱色后的流份配制为供试品溶液，运用Flash中压制备色谱进行分离，回收。
(4)将步骤(3)中获得酰化黄酮苷A粗品运用重结晶精制，即得酰化黄酮苷A；
(5)将步骤(4)中获得酰化黄酮苷A运用高效液相色谱进行纯度分析。
步骤(1)所述的大孔吸附树脂为HPD-100型树脂。
步骤(1)所述的大孔吸附树脂预处理按以下操作进行：将大孔吸附树脂用温水清洗3-5次，除去部分大孔吸附树脂表面的致孔剂、交联剂；取95％的工业乙醇浸泡24h，再用95％工业乙醇以2BV/h(1BV为大孔树脂装填体积)洗脱流速通过大孔树脂柱，直至流出液加水不出现白色混浊为止；用水洗脱至流出液无醇味，加入2～5％盐酸溶液浸泡大孔树脂2～4h，加水用2-3BV/h的洗脱流速通过大孔树脂层析柱，洗至流出液pH为中性；加入2～5％氢氧化钠溶液浸泡大孔树脂2～4h，加水用2-3BV/h的洗脱流速通过大孔树脂层析柱，洗至流出液pH为中性，即为可用树脂。
步骤(1)所述供试品溶液配制方法为：精密称量25.0mg银杏叶提取物，置于10mL的棕色容量瓶中，甲醇定容至刻度线，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤后密封存放于4℃的环境备用。
步骤(1)所述供试品溶液的pH值为5，采用稀盐酸调节pH值，上样液体积为100BV，上样流速为6BV/h，上样浓度为1.25mg/mL，除杂洗脱溶剂为8％乙醇水，洗脱体积20BV，洗脱溶剂为50％乙醇水，流速为2BV/h，洗脱体积为6BV。
步骤(2)所述供试品溶液配制方法为：精密称量40mg大孔吸附树脂50％乙醇水洗脱流份，置于10mL容量瓶中，用50％的乙醇水定容至刻度线，摇匀，备用。
步骤(2)所述脱色剂前处理：精密称取活性白土100g，加入95％乙醇浸泡后自然沉降。使上清液无浑浊为止，挥干试剂。放入50℃烘箱中烘干，储存备用。
步骤(2)所述脱色剂用量为0.32g/mL，脱色时间为5.8h，脱色温度为42℃。
步骤(2)所述脱色过程样品回收，采用离心机离心后抽滤旋干，离心条件为10000转，离心时间2分钟。
步骤(3)所述Flash中压制备色谱型号为：BUCHI X2，生产商为：瑞士BUCHI公司，色谱柱型号为：Flash pure ID C18(80g,40μm)，生产商为：瑞士BUCHI公司。
步骤(3)所述供试品溶液制备：精密称量4.0g脱色后样品，置于10mL容量瓶中，用50％乙醇水定容至刻度线，溶液浓度为400mg/mL，溶解过程中可用超声助溶，采用0.45μm微孔滤膜过滤。
步骤(3)所述中压制备色谱条件：色谱柱C18 40μm irregular 80g，检测波长为254、315nm，单次进样5mL，采用乙腈(A)-水作为流动相，洗脱流速为60mL/min，洗脱梯度：0-2BV，5％-5％(A)，2-10BV，22％-22％(A)，10-14BV，25％-25％(A)，14-16BV，50％-50％(A)，16-18BV，50％-100％(A)。
步骤(3)所述流份收集：按峰收集，浓缩和冻干后，即得酰化黄酮苷A粗品。
步骤(4)所述酰化黄酮苷A重结晶：取酰化黄酮苷A粗品，加入溶液体积与样品质量比为5:1的色谱级甲醇，常温静置挥发，溶剂体积为样品量1倍或有大量沉淀析出时，吸出上层溶液，剩余沉淀重复上述步骤一到两次，即得精制酰化黄酮苷A。
步骤(5)所述酰化黄酮苷A高效液相色谱纯度分析色谱条件：色谱柱AgilentEclipse XDB C18(250mm×4.6mm，5μm)检测波长：315nm；柱温：25℃；进样10μL；流动相：乙腈-0.1％甲酸水溶液(20:80，V/V)30min；流速：1.0mL/min。
本发明从银杏叶提取物中制备大量且高纯度酰化黄酮苷A具有以下优点：
