CN117568328A - 一种固定化酶及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及酶固定化领域，涉及一种固定化酶及其制备方法，包括：在反应容器中加入不同等电点的载体和游离酶溶液，搅拌，调节pH，得到络合混合液；向络合混合液中加入助剂，搅拌至溶解完全，得到水凝胶预聚混合液；对水凝胶预聚混合液进行紫外光辐射，后得到所述固定化酶。与现有技术相比，本发明具有保证酶活性的同时解决了包埋法固定化酶易泄露、反应条件温和、循环次数良好等优点。
Description
技术领域
本发明涉及酶固定化领域，尤其是涉及一种固定化酶及其制备方法。
背景技术
酶是生物体运行的重要组成部分，是参与人体内代谢过程和维持生理机能的天然催化剂。由于酶对底物具有高度特异性和高度催化效能，且酶的活性中心由三维结构肽链的堆叠及盘绕组成，该结构对外界条件的变化会做出迅速反应所以被广泛应用于生物工程、食品、医药等领域。但是pH值、温度、盐浓度等外界因素会导致酶的活性不稳定，使得酶在应用和存储过程中的效率降低，因此对酶进行固定化，使其结构具有高度稳定性，对于酶催化领域具有重要意义。
现有酶固定化方法包括吸附法、共价结合法、交联法、包埋法等。吸附法主要是通过酶与载体之间的相互作用力来达到固定，包括物理吸附和离子交换吸附，但是该方法相互作用的结合力较弱，存在酶与载体分离的情况，导致催化产物受到污染。包埋法是借助化学(如交联、聚合)或者物理(物理的凝胶化)的方法将酶固定在载体中的过程，酶分子通过聚合物形成的凝胶载体而被包埋于其中，从而获得固定化酶。该方法反应条件温和、不会影响酶的构象、酶活保留率高，但是该方法酶容易渗漏并且稳定性不够、重复回收利用率低。
单一的固定化方法存在一定缺陷，例如：吸附法中的作用力弱、包埋法中酶易泄露、交联法中使用的交联剂会导致酶活下降、价法中反应条件复杂且会改变酶的结构、影响酶的活性等。中国专利CN107746841B提供了一种两性离子磁性复合水凝胶固定化酶载体及制备方法，固定化的方法主要是共价交联法，将交联剂与酶和聚合单体连接，并包埋了磁性粒子为了便于回收，但是其改变了酶的结构，对酶的活性有一定影响。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种固定化酶及其制备方法，本发明将酶固定化方法中的吸附法与包埋法协同作用，用合成聚合物作为酶的载体，利用二者等电点不同，使酶和载体带上相反电荷，两者相互吸附，再通过紫外光辐射将吸附的载体转化成水凝胶，利用包埋法和吸附法两个方法进行结合加强酶固定化的作用力且反应条件温和，便于操作。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
一种固定化酶的制备方法，包括以下步骤：
S1：在反应容器中加入不同等电点的载体和游离酶溶液，搅拌，调节pH为6.5±0.1，得到络合混合液；
S2：向络合混合液中加入助剂，搅拌至溶解完全，得到水凝胶预聚混合液；
S3：对水凝胶预聚混合液进行紫外光辐射，后得到所述固定化酶。
进一步地，步骤S1中，所述载体为正点载体，包括甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵、丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵、2-(二甲氨基)甲基丙烯酸乙酯、2-(二甲氨基)丙烯酸乙酯、N-[(3-(二甲氨基)丙基]甲基丙烯酰胺或N-[(3-二甲氨基)丙基]丙烯酰胺的一种。
进一步地，步骤S1中，所述载体投料为0.5-2M，优选为1M。
进一步地，步骤S1中，所述游离酶溶液为游离脂肪酶溶液。
进一步地，步骤S2中，所述助剂包括引发剂和交联剂，所述引发剂与载体的摩尔比为0.5-5:1，优选为1:1，所述交联剂与载体的摩尔比为1-10:1，优选为10:1。
进一步地，步骤S3中，所述紫外光辐射的光源为120-130W高压汞灯，优选为125W。
