CN117568277A - 基于微流控装置构建乳腺癌细胞来源外泌体的分离方法 - Google Patents

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CN117568277A CN202311506028.8A CN202311506028A CN117568277A CN 117568277 A CN117568277 A CN 117568277A CN 202311506028 A CN202311506028 A CN 202311506028A CN 117568277 A CN117568277 A CN 117568277A
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Abstract

本发明公开了基于微流控装置构建乳腺癌细胞来源外泌体的分离方法，使用微流控装置HBEXO‑Chip，epcam作为特异靶向生物标志物，采用点击化学的方式通过二硫苏糖醇切割二硫键实现外泌体的分离。本发明对乳腺癌外泌体进行特异性分离，并成功区分健康人组、良性肿瘤组、乳腺癌患者组。本发明在早期乳腺癌筛选方面具有非常好的临床应用前景。

Description

基于微流控装置构建乳腺癌细胞来源外泌体的分离方法
技术领域
本发明属于医学技术领域，涉及基于微流控装置构建乳腺癌细胞来源外泌体的分离方法。
背景技术
近年来，乳腺癌已取代肺癌成为全球最常见的癌症类型，大量循证医学证据表明，乳腺癌筛查可以提高乳腺癌早期诊断率、降低病死率，乳腺癌的传统常用检测方法包括组织活检、钼靶X线检查以及血液生化免疫指标检查等，但组织活检会对人体造成一定伤害，X线检查检出率较低，且X线存在辐射，目前临床血液生化免疫指标对于乳腺癌的检测灵敏度和特异性仍存在不足。
外泌体是由脂质双分子层包裹直径为30～150nm的小细胞外囊泡。研究表明，外泌体含有大量来源于母细胞的生物分子，能传递母细胞状态相关的生物学信息。同时，外泌体在细胞间与器官间信息交流传递中发挥着重要作用，外泌体通过多种途径来调节靶细胞的生物学行为，不仅维持正常活动，而且介导多种疾病的发生与发展，并且外泌体的很多理想特征使其有望应用于临床治疗中。外泌体能通过介导的细胞间通讯促进肿瘤的生长和转移，所以肿瘤外泌体也被认为有潜力成为精确诊断和预测肿瘤预后的理想标志物。但外泌体因其体积为纳米级、异质性高，其中一些特殊生物标志物的含量低等原因，在下游分析之前需要对外泌体进行额外的分离和富集。
目前，最常用的分离外泌体的方法是超速离心法和尺寸排除色谱法。超离法作为传统金标准，根据外泌体的沉降系数差异达到分离效果，但超离需要昂贵的仪器，且耗时长特异性低，可能会对下游RNA和蛋白质产生影响。尺寸排除色谱法是基于尺寸来进行分离，优点是物理化学性质重现性高、分离速度快，但容易被脂蛋白污染。其他分离方式包括声学、膜过滤、纳米线捕获、粘弹性流系统等。然而，这些方法都存在耗费时间长，样本需求量大，成本高，且不能特异分离特定类型的外泌体等缺陷，这些缺陷限制了这些方法的被进一步应用。所以基于微流控技术分离外泌体的方法备受关注。
然而现有的基于免疫学的微流控芯片多基于pH值、温度等非温和的洗脱方式，这可能会破坏分离目标并导致非特异性外泌体的富集。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供基于微流控装置构建乳腺癌细胞来源外泌体的分离方法。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
基于微流控装置构建乳腺癌细胞来源外泌体的分离方法，使用微流控装置HBEXO-Chip，epcam作为特异靶向生物标志物，采用点击化学的方式通过二硫苏糖醇(DTT)切割二硫键实现外泌体的分离。