本发明开发了一种从银杏叶提取物中制备酰化黄酮苷A工艺，该方法首先运用大孔吸附树脂对银杏叶提取物进行初步纯化，经活性白土进行脱色后，将脱色流份采用Flash中压制备色谱、重结晶手段成功制备出大量的槲皮素-3-O-[6″′-O-E-p-香豆酰基-β-D-葡萄糖基-(1→2)-α-L-鼠李糖苷]，分离得到的酰化黄酮苷A纯度达到UV≥98％、ELSD≥98％，回收率高，其中酰化黄酮苷A为70％；具有制备量大、稳定性高、重复性强、工艺步骤简单、分离获得单体化合物纯度高等优点，是一种理想的从银杏叶提取物中制备酰化黄酮苷A的分离工艺，为后续工业放大生产奠定了基础。
本发明运用了大孔吸附树脂、Flash中压制备色谱、重结晶的分离手段以及活性白土脱色进行单体酰化黄酮苷制备，为实验室、工业生产上制备黄酮类化合物提供了思路。
附图说明
图1是大孔吸附树脂对酰化黄酮苷A纯化工艺流程图。
图2是酰化黄酮A流份脱色前后样品颜色对比图。
图3是酰化黄酮A流份脱色工艺流程图。
图4Flash中压制备色谱图。
图5是Flash中压制备色谱纯化工艺流程图。
图6是重结晶前后样品颜色对比图。
图7是酰化黄酮苷A纯度分析高效液相图。
图8是酰化黄酮苷A的1H NMR图。
图9是酰化黄酮苷A的13C NMR图。
具体实施例
以下为本发明的具体实施方式，所述实施例是为进一步描述本发明，但本发明要求保护的范围并不局限于下列实施方式。
实例1大孔吸附树脂对酰化黄酮苷A纯化工艺
大孔吸附树脂的预处理：将大孔吸附树脂用温水清洗3-5次，除去部分大孔吸附树脂表面的致孔剂、交联剂；取95％的工业乙醇浸泡24h，再用95％工业乙醇以2BV/h(1BV为大孔树脂装填体积)洗脱流速通过大孔树脂柱，直至流出液加水不出现白色混浊为止；用水洗脱至流出液无醇味，加入2～5％盐酸溶液浸泡大孔树脂2～4h，加水用2-3BV/h的洗脱流速通过大孔树脂层析柱，洗至流出液pH为中性；加入2～5％氢氧化钠溶液浸泡大孔树脂2～4h，加水用2-3BV/h的洗脱流速通过大孔树脂层析柱，洗至流出液pH为中性，即为可用树脂。
银杏叶提取物供试品溶液的配制：取银杏叶提取物，加入50％乙醇溶液溶解，配制浓度为12.5mg/ml原始溶液，可进行超声加速溶解。溶解后加入蒸馏水稀释浓度为1.25mg/ml的上样溶液。加入稀盐酸将上样液调至pH＝5。
装柱：取预处理好的大孔吸附树脂，使用之前用纯水洗净至流出液无醇味。装好的大孔树脂柱必须装匀，要防止“节”和气泡的产生。径高比控制在0.2以内。
上样：取配制好的银杏叶提取物溶液，上样体积为大孔吸附树脂的100倍，采用6BV/h流速进行上样。采用蠕动泵对流速进行控制。
洗脱：上样完毕后，先用纯水进行洗脱，洗脱2～4柱体积，流速为4BV/h,洗至流出液无明显颜色。再以乙醇水组成混合溶剂为流动相，以2BV/h的流速进行洗脱。将各梯度流份收集。所述表1中A为乙醇，B为水。其中50％乙醇水流份为酰化黄酮苷A流份。
表1梯度洗脱条件：
流份收集：50％乙醇水洗脱流份旋干浓缩，为酰化黄酮苷A流份。
大孔吸附树脂对酰化黄酮苷A纯化工艺流程图如图1所示。
实例2酰化黄酮苷A流份脱色工艺
供试品溶液制备：取大孔吸附树脂50％乙醇水洗脱的流份，用50％的乙醇水进行溶解。配制成浓度4mg/ml的供试品溶液。
脱色剂前处理：取一定量的活性白土，加入95％乙醇浸泡后自然沉降。使上清液无浑浊为止，挥干试剂，放入50℃烘箱中烘干备用。
样品脱色：取一定量的脱色剂与样品溶液混合，脱色条件分别为：脱色剂用量为0.32g/ml，脱色时间为5.8h，脱色温度为42℃。试验结果显示脱色率为：43％。
样品回收：首先取溶液部分，沉淀部分用50％乙醇水一倍量体积浸没，缓慢搅拌，静置取上层溶液，重复一次。将所有溶剂部分进行离心，离心条件10000转，2分钟，取上层溶液。离心后的沉淀部分用50％乙醇水，一倍量体积浸没，缓慢搅拌，离心取上层溶液。溶液合并，趁热抽滤，旋干备用。
酰化黄酮苷A流份脱色前后颜色对比如图2所示。
酰化黄酮苷A流份脱色工艺流程如图3所示。
实例3Flash中压制备色谱纯化
供试品溶液制备：精密称量4.0g脱色后样品，置于10mL容量瓶中，用50％乙醇水定容至刻度线，溶液浓度为400mg/mL，溶解过程中可用超声助溶，采用0.45μm微孔滤膜过滤。