进一步地，所述紫外光辐射的高度为8-12cm，优选为10cm，辐射时间为30min。
进一步地，步骤S3还包括将得到的固定化酶进行研磨后过筛网粉碎，得到固定化酶颗粒。
进一步地，所述筛网尺寸为100-300目，优选为200目，研磨方式为手动研磨。
一种固定化酶，采用上述的方法制备而成。
本发明合成聚合物一方面可以调控结构，另一方面通过不同单体的官能团对酶发挥特定功能。合成聚合物结构和作用便于调整，可以根据不同的酶来进行聚合物的结构设计。同时水凝胶是能被水溶胀但不溶于水的三维网状结构的高分子聚合物，由于水凝胶具有储存少量水的性质，为生物酶存活提供温和的环境，所以将水凝胶作为固定化酶的重要载体。
与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：
(1)本发明将包埋法和吸附法两个方法进行结合形成固定化酶：两种方法的反应条件温和，对脂肪酶的三维构象不会产生影响，保证了酶的活性，同时本发明解决了包埋法固定化酶易泄露的问题，通过电荷作用，将负电荷的脂肪酶富集于带有正电单体上，增加了物理作用力，并且通过聚合方法，形成三维网状结构，使脂肪酶固定在水凝胶内部。
(2)本发明选用载体具有通用性：通过调节pH且pH范围对固载酶的酶活没有影响的条件下，使酶带有正电荷或负电荷，选取与酶带有相反电荷的单体进行凝聚，原位聚合方法得到固定化酶。
(3)本发明采用紫外光辐射制备水凝胶方法，此方法不需要除氧、加热，操作流程简便：所用光源对对脂肪酶的活性影响很小，反应时间只需要15-30分钟，便于控制，本方法反应过程在水相中进行，无需添加除引发剂、交联剂其他溶剂，反应条件温和。
(4)本发明制备的固定化酶重复使用6次后，酶的活力依然保持60％以上，具有良好的稳定性，可以批量制备固定化酶，具有良好的市场应用前景。
附图说明
图1为实施例1-6制备的固定化酶的酶活对比图；
图2为实施例1-6中正电载体转化率计算参考核磁图；
图3为实施例1-6中正电载体产率计算参考核磁图；
图4为实施例1-6洗液与游离脂肪酶的酶活结果图；
图5为载酶量对固定化酶酶活的影响图；
图6为实施例1制备的固定化酶在不同温度下酶活结果图；
图7为循环使用次数对实施例1制备的固定化酶的酶活影响；
图8为循环使用次数对未经固定化处理游离脂肪酶的酶活影响。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
以下实施例以本发明上述技术方案为前提进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
以下各实施例中，如无特别说明的原料试剂或处理技术，则表明其均为本领域的常规市售产品或常规处理技术。
实施例1
本实施例提供一种固定化酶及其制备方法：
(1)在10ml的螺口瓶中加入正电载体(本实施例为甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵(METAC)),使其在总溶液(水凝胶预聚混合液)中的浓度为1M，加入定量脂肪酶(脂肪酶(lipase)Type VII，来源于皱褶假丝酵母Sigma-Aldrich)溶液(1740μg/ml)，使其在总溶液(水凝胶预聚混合液)中浓度为1M，后用NaOH溶液调节pH至6.5，形成络合物混合液；
(2)然后向络合物混合液中加入660μl引发剂：2-羟基-2-甲基-1-苯基-1-丙酮(HMPP)，使其在总溶液(水凝胶预聚混合液)中的浓度为0.1M，加入去离子水，使混合液总量达到2ml，加入30mg交联剂：N,N’-亚甲基双丙烯酰胺(MBA)，使其在总溶液(水凝胶预聚混合液)中的浓度为0.0608M，磁力搅拌20min(300r/min温度为室温)，得到水凝胶预聚混合液；
(3)室温下，将螺口瓶置于距紫外灯10cm处并于紫外灯灯芯齐平(紫外光辐射光源为125W高压汞灯)，在磁力搅拌300r/min下照射30min，得到负载脂肪酶的甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵的水凝胶固定化酶(Lipase@M1)，后将产品放入200目筛网中手动研磨筛选。
