CN117568367A - 从甜樱桃中分离的PavSCPL基因、靶基因片段及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了从甜樱桃中分离的PavSCPL基因、靶基因片段及其应用。本发明提供了从甜樱桃中分离的PavSCPL基因，其CDS的多核苷酸序列为SEQ ID No.1所示；本发明还提供了PavSCPL基因靶基因片段，其核苷酸序列为SEQ ID No.2‑4所示。本发明系统分析了PavSCPL基因在甜樱桃果实软化中的分子功能，结果发现PavSCPL基因在不同果实硬度的甜樱桃种质资源中存在显著的差异表达，初步明确了该基因可能通过影响甜樱桃果实细胞壁成分‑果胶质降解而调控甜樱桃果实硬度的分子与生理机理，确定了所提供的从甜樱桃中分离的PavSCPL基因以及靶基因片段能够应用于调控甜樱桃果实硬度。

Description

从甜樱桃中分离的PavSCPL基因、靶基因片段及其应用
技术领域
本发明涉及SCPL家族基因，尤其涉及从甜樱桃(Prunus avium L.)中分离的PavSCPL基因及其在调控甜樱桃果实硬度中的应用，属于PavSCPL基因及其应用领域。
背景技术
欧洲甜樱桃(Prunus avium L.)，又名甜樱桃，是一种重要的经济果树，也是北方春季上市最早的鲜果，果实色泽鲜艳，风味鲜美，营养丰富，深受消费者喜爱。然而甜樱桃果实在成熟过程中容易软化变质，导致果实品质下降、不耐贮藏及货架期短，给果农、中间商和消费者造成严重的经济损失。因此，研究甜樱桃果实成熟软化的生理和分子机理，提高甜樱的耐储运和延长果实的货架期，一直是研究探讨的热点问题之一。然而关于调控甜樱桃果实成熟软化的分子机制匮乏，目前仅发现几个基因与甜樱桃果实成熟软化有关。
丝氨酸羧肽酶(serine carboxypeptidase,SCPs)及丝氨酸羧肽酶类蛋白(serinecarboxypeptidase-like proteins,SCPLs)是一个庞大的α/β水解酶家族，属于SC族羧肽酶中的S10家族(http://pfam.xfam.org/)，广泛存在于高等植物，少量存在于低等植物、细菌、真菌中。其主要特点是具有一个保守的催化三联体，活性位点由一个丝氨酸(被保守序列G-X-S-X-G包围)，一个天门冬氨酸和一个组氨酸组成。多项研究表明，SCP/SCPLs作为酰基转移酶，参与植物次级代谢物(辛酸酯类化合物、辅酶和花青素及其他类黄酮)的合成，在种子发育和萌发，籽粒重等植物生长过程、非生物胁迫(干旱、盐度、光照、氮和磷的缺乏)和抗病过程中起着至关重要的作用。鉴于丝氨酸羧肽酶及其类蛋白种类繁多和其特殊的结构，识别和鉴定甜樱桃中的丝氨酸羧肽酶及其类蛋白对于调控甜樱桃果实的硬度将具有重要的应用前景。
发明内容
本发明的目的之一是提供从甜樱桃中分离的PavSCPL基因；
本发明的目的之二是将所述的PavSCPL基因应用于调控甜樱桃果实硬度；
本发明的目的之三提供调控甜樱桃果实硬度的PavSCPL基因靶基因片段；
本发明的目的之四是将所述的PavSCPL基因靶基因片段应用于提高甜樱桃果实硬度。
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
本发明的一方面是提供了从甜樱桃中分离的PavSCPL基因，其CDS的多核苷酸序列为(a)、(b)或(c)所示：
(a)SEQ ID No.1所示的多核苷酸序列；
或(b)与SEQ ID No.1的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸序列，该多核苷酸编码的蛋白仍具有丝氨酸羧肽酶类蛋白的功能或活性；
或(c)与SEQ ID No.1的多核苷酸序列至少有80％以上同源性的多核苷酸序列，且该多核苷酸编码的蛋白仍具有丝氨酸羧肽酶类蛋白的功能或活性；优选的，与SEQ ID No.1的多核苷酸序列至少有85％以上同源性的多核苷酸序列，且该多核苷酸编码的蛋白仍具有丝氨酸羧肽酶类蛋白的功能或活性；更优选的，与SEQ ID No.1的多核苷酸序列至少有90％以上同源性的多核苷酸序列，且该多核苷酸编码的蛋白仍具有丝氨酸羧肽酶类蛋白的功能或活性。
本发明所提供的从甜樱桃中分离的PavSCPL基因具有调控甜樱桃果实硬度的应用；作为PavSCPL基因在调控甜樱桃果实硬度的一种参考的实施方案，包括采用基因敲除或基因编辑技术等手段，将甜樱桃中的PavSCPL基因进行沉默或敲除，使甜樱桃果实硬度提高。