作为优选的技术方案之一，具体步骤如下：
首先使用氨丙基三乙氧基硅烷对微流控通道进行改性处理；
(2)然后在微流控通道内诱导亲和素与生物素结合，接着将生物素化抗epcam抗体溶液注入微流控通道孵育；
(3)最后向微流控通道进样，接着加入DTT孵育，获得乳腺癌细胞来源外泌体。
作为进一步优选的技术方案之一，步骤(1)中，改性的具体方法为：利用5％的氨丙基三乙氧基硅烷对微流控装置的微流控通道进行改性处理，在室温条件下，湿盒孵育2小时，115℃烘干40分钟，自然冷却至室温即可。
作为更进一步优选的技术方案之一，所述氨丙基三乙氧基硅烷溶液是将氨丙基三乙氧基硅烷利用无水乙醇配制而成，其体积浓度为5％。
作为进一步优选的技术方案之一，步骤(2)中，在微流控通道内诱导亲和素与生物素结合的具体方法为：先向微流控通道内加入3,3'-二硫代双(磺酸琥珀酰亚氨基丙酸酯)(DTSSP)(thermofisher)，在湿盒中室温孵育12小时，加入PBS缓冲液清洗2遍，之后加入亲和素，再利用4℃去离子水将剩余的DTSSP分子完全洗掉，待去离子水填满微流控通道，洗去未反应的分子，再利用10mM Tris缓冲液配制1mg/ml生物素化BSA溶液(solarbio)，并注入微流控通道，注入量为200μL，在4℃下孵育1小时；用PBS缓冲液清洗未反应的分子，然后，利用10mM Tris缓冲液配制200μg/ml的亲和素(thermofisher)，并注入微流控通道，注入量为200μL，诱导亲和素与生物素结合；应在4℃下进行30分钟，未反应的亲和素分子通过PBS缓冲液被洗掉。
作为进一步优选的技术方案之一，步骤(2)中，将生物素化抗epcam抗体溶液(abcam ab79079-500μl)注入微流控通道孵育的条件为：4℃孵育1小时；其中，生物素化抗epcam抗体溶液的浓度为5μg/ml。
作为进一步优选的技术方案之一，步骤(2)中，彻底洗净的底物与质量浓度1％BSA溶液孵育以减少非特异性结合，并在4℃保存以供进一步实验。
作为进一步优选的技术方案之一，步骤(3)的具体方法为：使用压力泵控制流速，以16μl/min流速进样200μl血浆样本，然后用PBS清洗2遍通道；再向微流控通道加入50mMDTT(thermofisher)，孵育30min。
作为更进一步优选的技术方案之一，孵育完成后，利用压力泵往微流控通道内通入空气，以确保通道内部的液体完全收集到EP管中。
本发明的有益效果在于：
采用微流控装置HBEXO-Chip，epcam作为特异靶向生物标志物，采用点击化学的方式通过二硫苏糖醇(DTT)切割二硫键实现外泌体的分离。本发明对乳腺癌外泌体进行特异性分离，并成功区分健康人组、良性肿瘤组、乳腺癌患者组。本发明在早期乳腺癌筛选方面具有非常好的临床应用前景。
本发明具有以下特点和优势：
1、基于点击化学的方式通过DTT切割二硫键可快速分离出结构完整的外泌体。使用点击化学的方式温和地洗脱外泌体，洗脱下来的外泌体结构完整，与强酸洗脱的外泌体相比，结构完整。
2、与传统方法金标准技术超速离心相比，HBEXO-Chip可以高纯度、低成本地提高肿瘤性特异性外泌体的回收率，可成功分离区分健康人、乳腺良性肿瘤、乳腺癌症病人，临床受试者工作曲线AUC值高于目前临床常用乳腺癌指标CA153、CA125、CA199、CEA的AUC值。
超速离心具体方法：原理是样本中外泌体和其它物质的沉降系数不同，通过控制离心力分离出外泌体。超速离心法主要分为差速离心和密度梯度离心。差速离心需要一系列的操作程序，首先在300×g的离心力下去除细胞碎片，再转至较高的离心力(如2000×g，10000×g)去除大囊泡，最后在100000×g下沉淀外泌体。
离心步骤：将收集到的样本首先进行300g，10min的离心，去掉沉淀；再依次进行2000g，10min和10000g，30min的离心，去掉沉淀；最后进行100000g，140min的离心，收集到的沉淀就是外泌体。