实施例2
本实施例提供一种固定化酶及其制备方法，与实施例1不同之处在于：
步骤(1)中，选择的正电载体为：丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵(DAC)，其他操作过程均同实施例1，得到负载脂肪酶的丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵的水凝胶固定化酶(Lipase@M2)。
实施例3
本实施例提供一种固定化酶及其制备方法，与实施例1不同之处在于：
步骤(1)中，选择的正电载体为：2-(二甲氨基)甲基丙烯酸乙酯(DMAEMA)，其他操作过程均同实施例1，得到负载脂肪酶的2-(二甲氨基)甲基丙烯酸乙酯的水凝胶固定化酶(Lipase@M5)。
实施例4
本实施例提供一种固定化酶及其制备方法，与实施例1不同之处在于：
步骤(1)中，选择的正电载体为：2-(二甲氨基)丙烯酸乙酯(DMAEA)，其他操作过程均同实施例1，得到负载脂肪酶的2-(二甲氨基)丙烯酸乙酯的水凝胶固定化酶(Lipase@M6)。
实施例5
本实施例提供一种固定化酶及其制备方法，与实施例1不同之处在于：
步骤(1)中，选择的正电载体为：N-[(3-(二甲氨基)丙基]甲基丙烯酰胺(DMAPMA)，其他操作过程均同实施例1，负载脂肪酶的N-[(3-(二甲氨基)丙基]甲基丙烯酰胺的水凝胶固定化酶(Lipase@M7)。
实施例6
本实施例提供一种固定化酶及其制备方法，与实施例1不同之处在于：
步骤(1)中，选择的正电载体为：N-[(3-二甲氨基)丙基]丙烯酰胺(DMAPAA)，其他操作过程均同实施例1，负载脂肪酶的N-[(3-二甲氨基)丙基]丙烯酰胺的水凝胶固定化酶(Lipase@M8)。
性能测试实验：
1、酶活性测试：在400nm下测定固定化酶与反应底物混合液的吸光度，计量方法以1min内固定化脂肪酶催化水解底物对硝基苯丁酸脂(4-NPB)产生1μmol对硝基苯酚所需的酶量为1个酶活单位(U)。具体测试步骤如下：
测试方法：
(1)水解底物：取1.0mg对硝基苯丁酸脂(4-NPB)溶于500μL丙酮溶液中，随后加入助剂(用于稳定体系pH)：吗啉乙磺酸(MES)缓冲液(pH为6.5)以及表面活性剂：聚乙二醇叔辛基苯基醚(Triton X-100)(30％)溶液，最后补充去离子水至溶液总量为10mL。(溶液中各物质的最终浓度为：4-NPB为0.5mM，TritonX-100为19.3mM，MES缓冲液浓度为10mM，pH为6.5)因4-NPB存在缓慢水解过程，故反应底物每次均现用现配。
(2)固定化脂肪酶催化水解反应：取10ml制得的水解底物于冻存管中，随后加入34.3mg实施例1-6制得的固定化酶得到底物反应液，(其中，固定化酶中包埋的酶在水解底物的浓度为0.32μg/ml)磁力搅拌20min，转速为300r/min，取1000μL底物反应液移至石英比色皿中。利用紫外分光光度计，控制温度在25℃，每隔一分钟检测底物反应液在400nm处吸收值，总时长为10min。
根据下述公式计算酶活(U)
实验结果由图1所示，其中Lipase为未固定化的游离脂肪酶，由图可知实施例1制备的负载脂肪酶的甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵的水凝胶固定化酶(Lipase@M1)在25℃，pH＝6.5的条件下，相对酶活可达到90％以上；实施例3制备的负载脂肪酶的2-(二甲氨基)甲基丙烯酸乙酯的水凝胶固定化酶(Lipase@M5)和实施例5制备的负载脂肪酶的N-[(3-(二甲氨基)丙基]甲基丙烯酰胺的水凝胶固定化酶(Lipase@M7)的相对酶活可达到80％以上。
2、正电载体转化率及其形成水凝胶的产率测试：
首先，将实施例1-6制备的固定化酶放入5ml去离子水中，浸泡20小时，取出浸泡的固定化酶，收集洗液，测试洗液中游离酶的浓度：