本领域人员可以采用常规的基因敲除或基因编辑技术等常规的方法，将甜樱桃中的PavSCPL基因进行突变或敲除实现沉默PavSCPL基因的目的，譬如构建PavSCPL基因敲除载体或采用基因编辑技术构建CRISPR/Cas9基因编辑载体等，这些方法均为本领域技术人员所熟练掌握。
本发明还公开了含有所述PavSCPL基因的表达载体；优选的，所述表达载体可以是PavSCPL基因的基因编辑载体或敲除载体。
本发明进一步公开了含有所述PavSCPL基因的重组宿主细胞或重组菌；其中，所述重组菌包括但不限于重组大肠杆菌或重组植物细胞。
本发明进一步提供了一种培育果实硬度提高的甜樱桃新品种的方法，其特征在于，包括：(1)构建含有所述PavSCPL基因的基因编辑载体或敲除载体；(2)将所构建的基因编辑载体或敲除载体转化到甜樱桃植物组织或细胞中，使甜樱桃中的PavSCPL基因被敲除或进行突变；(3)培育筛选得到果实硬肉提高的转基因甜樱桃新品种。
本发明的另一方面是提供了能够提高甜樱桃果实硬度的PavSCPL基因靶基因片段，其核苷酸序列分别为SEQ ID No.2、SEQ ID No.3或SEQ IDNo.4所示；优选的，所述靶基因片段的核苷酸序列为SEQ ID No.3所示。
本发明还公开了含有所述的PavSCPL基因靶基因片段的RNA干扰载体以及含有所述RNA干扰载体的宿主细胞。
此外，由SEQ ID No.2、SEQ ID No.3或SEQ ID No.4所示的靶基因片段所转录的dsRNA也包含在本发明的保护范围之内。
本发明所提供的PavSCPL基因靶基因片段能够应用于提高甜樱桃果实的硬度，包括以下步骤：(1)构建含有所述PavSCPL基因靶基因片段的RNA干扰载体；(2)将所构建的RNA干扰载体转化到甜樱桃植物组织或细胞中；(3)筛选获得果实的硬度提高的转基因甜樱桃植物。
本发明进一步公开了一种培育果实硬度提高的转基因甜樱桃新品种的方法，包括以下步骤：(1)构建含有所述PavSCPL基因靶基因片段的RNA干扰载体；(2)将所构建的RNA干扰载体转化到甜樱桃植物或甜樱桃植物细胞中；(3)筛选获得果实硬度提高的转基因甜樱桃新品种。
本发明从甜樱桃中分离得到PavSCPL基因并系统分析了PavSCPL基因在甜樱桃果实软化中的分子功能，结果发现PavSCPL基因在不同果实硬度的甜樱桃种质资源中存在显著的差异表达，初步明确了PavSCPL基因可能通过影响甜樱桃果实细胞壁成分-果胶质降解而调控甜樱桃果实硬度的分子与生理机理，为解析甜樱桃果实成熟软化的分子机理奠定理论基础。
本发明所涉及到的术语定义
除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。虽然在本发明的实践或测试中可使用与本文所述者类似或等效的任何方法、装置和材料，但现在描述优选方法、装置和材料。
术语“同源性”，指与天然核酸序列的序列相似性。“同源性”包括与本发明的调控片段的核苷酸序列具有优选地85％或更高，更优选地90％或更高，以及最优选地95％或更高同一性的核苷酸序列。同源性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同源性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同源性。
术语“互补的”在此指的是两种包括反向平行核苷酸序列的核苷酸序列，反向平行核苷酸序列能在反向平行核苷酸序列的互补碱基残基之间形成氢键后彼此相互配对。本领域已知的是，当都从5’到3’的方向看序列时，两种互补链的核苷酸序列是彼此反向互补的。本领域也已知的是，两种在给定的条件组下能彼此杂交的序列不必必须是100％完全互补的。