中压制备色谱条件：选用色谱柱C18 40μm irregular 80g，采用乙腈-水作为流动相，洗脱流速为60mL/min，检测波长为254、315nm，单次进样5mL，洗脱梯度如表2所示，A为乙腈，B为水。
表2梯度洗脱条件：
流份收集：图4所示，按峰收集组分，浓缩和冻干后，得到酰化黄酮苷A。
Flash中压制备色谱纯化工艺流程图如图5所示。
实例4酰化黄酮苷A重结晶
取酰化黄酮苷A粗品，加入溶液体积与样品质量比为5:1的色谱级甲醇，常温静置挥发，溶剂体积为样品量1倍或有大量沉淀析出时，吸出上层溶液，剩余沉淀重复上述步骤一到两次，即得精制酰化黄酮苷A。
重结晶前后样品颜色对比如图6所示。
对分离获得酰化黄酮苷A进行高效液相分析，纯度UV≥98％，ELSD≥99％。
酰化黄酮苷A纯度分析高效液相图如图7所示。
实例6酰化黄酮苷A核磁鉴定
化合物为黄色无定型粉末(甲醇)，mp 177～179℃。分子式为C36H36O18，分子量为756。易溶于二甲基亚砜，紫外254nm下有暗斑，浓硫酸-香草醛反应显黄色，盐酸-镁粉反应和Molish反应为阳性，推测为黄酮苷类化合物。1H NMR谱中一组芳环质子信号δ7.25(1H,dd,J＝8.5Hz,2.0Hz,H-6'),7.36(1H,d,J＝2.0Hz,H-2')和6.88(1H,d,J＝8.5Hz,H-5')为黄酮B环上ABX偶合氢信号。δ6.16(1H,d,J＝2.0Hz,H-6)和6.31(1H,d,J＝2.0Hz,H-8)提示A环为5,7-二取代。13C NMR谱共有36个碳信号，其中δ178.1为羰基碳信号，δ121.0、116.0、116.0、98.6、93.5为黄酮苷元的五个次甲基信号，δ164.1、161.7、157.0、156.8、149.0、145.6、134.8、121.3、106.6为黄酮苷元的九个季碳信号。以上信号提示化合物为5,7,3',4'-四氧取代的黄酮类化合物。此外，1H NMR显示δ7.40(2H,d,J＝8.5Hz,H-2””,H-6””)和6.70(2H,d,J＝8.5Hz,H-3””,H-5””)提示苯环为1,4-二取代。δ7.44(1H,d,J＝16.0Hz,H-7””)和6.22(1H,d,J＝16.0Hz,H-8””)提示有反式双键。13C NMR谱显示δ166.8为羰基碳信号δ145.6、114.3为一组烯碳信号，δ160.1、130.5×2、125.4、115.9×2的一组1,4-二取代的芳碳信号，由以上特征可以推出化合物含有E-P-香豆酰基。NMR谱还显示了两个糖信号，包括δ5.53(1H,br s,Rha-1”)的端基氢信号，δ101.1的端基碳信号，δ0.92(3H,d,J＝6.0Hz)和17.8甲基氢碳信号，提示含有鼠李糖。δ4.30(1H,d,J＝8.0Hz,Glc-1”')为端基氢信号和δ104.3端基碳信号，推测含有葡萄糖。综合以上数据，分离得到酰化黄酮苷A确定化合物为槲皮素-3-O-[6”'-O-反式-对香豆酰基-β-D-葡萄糖基-(1→2)-α-L-鼠李糖苷]，英文名称(quercetin-3-O-[6″′-O-E-p-coumaroyl-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-L-rhamnopyranoside])。
酰化黄酮苷A的1H NMR如图8所示。
酰化黄酮苷A的13C NMR如图9所示。

Claims (10)

1.一种从银杏叶提取物中制备酰化黄酮苷A的方法，包括如下步骤：
(1)运用大孔吸附树脂对银杏叶提取物进行初步纯化，具体步骤为：将大孔吸附树脂预处理，装柱；取银杏叶提取物配制为供试品溶液a，上样，运用乙醇水洗脱；
(2)将步骤(1)中获得的含有酰化黄酮苷A的富集流份运用活性白土进行脱色，具体步骤为：将脱色剂预处理，备用；取大孔吸附树脂富集流份配制为供试品溶液b，加入预处理后的脱色剂，调节温度，时间进行脱色；