采用Thermo Scientific Pierce BCA蛋白定量分析试剂盒测定洗液中酶的浓度。该试剂盒利用的是蛋白质的双缩脲反应和显色反应：在碱性条件下，蛋白质可将Cu2+还原成Cu+，Cu+与BCA试剂形成紫色络合物，该紫色络合物在562nm处具有很强的吸收值。在一定的蛋白质浓度范围内，其吸光度的大小和蛋白质的浓度具有良好的线性关系，通过与标准曲线对比，即可计算洗液中酶的浓度。
首先绘制标准曲线：将检测试剂盒中的BCA试剂A和试剂B按照50：1的比例进行混合得到绿色澄清的工作液，取各个稀释浓度的牛血清白蛋白(BSA)各200μl加入到标记好的试剂瓶中，随后向每个试剂瓶中加25μl的工作液，充分混合，在60℃烘箱中恒温30分钟，随后冷却至室温，用紫外分光光度测得每个试剂瓶中的样品在562nm处的吸光度，将各个样品在562nm处的吸光值减去空白标准品(去离子水)在562nm处的吸光值，随后用该吸光值与对应的BSA浓度(μg/mL)作图，即得到标准曲线；
然后，检测洗液中酶的浓度：取相同体积的未知浓度的酶溶液200μl与25μl工作液混合、显色，测其在562nm处的紫外吸光度，与利用BSA测得的标准曲线进行比较，即可得到洗液中酶的浓度，结果如表1所示；
测试正电载体转化率变成水凝胶的产率：
对洗液进行冻干，利用3-(三甲基硅基)氘代丙酸钠盐内标法测定单体转化率和产率，步骤如下：从洗液中吸取1000μl溶液，进行冻干；向冻干产物加入580μl重水及20μl 3-(三甲基甲硅烷基)丙酸-d4钠盐(TSP)溶液(20mM)，进行溶解，对该溶液进行核磁共振氢谱测试。
利用核磁共振氢谱表征合成产物，计算正电载体转化率、水凝胶产率(水凝胶产率是指正电载体形成水凝胶的产率，正电载体转化率是正电载体打开双键的与没有打开双键的比率)，核磁共振氢谱测试温度为25℃，扫描次数为32次，测试仪器为400MHz超导傅立叶变换核磁共振波谱仪(型号：AVANCEⅢ400MHz，瑞士布鲁克公司)。
(1)正电载体转化率计算：
取1000μL光引发聚合反应后的清洗水凝胶的洗液，冻干后加入580μL重水使其完全溶解，并加入20μlTSP作为内标，转移至核磁管中送核磁氢谱检测，未聚合单体在核磁谱图(图2)中的6.20～6.30ppm处具有碳碳双键特征峰(a峰)，将该特征峰的积分值与内标TSP(0ppm)的积分值按照比例计算可得到未聚合单体量，未交联的交联剂在核磁图(图2)中的6.10～6.20ppm处具有碳碳双键特征峰(b峰)，c峰为未聚合单体和未交联的交联剂的碳碳双键特征峰的重叠峰且c峰积分值为a、b峰积分值之和。将2mL反应液中单体总投料量(nin)减去未聚合单体量(nu)可计算得到单体转化量，将其除以总投料量即可得单体转化率(conversion)，计算公式如下：
其中nTSP为TSP内标的物质的的量，ITSP为TSP在0ppm处的积分值，IMETAC为METAC单体碳碳双键单个H积分值(即图中平均积分值0.14)；
(2)正电载体变为纳米凝胶产率计算：
取1000μL光引发聚合反应后的清洗水凝胶的洗液，冻干后加入重水使其完全溶解，并加入20mM的TSP内标(20μL)，送核磁氢谱检测。该部分溶液中含有游离的PMETAC聚合物链。如图3所示，METAC在3.2-3.3ppm处有一个特征峰(蓝色星形)，仍然将其与TSP内标面积做对比，即可得到参与了反应但未被交联进入水凝胶凝胶的单体含量，从而计算出纳米凝胶产率(yield)。计算公式如下：
其中，未反应的正电载体(nu)，参与反应但未组成纳米凝胶中交联网络的正电载体(np)，参与反应且组成纳米凝胶中交联网络的正电载体(nn)
最后计算结果如表1所示，
表1实施例1-6制备的固定化酶的正电载体转化率和产率
由表1可知，实施例1-6中使用不同正电载体时，正电载体转化率均达到99％以上，可表明正电载体对BSA法测酶浓度几乎没有影响，且洗液中相对酶活和酶浓度为0，由此可得正电载体与脂肪酶吸附，后合成水凝胶包埋脂肪酶几乎没有泄露，其中洗液中相对酶活计算方法如下：
首先，将实施例1-6制备的固定化酶放入10ml去离子水中，浸泡20小时，取出浸泡的固定化酶，收集洗液；