术语“严谨杂交条件”意指在所属领域中已知的低离子强度和高温的条件。通常，在严谨条件下，探针与其靶序列杂交的可检测程度比与其它序列杂交的可检测程度更高(例如超过本底至少2倍)。严谨杂交条件是序列依赖性的，在不同的环境条件下将会不同，较长的序列在较高温度下特异性杂交。通过控制杂交的严谨性或洗涤条件可鉴定与探针100％互补的靶序列。对于核酸杂交的详尽指导可参考有关文献(Tijssen,Techniques inBiochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes,"Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acidassays.1993)。更具体的，所述严谨条件通常被选择为低于特异序列在规定离子强度pH下的热熔点(Tm)约5-10℃。Tm为在平衡状态下50％与目标互补的探针杂交到目标序列时所处的温度(在指定离子强度、pH和核酸浓度下)(因为目标序列过量存在，所以在Tm下在平衡状态下50％的探针被占据)。严谨条件可为以下条件：其中在pH 7.0到8.3下盐浓度低于约1.0M钠离子浓度，通常为约0.01到1.0M钠离子浓度(或其它盐)，并且温度对于短探针(包括(但不限于)10到50个核苷酸)而言为至少约30℃，而对于长探针(包括(但不限于)大于50个核苷酸)而言为至少约60℃。严谨条件也可通过加入诸如甲酰胺的去稳定剂来实现。对于选择性或特异性杂交而言，正信号可为至少两倍的背景杂交，视情况为10倍背景杂交。例示性严谨杂交条件可如下：50％甲酰胺，5×SSC和1％ SDS，在42℃下培养；或5×SSC，1％ SDS，在65℃下培养，在0.2×SSC中洗涤和在65℃下于0.1％ SDS中洗涤。所述洗涤可进行5、15、30、60、120分钟或更长时间。
术语“宿主细胞”或“重组宿主细胞”意指包含本发明多核苷酸的细胞，而不管使用何种方法进行插入以产生重组宿主细胞，例如直接摄取、转导、f配对或所属领域中已知的其它方法。外源性多核苷酸可保持为例如质粒的非整合载体或者可整合入宿主基因组中。
术语“多核苷酸”或“核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括PNA(肽核酸)、在反义技术中所用的DNA类似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等)。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体(包括(但不限于)简并密码子取代)和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选(或所有)密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代。
术语“转基因”和“重组体”在此指的是其中已经被引入异源核酸分子的宿主细胞或生物体例如细菌或植物细胞(例如植物)。核酸分子可以被稳定地整合到宿主的基因组中，或者核酸分子也可以以染色体外分子的形式存在。这样一种染色体外分子可以是自我复制的。转化细胞、组织或植物被理解为不仅包括转化过程的终末产物，还包括其转基因子代。“未转化”、“未转基因”、或“未重组的”宿主指的是野生型生物体例如细菌或植物，它不包含异源核酸分子。
术语“RNA干扰(RNA interference,RNAi)”意指通过外源或内源性的双链RNA在细胞内诱导同源序列的基因表达沉默的现象。
附图说明
图1为甜樱桃PavSCPL蛋白的进化树。
图2为PavSCPL基因在不同果实硬度的种质资源的(硬质型、硬肉型和软肉型)叶、花和果实中表达情况。
图3为PavSCPL蛋白的亚细胞定位。
图4为瞬时沉默甜樱桃果实PavSCPL基因提高了果实硬度；A.PavSCPL基因的沉默效率检测；B.果实硬度统计；C.果实表型观察；D.细胞壁降解酶活检测；E.细胞壁降解相关基因表达量检测。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实验例1PavSCPL基因的分离、进化树分析、表达模式分析、亚细胞定位分析以及功能验证实验
1实验方法
1.1试验材料
植物材料：欧洲甜樱桃栽培品种‘黑砂糖锦’、‘萨米脱’和‘红鲁比’来自中国农业科学院郑州果树研究所樱桃种质资源圃，砧木为‘ZY-1’，树龄11年，树体生长正常。
烟草在人工气候箱培养。
1.2PavSCPL基因的进化树分析
利用MEGA 6.0软件对甜樱桃PavSCPL基因和其他物种中已经报道的SCPL基因(葡萄、水稻、小麦、番茄、梨、苹果、桃等)进行氨基酸序列的同源比对分析，并构建其进化树。
1.3PavSCPL基因的表达模式分析
