CN117568202A - 一株促肠蠕动的动物双歧杆菌乳亚种bl-g75及其应用 - Google Patents

一株促肠蠕动的动物双歧杆菌乳亚种bl-g75及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一株促肠蠕动的动物双歧杆菌乳亚种BL‑G75及其应用，该动物双歧杆菌乳亚种BL‑G75(Bifidobacterium animalis subsp.lactis BL‑G75)保藏编号为CCTCC NO：M 20221827，应用于制备促进肠蠕动的微生物制剂。本发明所提供的动物双歧杆菌乳亚种BL‑G75分离自健康正常人群粪便，来源安全；它能够通过促进肠蠕动，调节胃肠功能，起到润肠通便的效果，且对酸性环境及胆盐有良好的耐受力，在低温环境下稳定性优异，具有开发为益生菌的良好前景。

Description

一株促肠蠕动的动物双歧杆菌乳亚种BL-G75及其应用
技术领域
本发明涉及益生菌筛选与应用技术领域，尤其涉及一株促肠蠕动的动物双歧杆菌乳亚种BL-G75(Bifidobacterium animalis subsp.lactis BL-G75)及其应用。
背景技术
肠道蠕动是一种肌肉神经高度协调的复杂运动，主要受到肠神经系统(ENS)为主的多级神经系统的传出神经和传入神经调节，通过胃肠道纵行肌与环行肌有规律的收缩和舒张来完成。肠道蠕动负责运输摄入的食物，帮助机体吸收营养和水，并排除废物，该功能对生命健康至关重要。对人类而言，肠道蠕动功能障碍可加剧感染，导致营养不良，并表现出腹泻和便秘等衰弱症状，从而极大的影响健康和生活质量。
近年来，随着对肠道蠕动机制的不断探索，发现肠道菌群与肠蠕动能力密不可分，正常的肠道菌群有助于肠道蠕动正常进行。研究发现口服微生态制剂能够调节肠道菌群，促进肠道菌群代谢产生短链脂肪酸(SCFAs)，起到降低肠道pH、促进肠蠕动的功效。因此，服用益生菌成为促进肠蠕动，改善消化系统运转的新思路。
益生菌一词源于希腊语，2001年FAO/WHO联合将益生菌定义为活的微生物，通过摄入充足的数量，可以对宿主健康产生益处。目前发现的人体和动物体内有益的细菌或真菌主要有酵母菌、益生芽孢菌、丁酸梭菌、乳杆菌、双歧杆菌、放线菌等。其中，双歧杆菌属(Bifidobacterium)是放线菌门严格厌氧的革兰氏阳性多形性杆状细菌，其末端常常分叉，故名双歧杆菌。双歧杆菌是人和动物肠道的重要核心菌群和有益生理菌群，也是母乳喂养婴儿中发现的第二大菌。这些特点让双歧杆菌成为益生菌制剂研究中的热门菌种。中国专利CN113355253B公开了一种动物双歧杆菌及其在制备润肠通便产品中的应用；中国专利CN114717132B公开了一株具有预防和缓解便秘症状的乳双歧杆菌及其应用。
然而，肠道蠕动的机制复杂，益生菌的益生特性在属种水平上都具有差异，同种不同株的益生菌株其促进肠蠕动的效果及其作用机制也会存在差异。因此，筛选获得促肠蠕动效果突出，作用机制明确的益生菌株仍是目前研究的难点和热点。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明提供一株能够促进肠蠕动的动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animalis subsp.lactis)及其应用；该动物双歧杆菌乳亚种BL-G75(Bifidobacterium animalis subsp.lactis BL-G75)，保藏编号CCTCC NO：M 20221827，于2022年11月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学。
本发明还提供上述的动物双歧杆菌乳亚种BL-G75在制备促进肠蠕动的微生物制剂中的应用。
本发明还提供一种含有上述的动物双歧杆菌乳亚种BL-G75(Bifidobacteriumanimalis subsp.lactis BL-G75)的微生物制剂，该微生物制剂用于促进肠蠕动。
进一步的，前述的微生物制剂为药品。
进一步的，前述的微生物药品为片剂或粉剂。
进一步的，前述的微生物药品还含有药学可接受的辅料，如填充剂、黏合剂、崩解剂、润滑剂、润湿剂、矫味剂、pH调节剂等。
具体地，填充剂可以选自淀粉、糖粉、糊精、乳糖、可压性淀粉、微晶纤维素、酸奶粉、低聚果糖、脱脂乳粉中的一种或多种；黏合剂可以选自淀粉浆、纤维素衍生物、聚维酮、明胶、聚乙二醇、聚乙烯醇、蔗糖、液体葡萄糖、麦芽糖醇中的一种或多种；崩解剂可以选自羧甲基淀粉钠、低取代羟丙纤维素、交联羧甲纤维素钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、微晶纤维素中的一种或多种；润滑剂可以选自硬脂酸钠(镁)、微粉硅胶、滑石粉、氢化植物油、聚乙二醇类、月桂硫酸钠(镁)中的一种或多种；润湿剂可以选自水和/或乙醇；矫味剂可以选自糖浆、甜菊苷、甘油、山梨醇、甘露醇、糖精钠、阿司帕坦、三氯蔗糖、木糖醇、天然芳香精油、人工香精、海藻酸钠、阿拉伯胶中的一种或多种；pH调节剂可以选自苹果酸、富马酸、醋酸、醋酸钠、枸橼酸(钠、钾盐)、酒石酸中的一种或多种。