配10mL底物混合液(1μL 4-NPB、500μL丙酮、1mL TX-100、8.5mL MES缓冲液)，取1000μL底物混合液加入到1mL离心管中备用，取3.2μL洗液加入到1mL离心管中，迅速震荡，倒入石英比色皿中，利用紫外动态吸光度法在400nm处测量催化水解4-NPB，生成4-NP吸光度随时间的变化；
利用上述步骤配的反应底物混合液取1mL放入1mL离心管中，加入1.84μL游离脂肪酶作为对照组，迅速震荡，倒入石英比色皿中，利用紫外动态吸光度法在400nm处测量催化水解4-NPB，生成4-NP吸光度随时间的变化，
由图4可知，L@M1(Lipase@M1)、L@M2、L@M5、L@M6、L@M7、L@M8经过线性拟合的得到的斜率分别为-5×10-5，-3×10-5，-1×10-4，-5×10-5，-3×10-5，-6×10-5，经拟合可得，L@M1、L@M2、L@M5、L@M6、L@M7、L@M8的的斜率均小于0，所以L@M1、L@M2、L@M5、L@M6、L@M7、L@M8的相对酶活均为0。
3、载酶量对固定化酶酶活的影响：
(1)在10ml螺口瓶中加甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵(METAC),加入定量脂肪酶溶液(1740μg/ml)，使酶浓度达到20、50、100、200、500μg/ml，调节pH至6.5，形成络合物；然后加入引发剂660μl2-羟基-2-甲基-1-苯基-1-丙酮(HMPP)；最后加入去离子水，使总溶液量达到2ml，加入30mgN,N’-亚甲基双丙烯酰胺(MBA)，磁力搅拌20min。
(2)将螺口瓶置于距紫外灯10cm处并于紫外灯灯芯齐平，磁力搅拌300r/min，照射30min。将产品放入200目筛网中手动研磨，利用紫外分光光度计测试酶活，测试方法同上述性能测试实验中的1酶活性测试。
测试实验结果如图5所示，在酶浓度在20μg/ml至50μg/ml的范围时，相对酶活呈上升趋势，在酶浓度在50μg/ml至500μg/ml的范围时，相对酶活呈下降趋势，在酶浓度为50μg/ml时，结合图1中Lipase的酶活，此时相对酶活达到最高值且固定化酶酶活是游离酶酶活的84％。
4、温度对固定化酶酶活的影响：
水解底物的制备同性能测试实验中1、酶活性测试的步骤(1)，本性能测试中固定化酶的制备方法同实施例1：
水解反应温度分别设置在25、37、50、60、70℃下，将上述制备的0.78g固定化酶投入水解底物中得到反应液，取1000μl反应液移至石英比色皿中并在400nm处测量反应液的吸光度，每隔一分钟测量一次，总时长为10分钟，根据下式计算酶活：
酶活结果如附图6所示，在25，37，50℃的条件下，游离脂肪酶和固定化酶呈现平稳和缓慢上升的趋势且固定化酶的相对酶活高于游离酶的相对活性；在50，60，70℃的条件下，游离脂肪酶和固定化酶呈现快速下降的趋势，温度超过脂肪酶的耐受范围，所以会导致酶活快速下降，但固定化酶的相对活性仍大于游离脂肪酶的相对活性，说明固定化酶的温度耐受性高于游离脂肪酶，载体对酶起到了保护作用。
5、循环使用次数对固定化酶的影响。
固定化酶产品进行首次酶活测试，室温下，将总体积为10ml的反应液混合物(500μL丙酮、1mL TX-100、8.5mL MES缓冲液)加入到12000da的透析袋中(其中，反应液中的固定化酶选择实施例1制备的Lipase@M1，加入0.078g，水解底物4-NPB加入1μl)，向透析袋中放入磁子，保持转速在300r/min，将透析袋放入透析液(透析液为：500ml 10mM pH＝6.5的MES缓冲液)中，进行透析，透析时长为24小时(透析的目的在于除去反应液中的反应产物，只留下固定化酶)，由于在脂肪酶的催化作用下，对硝基苯丁酸脂水解成为对硝基苯酚和正丁酸的水解反应中产生的对硝基苯酚为明显黄色，所以每隔6小时更换一次透析液直至透析液为透明无色，继续加入1.51ml反应液混合物(500μL丙酮、1mL TX-100、1μl水解底物4-NPB)，每隔1分钟测量透析袋中液体在400nm处的吸光度，总共测10次，时长为10min，然后固定化酶催化加入的水解底物，等到透析液澄清时，继续加入1.5ml水解底物，每隔1分钟测量透析袋中液体在400nm处的吸光度，总共测10次，时长为10min，本项测试该循环重复6次，本产品在6次循环过程下仍能维持初始酶活的70％，可见得固定化酶有很好的市场前景。