收集不同发育期的‘Ruby’，‘Summit’和‘Chunlu’中的叶片、花和果实，利用RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(天根生物科技有限公司，北京，中国)提取经DNaseI酶消化的总RNA，并反转录成cDNA。设计特异性引物对PavSCPL-q-F/R(表1)。
表1本发明所使用的引物信息
PavSCPL-F ATGGCATCTACTTTTTCTCACATTTC
PavSCPL-R TCATTTGGGAGCAATTCTTTCGAC
PavSCPL-RNAi-1-F AGTAAGGTTACCGAATTCGACATCCGCCACGACGAAGAA
PavSCPL-RNAi-1-R GAGCTCGGTACCGGTACCATGCACAAGCTTCTCCACCCT
PavSCPL-RNAi-2-F AGTAAGGTTACCGAATTCCTGCTTCCGGGCCTTCTGTTC
PavSCPL-RNAi-2-R GAGCTCGGTACCGGTACCTCTTCGTCGTGGCGGATGTCAC
PavSCPL-RNAi-3-F AGTAAGGTTACCGAATTCTTGTTTCATGCAGCTCTACGG
PavSCPL-RNAi-3-R GAGCTCGGTACCGGTACCACTCAGCTATGGCCAGTTTTCC
PavSCPL-g-F GCCATGGATGGCATCTACTTTTTCTCAC
PavSCPL-g-R GACTAGTTTTGGGAGCAATTCTTTCGAC
PavSCPL-q-F CTGCTTCCGGGCCTTCTGTT
PavSCPL-q-R TCTTCGTCGTGGCGGATGTC
PavPME-q-F GCCGAGCTCCAAGAAGTCATCT
PavPME-q-R CGACAACTTAGAGTTCTCGTA
PavPG-q-F ATCACCTTCCGCATTGCTG
PavPG-q-R TCACCTTAATGTTGTTGGAG
PavPGI-q-F CAGCGCTCTCCGAGCTCTGCAA
PavPGI-q-R CGGCAAGTCACCGACTTGGGT
PavEXP1-q-F CTGTATCAAGGTGGTCAGACAGA
PavEXP1-q-R TCACCAAGAACCGGAACTGTAG
PavPL18-q-F AGCATCAATGACTCTGTTTCTAG
PavPL18-q-R TGAATCCGTGACCACGTAAATC
Pavactin-q-F GCTGGTCGTGACCTCACAGAT
Pavactin-q-R CCAATTGTGATTACTTGGCCA
进行3次独立的荧光定量PCR，分析甜樱桃PavKLUH基因时空差异表达。以甜樱桃的actin(Pav_sc0002247.1_g030.1.mk)为内参进行分析。进行3次生物学重复，取平均值。采用2-ΔΔct方法计算基因的相对表达量。
1.4PavSCPL基因的亚细胞定位分析
以甜樱桃果实的cDNA为模板，设计PavSCPL基因编码区序列的特异性引物PavSCPL-g-F\R(表1)，进行PCR扩增，获得PavSCPL基因片段，利用同源重组的方法将PavSCPL基因(去除终止密码子)构建到亚细胞定位载体pCAMBIA1302-GFP上Nco I和Spe I酶切位点之间，获得p-GFP-PavSCPL重组载体，电击转化根癌农杆菌，通过农杆菌介导的方法注射本生烟的叶片，2天后，通过荧光共聚焦显微镜观察PavSCPL-GFP的亚细胞位置。
1.5VIGS-PavSCPL重组载体与VIGS技术瞬时转化甜樱桃果实
靶基因片段的长度(300bp-500bp)及序列信息是影响TRV病毒诱导基因沉默本生烟效率的关键因素，因此本实验针对PavSCPL设计了3条靶标序列，分别为PavSCPL-1(SEQID No.2)、PavSCPL-2(SEQ ID No.3)、PavSCPL-3(SEQ ID No.4)。
pTRV2-PavSCPL载体的构建采用In-Fusion Cloning技术。分别设计带有16个重叠区域(与经EcoRI和KpnI线性化的pTRV2片段互为反向互补的接头)的PavSCPL基因特异性引物对PavSCPL-RNAi-F1-3/R1-3、(表1)。以甜樱桃cDNA为模板分别扩增PavSCPL基因的靶标片段，利用In-FusionTM HD Cloning kit(Clontech,CA,United States)分别将靶标片段构建接到经EcoRI和KpnI双酶切线性化的pTRV2构建上，分别命名为pTRV2-PavSCPL并转入大肠杆菌DH5α感受态中，挑取阳性菌株，经PCR鉴定，双酶切鉴定和测序正确后，分别将pTRV2-PavSCPL载体转入农杆菌菌种GV3101中备用。甜樱桃果实的VIGS方法参照齐希梁等的方法(齐希梁,李明,刘聪利,&宋露露.(2018).TRV介导欧洲甜樱桃果实VIGS体系的建立.果树学报,35(11),1309-1315.)进行，并进行六次生物学重复。