3、本发明分离乳腺癌外泌体，捕获效率可达到82％，分离效率可达90％以上。与外泌体分离的传统金标准技术超速离心相比，本发明的特异性是超速离心技术的4倍以上。
具体来说，为了验证HBEXO-Chip的性能，首先计算HBEX0-Chip的捕获效率，测量样本经过微流控前后的纳米颗粒浓度，已确定捕获了多少颗粒，经计算芯片捕获效率为82.54％±2.128。然后通过比较金标准超离和微流控芯片，进一步评估了HBEXO-Chip在肿瘤源性的外泌体性能。将染色后的肿瘤源性外泌体加入健康人血浆中，均分样本在俩个平台独立运行。超离样本在4℃，100000g下离心2小时。对于微流控样本，按照实验部分的描述进行操作，用DTT洗脱后得到洗脱液。两个平台样本经过纳米流式测量。纳米流式结果显示，与超离心技术相比，微流控平台的荧光外泌体/健康人血浆外泌体高出4倍以上。其次在时间比较上超离需耗时2×70分钟，需要昂贵的仪器，而HBEXO-Chip进样时间与孵育时间合计最快可小于30分钟，且成本低廉。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明。
图1为本发明的流程示意图。
图2为HBEXO芯片的临床性能验证7HBEXO芯片的临床性能验证。(A)从健康人、良性腺肿瘤患者和乳腺癌患者中分离出的Epcam+的外泌体NTA计数。健康人、良性乳腺肿瘤和乳腺癌患者中分离的外泌体Epcam+的NTA计数。(健康人n＝3，良性乳腺肿瘤患者n＝5，良性乳腺肿瘤患者n＝5，乳腺癌患者n＝5)；(B-C)不同项目(HBEXO-芯片
/CEA/CA125/CA199/CA125)的癌症与对照组(D)CEA和HBEXO-Chip的联合诊断ROC曲线。
图3为HBEXO芯片性能优化4HBEXO芯片性能优化。(A)分别用1、5、10和20ug/ml的生物素化Epcam抗体捕获外泌体，NTA统计四组之间的差异，如图所示(n＝3技术重复；±sem)；(B)使用不同硅烷化试剂(5％APTES、5％GPTMS)捕获外泌体(n＝技术重复；±sem)；(C)不同浓度DTT(10mM/50mM/100mM)的释放效率(n＝3技术重复；±sem)；(D)NTA分析，不同浓度DTT分离后洗脱液的TEM电子显微镜；(E)非DTT处理和强酸处理MCF-7衍生外泌体的TEM电子显微镜。
图4为HBEXO芯片检测条件的优化5HBEXO芯片检测条件的优化。(A)不同注射量对外泌体捕获的影响(n＝3个技术重复；±sem)；(B)不同流速(8μl/min、16μl/min、35μl/min)下HBEXO芯片捕获外泌体的效率(n＝3个技术重复；±sem)；(C)使用DTT培养不同时间(10min/30min/60min)的外泌体释放浓度(n＝3个技术重复；±sem)。
图5为基于MCF-7衍生外泌体的HBEXO芯片方法的构建和性能比较。(A)
HBEXO-Chip捕捉和释放sEV的扫描电镜观察；(B)HBEXO-Chip与超速离心法的性能比较。健康人的血浆分别通过超速离心和微流体平台，并在这些健康人血浆中加入从MCF-7细胞中分离出的经DIO染色后的外泌体。纳米流体技术用于测量不同平台捕获的MCF-7细胞染色外泌体(n＝3)。
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。
本申请使用的PBS缓冲液，厂家GBICO，PH＝7.2，1×PBS，渗透压：280-320mOsm/kg。
实施例：