酶活测试结果如附图7所示，对固定化酶进行循环使用，以初次反应的酶活为100％。如图所示，固定化酶具有一定的循环使用性能，在前4次循环过程中，固定化酶的酶活都保持与初次反应酶活一致。在循环6次后，固定化酶仍有70％的酶活，证明负载脂肪酶的甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵的水凝胶固定化酶具有良好的循环使用性能。
对未经固定化的游离脂肪酶进行酶循环测试，测试方法及投入量等同上，结果如图8所示，由图可知，以初次反应的游离酶酶活为100％，循环6次的游离酶酶活逐日减低，在循环过程到第六次时，游离酶酶活只有15％的酶活，证明游离酶的活性不稳定，在室温下游离酶容易失活。由此可得固定化酶载体对lipase脂肪酶具有较好的保护作用，对脂肪酶的活性位点减少了外界影响因素。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种固定化酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：在反应容器中加入不同等电点的载体和游离酶溶液，搅拌，调节pH为6.5±0.1，得到络合混合液；
S2：向络合混合液中加入助剂，搅拌至溶解完全，得到水凝胶预聚混合液；
S3：对水凝胶预聚混合液进行紫外光辐射，后得到所述固定化酶。
2.根据权利要求1所述的固定化酶的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述载体为正点载体，包括甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵、丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵、2-(二甲氨基)甲基丙烯酸乙酯、2-(二甲氨基)丙烯酸乙酯、N-[(3-(二甲氨基)丙基]甲基丙烯酰胺或N-[(3-二甲氨基)丙基]丙烯酰胺的一种。
3.根据权利要求1所述的固定化酶的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述载体投料为0.5-2M。
4.根据权利要求1所述的固定化酶的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述游离酶溶液为游离脂肪酶溶液。
5.根据权利要求1所述的固定化酶的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述助剂包括引发剂和交联剂，所述引发剂与载体的摩尔比为0.5-5:1，所述交联剂与载体的摩尔比为1-10:1。
6.根据权利要求1所述的固定化酶的制备方法，其特征在于，步骤S3中，所述紫外光辐射的光源为120-130W高压汞灯。
7.根据权利要求1所述的固定化酶的制备方法，其特征在于，所述紫外光辐射的高度为8-12cm。
8.根据权利要求1所述的固定化酶的制备方法，其特征在于，步骤S3还包括将得到的固定化酶进行研磨后过筛网粉碎，得到固定化酶颗粒。
9.根据权利要求8所述的固定化酶的制备方法，其特征在于，所述筛网的尺寸为100-300目。
10.一种固定化酶，其特征在于，其采用如权利要求1至9任一项所述的方法制备而成。
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Legal Events
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