1.6实时荧光定量PCR(qPCR)检测分析
提取甜樱桃果实样品的总RNA，并反转录成cDNA，以甜樱桃的actin(Pav_sc0002247.1_g030.1.mk)基因为内参，对不同样品的cDNA含量进行调节，然后利用PavSCPL及细胞壁降解相关基因特异性引物对(表1)检测沉默后PavSCPL基因及细胞壁降解相关基因的表达水平。并进行三次生物学重复，取平均值。
1.7果实硬度测量和酶活测定
果实硬度GY-4型硬度计测定，单位为kg·cm-2。每次随机选取6个果实(不削果皮)，每个果实不同部位选2个点测定，P/2柱状探头(直径1mm)，测前速度为0.5mm·s-1，测定速度为1mm·s-1，测后速度为1mm·s-1，穿刺深度为10mm，并重复三次，取平均值。
果胶甲酯酶(PME)、多聚半乳糖醛酸酶(PG)、β-半乳糖苷酶(β-GAL)、果胶裂解酶(PL)和α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(α-L-Af)的提取参照曹建康等(曹建康,姜微波,赵玉梅.果蔬采后生理生化实验指导[M].中国轻工业出版,2007.)的方法进行。DNS比色法测定PME和PG的活性，咔唑比色法测定PL的活性。酶标法检测β-GA和α-L-Af的活性，每次随机选取6个果实进行测定，并重复三次，取平均值。
1.8数据处理
使用Microsoft Excel 2010软件对所获数据处理并绘图；使用SPSS17.0软件进行相关性分析和差异显著性(P<0.05)分析。
2实验结果
2.1甜樱桃PavSCPL的系统进化树分析。
为了确定甜樱桃的PavSCPL基因与其他物种的SCPL基因的进化关系，本实验构建了其SCPL系统进化树(图1)，结果显示：PavSCPL能与其他物种的SCPL蛋白聚合在一起，与桃、梨、梅花和苹果具有高度同源性，同源性达90％以上，但是与上述相似性极高的物种SCPL的功能至今未见报道。
2.2PavSCPL基因表达模式分析。
为了分析甜樱桃的PavSCPL基因时空差异表达，本实验利用实时荧光定量(qRT-PCR)分析了三种不同果实硬度的甜樱桃栽培品种(硬质型、硬肉型和软肉型)中叶片、花和不同果实发育阶段的基因表达情况。
表达模式分析结果(图2)显示，PavSCPL基因在硬质型种质资源‘Ruby’中不表达，在硬肉型种质资源‘Summit’和软肉种质资源‘Chunlu’中都表达，而且软肉种质资源‘Chunlu’中的PavSCPL基因的表达量显著高于硬肉型种质资源‘Summit’基因表达。在‘Chunlu’和‘Summit’中，PavSCPL基因在叶片、花和果实中均表达，但存在显著的表达差异，在果实中表达量最高，而且一直维持较高的水平。在果实生长发育早期，PavSCPL基因表达逐渐升高。随后在盛花后35-42天后，PavSCPL基因的表达量最高，随后缓慢降低，但是一直维持较高的水平，这暗示PavSCPL基因可能在果实生长发育中起关键作用。
2.3PavSCPL蛋白的亚细胞定位。
为了确定PavSCPL蛋白在细胞的何种部位发挥作用，本实验构建了PavSCPL蛋白在CaMV 35S启动子下启动表达融合蛋白PavSCPL-GFP。激光共聚焦显微镜观察发现PavSCPL蛋白均定位在细胞质中(图3)，在细胞质中发挥作用。
2.4瞬时沉默甜樱桃果实PavSCPL基因对果实硬度的影响。
利用本发明人研究团队成功建立的TRV病毒诱导基因沉默甜樱桃果实的转化体系。将含有TRV::00(空白对照)和TRV::PavSCPL载体的农杆菌菌株GV3101分别侵染甜樱桃栽培种‘Heishatangjin’。侵染15天后提取果实的mRNA进行表达量检测，结果显示含有靶基因片段PavSCPL-2的TRV::PavSCPL侵染的甜樱桃果实中PavSCPL基因的表达量低于TRV::00侵染的甜樱桃果实(图4A)，基因沉默效率达90％以上，暗示PavSCPL基因被有效的沉默。而含有靶基因片段PavSCPL-1和PavSCPL-3的TRV::PavSCPL的沉默效率较低，不足50％。