微流控装置HBEXO-Chip，具体制备方法如下：HBEXO-Chip分支入口采用集管设计，由八个单独的人字形通道组成，以确保加入样本能均匀分布在芯片中从而促进EV与抗体涂层微流控表面之间的相互作用。八个通道中的人字形混合器呈周期交错排列，每个周期由10个人字形结构周期交错排列，通道高度为50um，凹槽高度为45um，比值为0.9，V形夹角为90°，V形与通道轴为45°、主波矢量q＝2π/100nm。首先使用光刻机(SUSS MA6 MaskAligner)和光刻胶(SU8 2050系列)在干净硅片上制备通道模板，将SU8硅片模板用锡箔纸固定在培养皿中。按照质量比10：1将聚二甲基硅烷化(PDMS)预聚剂和固化剂(美国道康宁)搅拌混匀，倒入固定了硅片的培养皿中，使用真空泵处理3分钟除去气泡，待吹打完表面未破裂气泡，将培养皿放入烘箱中，85℃烘45分钟，待PDMS凝固后，用手()术刀按照设计切割，并用打孔机对进样口和出样口进行打孔，孔径大小为2mm，用无尘胶布清理PDMS通道以及硅片模具。然后将PDMS通道面朝上与玻璃片一起放入等离子机进行等离子处理1分钟，处理后将玻璃片与PDMS通道面粘合，按压PDMS边缘，避免按压通道造成通道塌陷。键合后放入烘箱，85℃烘20分钟，增加键合强度。如图1所示，基于微流控装置构建乳腺癌细胞来源外泌体的分离方法，具体步骤如下：
(1)首先利用体积浓度5％的氨丙基三乙氧基硅烷乙醇溶液对微流控装置的微流控通道进行改性处理，在室温条件下，湿盒孵育2小时，115℃烘干40分钟，自然冷却至室温，得到改性微流控装置。
(2)向微流控通道内加入3,3'-二硫代双(磺酸琥珀酰亚氨基丙酸酯)(DTSSP)，在湿盒中室温孵育12小时，加入PBS清洗2遍，之后加入亲和素，再利用4℃去离子水将剩余的DTSSP分子完全洗掉，待去离子水填满微流控通道后，在10mM Tris缓冲液中注入1mg/ml生物素化BSA溶液，在4℃下孵育1小时；用PBS缓冲液清洗未反应的分子，然后，在10mM Tris缓冲液中加入200μg/ml的亲和素，诱导亲和素与生物素结合；应在4℃下进行30分钟，未反应的亲和素分子通过与上一步相同的方法被洗掉。
将5μg/ml生物素化抗epcam抗体溶液注入微流控通道，4℃孵育1小时。
彻底洗净的底物与1％ BSA溶液孵育以减少非特异性结合，并在4℃保存以供进一步实验。
(3)使用压力泵控制流速，以16μl/min流速进样200μl血浆样本，然后用PBS清洗2遍通道；再向微流控通道加入50mM DTT，孵育30min。孵育完成后，利用压力泵往微流控通道内通入空气，以确保通道内部的液体完全收集到EP管中。
定量NTA检测
申请人设计了三个实验组(健康组、良性肿瘤组、乳腺癌患者组)，进行定量NTA检测，具体方法如下：Zetaview-PMX120-Z(Particle Metrix)可利用光散射和布朗运动的特性在1-1000nm范围内来得到样本粒度分布。原理是利用光散射和布朗运动特性，结合Stoke-Einstein方程，通过视频分析颗粒浓度和粒径。采用Zetaview软件对30-1000nm粒径范围内的颗粒浓度进行分析。
如图2所示，定量NTA结果显示，epcam外泌体浓度从正常人的3.37×109±2.28×109粒/ml到乳腺良性肿瘤患者的3.02×1010±3.49×109粒/ml，到癌症组显著升高达到4.82×1010±2.86×109粒/ml。经统计学分析，癌症组与良性肿瘤与健康人组具有显著差异(P<0.05)，这些结果表明通过HBEXO-Chip应用EPCAM抗体可成功区分健康人、乳腺良性肿瘤患者和乳腺癌患者。为进一步判断HBEXO-Chip的临床性能，绘制了接受者工作特征曲线，epcam作为乳腺癌筛查标志物曲线下对应面积计算为0.80，可高灵敏识别乳腺癌患者，具有良好诊断效能。除此之外，还绘制了目前乳腺癌常用临床指标CEA、CA153、CA125和CA199标志物曲线下面积分别为0.61、0.74、0.5、0.67。并对五个指标进行了三线表分析，相对于CEA/CA153/CA125/CA199，HBEXO-Chip可高灵敏、特异地区别健康人和乳腺癌症患者。(表1)(具体检测方法：为了测量糖抗原19-9(CA199)、癌胚抗原(CES)、糖抗原125(CA125)和糖抗原153(CA153)的水平，糖类抗原125(CA125)和糖类抗原153(CA153)的水平。使用Cobas6000分析仪。测量按照生产商的操作者手册进行)