(3)将步骤(2)中获得的脱色流份运用Flash中压制备色谱进行富集纯化，获得较高纯度的酰化黄酮苷A粗品；具体步骤为：将脱色后的流份配制为供试品溶液c，运用Flash中压制备色谱进行分离，回收。
(4)将步骤(3)中获得酰化黄酮苷A粗品运用重结晶精制，即得酰化黄酮苷A。
2.根据权利要求1中所述的方法，其特征在于：所述的大孔吸附树脂为HPD-100型大孔吸附树脂。
3.根据权利要求1中所述的方法，其特征在于：所述预处理按以下操作进行：将大孔吸附树脂用温水清洗3-5次，除去部分大孔吸附树脂表面的致孔剂、交联剂；取95％的工业乙醇浸泡24h，再用95％工业乙醇以2BV/h洗脱流速通过大孔吸附树脂柱，直至流出液加水不出现白色混浊为止；用水洗脱至流出液无醇味，加入2～5％盐酸溶液浸泡大孔吸附树脂2～4h，加水用2-3BV/h的洗脱流速通过大孔吸附树脂层析柱，洗至流出液pH为中性；加入2～5％氢氧化钠溶液浸泡大孔吸附树脂2～4h，加水用2-3BV/h的洗脱流速通过大孔吸附树脂层析柱，洗至流出液pH为中性，即为可用树脂。
4.根据权利要求1中所述的方法，其特征在于：所述供试品溶液a配制方法为：精密称量25.0mg银杏叶提取物，置于10mL的棕色容量瓶中，甲醇定容至刻度线，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤后密封存放于4℃的环境备用；初步纯化工艺参数为上述样品溶液的pH值为5，采用稀盐酸调节pH值，上样液体积为100BV，上样流速为6BV/h，上样浓度为1.25mg/mL，除杂洗脱溶剂为8％乙醇水，洗脱体积20BV，洗脱溶剂为50％乙醇水，流速为2BV/h，洗脱体积为6BV。
5.根据权利要求1中所述的方法，其特征在于：所述供试品溶液b的配制方法为：精密称量40mg大孔吸附树脂50％乙醇水洗脱流份，置于10mL容量瓶中，用50％的乙醇水定容至刻度线，摇匀，备用；脱色剂前处理方法为：精密称取活性白土100g，加入95％乙醇浸泡后自然沉降，使上清液无浑浊为止，挥干试剂，放入50℃烘箱中烘干，储存备用。
6.根据权利要求1中所述的方法，其特征在于：脱色工艺参数为：脱色剂用量为0.32g/mL，脱色时间为5.8h，脱色温度为42℃进行试验；样品回收方法：采用离心机离心后抽滤旋干，离心条件为10000转，离心时间2分钟。
7.根据权利要求1中所述的方法，其特征在于：所述供试品溶液c制备方法：精密称量4.0g脱色后样品，置于10mL容量瓶中，用50％乙醇水定容至刻度线，溶液浓度为400mg/mL，溶解过程中可用超声助溶，采用0.45μm微孔滤膜过滤。
8.根据权利要求1中所述的方法，其特征在于：所述中压制备色谱条件：色谱柱C18 40μmirregular 80g，检测波长为254、315nm，单次进样5mL，采用乙腈(A)-水作为流动相，洗脱流速为60mL/min，洗脱梯度：0-2BV，5％-5％(A)，2-10BV，22％-22％(A)，10-14BV，25％-25％(A)，14-16BV，50％-50％(A)，16-18BV，50％-100％(A)。
9.根据权利要求1中所述的方法，其特征在于：所述重结晶方法为：取酰化黄酮苷A粗品，加入溶液体积与样品质量比为5:1的色谱级甲醇，常温静置挥发，溶剂体积为样品量1倍或有大量沉淀析出时，吸出上层溶液，剩余沉淀重复上述步骤一到两次，即得精制酰化黄酮苷A。
10.根据权利要求1中所述的方法，其特征在于：采用高效液相色谱对步骤(4)分离得到的酰化黄酮苷A进行纯度分析，检测的色谱条件：色谱柱Agilent Eclipse XDB C18(250mm×4.6mm，5μm)检测波长：315nm；柱温：25℃；进样10μL；流动相：乙腈-0.1％甲酸水溶液(20:80，V/V)30min；流速：1.0mL/min。
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