测量和统计分析TRV::PavSCPL和TRV::00侵染后21天和28天甜樱桃果实硬度结果显示：TRV::PavSCPL侵染的甜樱桃果实硬度显著高于TRV::00侵染的果实硬度(图4B-D)。细胞壁降解相关酶的酶活检测发现，TRV::PavSCPL侵染的甜樱桃果实中的果胶甲酯酶(PME)和多聚半乳糖醛酸酶(PG)的活性显著低于TRV::00侵染的果实中对应的酶活。而TRV::PavSCPL侵染的甜樱桃果实β-半乳糖苷酶(β-GAL)、果胶裂解酶(PL)和α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(α-L-Af)的酶活与TRV::00侵染的果实的对应酶活没有显著差异(图4E)。此外，TRV::PavSCPL侵染的甜樱桃果实中PavPME(果胶甲酯酶)，PavPG(多聚半乳糖醛酸酶)和PavEXPA2(扩张蛋白)基因的表达量显著低于TRV::00侵染的果实中对应的基因表达，TRV::PavSCPL侵染的甜樱桃果实中PavPGI(多聚半乳糖醛酸酶抑制剂)基因的表达量显著高于TRV::00侵染的果实中基因表达。综上表明PavSCPL基因调控甜樱桃果实硬度，在甜樱桃果实软化过程中起重要作用。

Claims (10)

1.从甜樱桃(Prunus avium L.)中分离的PavSCPL基因，其特征在于，其CDS的多核苷酸序列为(a)、(b)或(c)所示：
(a)SEQ ID No.1所示的多核苷酸序列；
或(b)与SEQ ID No.1的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸序列，该多核苷酸编码的蛋白仍具有丝氨酸羧肽酶类蛋白的功能或活性；
或(c)与SEQ ID No.1的多核苷酸序列至少有80％以上同源性的多核苷酸序列，且该多核苷酸编码的蛋白仍具有丝氨酸羧肽酶类蛋白的功能或活性；优选的，与SEQ ID No.1的多核苷酸序列至少有85％以上同源性的多核苷酸序列，且该多核苷酸编码的蛋白仍具有丝氨酸羧肽酶类蛋白的功能或活性；更优选的，与SEQ ID No.1的多核苷酸序列至少有90％以上同源性的多核苷酸序列，且该多核苷酸编码的蛋白仍具有丝氨酸羧肽酶类蛋白的功能或活性。
2.权利要求1所述的PavSCPL基因在调控甜樱桃果实硬度中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，包括：采用基因敲除或基因编辑技术等手段，将甜樱桃中的PavSCPL基因进行沉默或敲除，使甜樱桃果实硬度提高。
4.含有权利要求1所述的PavSCPL基因的表达载体；优选的，所述表达载体是PavSCPL基因的打靶载体或基因编辑载体。
5.含有权利要求1所述PavSCPL基因的重组宿主细胞或重组菌。
6.一种培育果实硬度提高的甜樱桃品种的方法，其特征在于，包括：(1)构建含有权利要求1所述PavSCPL基因的基因编辑载体或敲除载体；(2)将所构建的基因编辑载体或敲除载体转化到甜樱桃组织或细胞中，使甜樱桃中的PavSCPL基因被敲除或进行突变；(3)培育筛选得到果实硬肉提高的转基因甜樱桃新品种。
7.提高甜樱桃果实硬度的PavSCPL基因靶基因片段，其特征在于，其核苷酸序列分别为SEQ ID No.2、SEQ ID No.3或SEQ ID No.4所示；优选的，所述靶基因片段的核苷酸序列为SEQ ID No.3所示。
8.由权利要求7所述的PavSCPL基因靶基因片段所转录的dsRNA。
9.权利要求7所述的PavSCPL基因靶基因片段在提高甜樱桃果实硬度中的应用，其特征在于，包括：(1)构建含有所述PavSCPL基因靶基因片段的RNA干扰载体；(2)将所构建的RNA干扰载体转化到甜樱桃植物组织或细胞中；(3)筛选获得果实的硬度提高的转基因甜樱桃植物。
10.一种培育果实硬度提高的转基因甜樱桃新品种的方法，其特征在于，包括：(1)构建含有权利要求7所述PavSCPL基因靶基因片段的RNA干扰载体；(2)将所构建的RNA干扰载体转化到甜樱桃植物组织或细胞中；(3)筛选获得果实硬度提高的转基因甜樱桃品种。
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