表1.本发明与其他乳腺癌常用临床标志的比较
AUC 临界值 特异性
HBEXO-Chip 0.80 2.85×1010 0.71
CA153 0.74 9.62 0.79
CA199 0.67 13.63 0.58
CA125 0.56 17.15 0.87
CEA 0.61 1.260 0.68
HBEXO-Chip性能优化
为进一步优化HBEXO-Chip的性能，探索了不同条件下HBEXO-Chip捕获肿瘤来源性外泌体的能力。首先，用不同浓度的生物素化epcam抗体(abcam ab79079-500μl)对微流控进行功能修饰，检测微流控芯片的表面饱和点。通过NTA定量结果显示5μg/ml、10μg/ml之间捕获效率在统计学上无差异，但与1μg/ml、20μg/ml之间存在显著统计学差异，外泌体捕获效果随着抗体浓度的提升得到增强，在5-10μg/ml达到饱和，并在20μg/ml显著下降。故为了提高HBEXO-Chip的捕获效率同时并降低未来临床应用成本，选取5μg/ml epcam抗体浓度作为后续芯片捕获外泌体的抗体包被浓度。由于芯片通道改性对于芯片捕获效率影响重大，所以申请人还验证了使用不同硅烷化试剂(APTES、GPTMS)对芯片通道改性的影响，两种硅烷化试剂都是微流控芯片通道亲水改性的试剂，实验结果显示HBEXO-Chip捕获浓度不具有统计学差异(P>0.05)。使用两种硅烷化试剂(APTES/GPTMS)对HBEXO-Chip改性后捕获效率差异无统计学意义。但由于DTSSP的sulfo-NHS酯可与APTES的氨基发生反应形成稳定的酰胺键，有利于DTT切割DTSSP中的二硫键，能提升HBEXO-Chip释放外泌体的能力，所以确定后续实验硅烷化试剂选用APTES。
为进一步优化HBEXO-Chip芯片，考虑优化DTT释放特异性外泌体能力，更大限度地提高HBEXO-Chip分离和释放外泌体的能力，申请人验证了不同DTT浓度(10mM、50mM、100mM)下的洗脱效率，结果如图3所示，结果显示10mM、50mM、100mM洗脱效率分别为48.71±5.88％、92±2.22％、79.17±2.01％，所以后续实验选用50mM DTT来释放外泌体。同时我们对使用不同浓度DTT洗脱液洗脱的外泌体进行TEM电镜分析和NTA电镜分析，TEM电镜结果发现到10mM、50mM DTT洗脱液中的外泌体结构完整呈杯托状，具有脂质双分子层，直径在30-150nm之间，而100mMDTT洗脱液中外泌体大部分遭到破坏，形态扭曲，脂质双分子层被破坏。说明50mMDTT可以保持外泌体完整结构，NTA结果显示各个浓度DTT洗脱的外泌体均在30-150nm之间，说明使用DTT洗脱外泌体纯度高。
HBEXO-Chip检测条件的优化
如图4所示，为了进一步优化HBEXO-Chip的临床应用，对临床外周血样本进行不同进样量和流速下的捕获效率验证，并对耗时最长的孵育步骤进行了时间优化。在不同进样量(80μl、200μl、800μl)条件下，申请人发现200ul进样量的捕获效率最高，与80μl进样量相比具有统计学差异，但与800μl进样量无显著差异。基于临床样本的珍贵性和减少患者抽血量的考虑，建议将进样确定为200ul。
另外，申请人验证了样本通过芯片进样在不同流速下的捕获效率。通过调节压力泵，在不同平均流速下(8μl/min、16μl/min、35μl/min)进样200μl乳腺癌细胞(MCF-7)来源的外泌体标准溶液，我们发现平均流速为16μl/min的情况下，与8μl/min和35μl/min相比，捕获效率显著提高。为了进一步提升HBEXO-Chip分离外泌体的速度，针对耗时最长的孵育步骤进行了验证。根据NTA定量结果显示，孵育时间分别为10min、30min、60min时，洗脱浓度的统计学差异不显著。因此，为了节省时间，建议选择最快的孵育时间为10min。这些优化策略将有助于将HBEXO-Chip快速应用于临床液体活检，提高外泌体分离和捕获的效率，同时减少患者抽血量，更好地服务于临床实践。
HBEXO-Chip捕获外泌体的可视化验证
为验证HBEXO-Chip是否真的捕获到乳腺癌来源性外泌体。使用前述制备并经过表征验证的MCF-7细胞来源外泌体，并利用透射电镜(TEM)分别对未进样乳腺癌来源外泌体的HBEXO-Chip、捕获外泌体的HBEXO-Chips和洗脱了外泌体的HBEXO-Chip进行分析，如图5所示，结果显示未进样外泌体的芯片表面无外泌体，进样了乳腺癌来源性外泌体但未经DTT洗脱的芯片表面捕获了大量外泌体，而经过洗脱的芯片表面几乎不含有外泌体。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (8)

1.基于微流控装置构建乳腺癌细胞来源外泌体的分离方法，其特征在于，使用微流控装置HBEXO-Chip，epcam作为特异靶向生物标志物，采用点击化学的方式通过二硫苏糖醇切割二硫键实现外泌体的分离。
2.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)首先使用氨丙基三乙氧基硅烷对微流控通道进行改性处理；
(2)然后在微流控通道内诱导亲和素与生物素结合，接着将生物素化抗epcam抗体溶液注入微流控通道孵育；
(3)最后向微流控通道进样，接着加入DTT孵育，获得乳腺癌细胞来源外泌体。
3.根据权利要求2所述的分离方法，其特征在于，步骤(1)中，改性的具体方法为：利用氨丙基三乙氧基硅烷对微流控装置的微流控通道进行改性处理，在室温条件下，湿盒孵育2小时，115℃烘干40分钟，自然冷却至室温即可。
4.根据权利要求2所述的分离方法，其特征在于，步骤(2)中，在微流控通道内诱导亲和素与生物素结合的具体方法为：先向微流控通道内加入3,3'-二硫代双(磺酸琥珀酰亚氨基丙酸酯)，在湿盒中室温孵育12小时，加入PBS缓冲液清洗2遍，之后加入亲和素，再利用4℃去离子水将剩余的DTSSP分子完全洗掉，待去离子水填满微流控通道，洗去未反应的分子，再利用10mM Tris缓冲液配制1mg/ml生物素化BSA溶液，并注入微流控通道，注入量为200μL，在4℃下孵育1小时；用PBS缓冲液清洗未反应的分子，然后，利用10mM Tris缓冲液配制200μg/ml的亲和素，并注入微流控通道，注入量为200μL，诱导亲和素与生物素结合；应在4℃下进行30分钟，未反应的亲和素分子通过PBS缓冲液被洗掉。
5.根据权利要求2所述的分离方法，其特征在于，步骤(2)中，将生物素化抗epcam抗体溶液注入微流控通道孵育的条件为：4℃孵育1小时；其中，生物素化抗epcam抗体溶液的浓度为5μg/ml。
6.根据权利要求2所述的分离方法，其特征在于，步骤(2)中，彻底洗净的底物与1％BSA溶液孵育以减少非特异性结合，并在4℃保存以供进一步实验。
7.根据权利要求2所述的分离方法，其特征在于，步骤(3)的具体方法为：使用压力泵控制流速，以16μl/min流速进样200μl血浆样本，然后用PBS清洗2遍通道；再向微流控通道加入50mM DTT，孵育30min。
8.根据权利要求7所述的分离方法，其特征在于，孵育完成后，利用压力泵往微流控通道内通入空气，以确保通道内部的液体完全收集到EP管中。
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