进一步的，前述的微生物药品，其中，动物双歧杆菌乳亚种BL-G75的含量为2×1011～6×1011CFU/g。
在另一种实施方式中，前述的微生物制剂为含微生物食品。
进一步的，前述的含微生物食品为压片糖果或粉剂。
进一步的，前述的含微生物食品，还包括食品中可接受的配料，如奶粉、酸奶粉、脱脂乳粉、糖粉、乳糖、山梨糖醇、糊精、糖浆、天然芳香精油、人工香精、硬脂酸钠(镁)、水、乙醇、苹果酸、枸橼酸(钠、钾盐)等。
进一步的，前述的含微生物食品，其中，动物双歧杆菌乳亚种BL-G75的含量为2×1011～6×1011CFU/g。
在另一种实施方式中，前述的微生物制剂为保健品。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
本发明所提供的保藏编号为CCTCC NO：M 20221827的动物双歧杆菌乳亚种BL-G75分离自健康正常人群粪便，来源安全；它能够通过促进肠蠕动，调节胃肠功能，起到润肠通便的效果，且对酸性环境及胆盐有良好的耐受力，在低温环境下稳定性优异，具有开发为益生菌的良好前景。
附图说明
图1为实施例1获得的动物双歧杆菌乳亚种BL-G75接种于MRS培养基的菌落形态特征图；
图2为实施例1获得的动物双歧杆菌乳亚种BL-G75革兰氏染色后的显微镜下形态图；
图3为实施例4动物双歧杆菌乳亚种BL-G75活菌数随酸处理时间的变化趋势图；
图4为实施例5动物双歧杆菌乳亚种BL-G75活菌数随胆盐处理时间的变化趋势图；
图5为实施例6动物双歧杆菌乳亚种BL-G75冻干菌粉各温度稳定性曲线。
具体实施方式
下面进一步举实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。
实施例1动物双歧杆菌乳亚种BL-G75(Bifidobacterium animalis subsp.lactisBL-G75)的筛选
以来源于健康正常人群的粪便为样本，混匀样本，吸取0.5mL样本加到4.5mL0.85％生理盐水进行梯度稀释，选择合适的梯度稀释液涂布在MRS固体培养基上，于37℃厌氧环境培养48小时，挑取单菌落，在MRS平板进行划线，放置37℃厌氧环境培养48小时。挑起单菌落，接种到MRS液体培养基上进行培养，获得动物双歧杆菌乳亚种BL-G75菌液；将所得菌液离心，转速6000rpm，离心30min，去上清，收集沉淀物，即得动物双歧杆菌乳亚种BL-G75的菌泥。
实施例2动物双歧杆菌乳亚种BL-G75(Bifidobacterium animalis subsp.lactisBL-G75)的菌落特征和镜下形态
将实施例1获得的动物双歧杆菌乳亚种BL-G75菌种划线接种于MRS培养基平板上，厌氧培养48h，观察菌落形态特征、大小、球杆状和分布情况等，结果如图1所示，动物双歧杆菌乳亚种BL-G75在上述培养基培养48h后，呈现圆形凸起、边缘及表面光滑、白色、不透明，大小均一菌落；
再将前述培养的动物双歧杆菌乳亚种BL-G75进行革兰氏染色，显微镜下观察，结果如图2所示，动物双歧杆菌乳亚种BL-G75为革兰氏阳性菌，呈现双歧杆菌典型形态，单个，不规则，棒槌状或分叉。
实施例3动物双歧杆菌乳亚种BL-G75(Bifidobacterium animalis subsp.lactisBL-G75)的鉴定
将实施例1获得的动物双歧杆菌乳亚种BL-G75用斜面试管保存，送第三方机构(中国科学院微生物研究所)鉴定其生理生化特征、16S rRNA、tuf基因序列，结果如下：
表1动物双歧杆菌乳亚种BL-G75的生理生化特征
16S rRNA基因测序如下：
CATGCAGTCGAACGGGATCCCTGGCAGCTTGCTGTCGGGGTGAGAGTGGCGAACGGGTGAGTAATGCGTGACCAACCTGCCCTGTGCACCGGAATAGCTCCTGGAAACGGGTGGTAATACCGGATGCTCCGCTCCATCGCATGGTGGGGTGGGAAATGCTTTTGCGGCATGGGATGGGGTCGCGTCCTATCAGCTTGTTGGCGGGGTGATGGCCCACCAAGGCGTTGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGACCGGCCACATTGGGACTGAGATACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGCGGGATGGAGGCCTTCGGGTTGTAAACCGCTTTTGTTCAAGGGCAAGGCACGGTTTCGGCCGTGTTGAGTGGATTGTTCGAATAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCGAGCGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGGGCTCGTAGGCGGTTCGTCGCGTCCGGTGTGAAAGTCCATCGCCTAACGGTGGATCTGCGCCGGGTACGGGCGGGCTGGAGTGCGGTAGGGGAGACTGGAATTCCCGGTGTAACGGTGGAATGTGTAGATATCGGGAAGAACACCAATGGCGAAGGCAGGTCTCTGGGCCGTCACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGATGCTGGATGTGGGGCCCTTTCCACGGGTCCCGTGTCGGAGCCAACGCGTTAAGCATCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGAAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGCGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGGCTTGACATGTGCCGGATCGCCGTGGAGACACGGTTTCCCTTCGGGGCCGGTTCACAGGTGGTGCATGGTCGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGCCGCATGTTGCCAGCGGGTGATGCCGGGAACTCATGTGGGACCGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAGATCATCATGCCCCTTACGTCCAGGGCTTCACGCATGCTACAATGGCCGGTACAACGCGGTGCGACACGGTGACGTGGGGCGGATCGCTGAAAACCGGTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGGCGGAGTCGCTAGTAATCGCGGATCAGCAACGCCGCGGTGAATGCGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCAAGTCATGAAAGTGGGTAGCACCCGAAGCCGGTGGCCCGACCCTTGTGGGGGGAGCCGTCTAAGGTGAGACTCGTGATTGGACTAAGTCG
Tuf基因测序如下：
CAGCAGCGTGGTATCACCATCAACATTGCCCACATCGAGTACCAGACGGCCAAGCGTCACTACGCCCACGTCGACTGCCCGGGCCACGCCGACTTCGTGAAGAACATGATCACCGGCGCTGCCCAGATGGATGGCGCCATCCTCGTTGTGGCCGCCACCGACGGCCCGATGGCCCAGACCCGCGAGCACGTGCTGCTCGCCCGTCAGGTCGGCGTCCCGAAGATCCTCGTCGCTCTGAACAAGTGCGATATGGTCGATGACGAAGAGCTCATCGAGCTCGTCGAAGAAGAGGTCCGCGACCTCCTCGACGAGAACGGCTTCGACCGCGACTGCCCGGTCGTGCACACCTCCGCTTACGGCGCTCTGCATGACGACGCTCCGGATCACGACAAGTGGGTTGCCACCATCAAGGAGCTCATGGACGACGTCGACGAGTACATCCCGACCCCGGTCCACGACCTCGACAAGCCGTTCCTGATGCCGATCGAGGACGTCTTCACCATCTCCGGCCGTGGCACCGTCGTCACCGGTCGTGTCGAGCGCGGCAAGCTGCCGATCAACACGAACGTCGAGATCGTCGGCATCCGCCCGACCCAGACCACCACCGTCACCTCCATCGAGACCTTCCACAAGCAGATGGATGAGTGCGAGGCCGGCGACAACACCGGTCTGCTGCTCCGCGGCATCAACCGCACCGACGTCGAGCGTGGCCAGGTCGTGGCTGCTCCGGGTTCGGTCACCCCGCACACCAAGTTCGAAGGCGAAGTCTACGTCCTTACCAAGGATGAGGGCGGCCGTCACTCGCCGTTCTTCTCGAACTACCGTCCGCAGTTCTACTTCCGCACCACCGACGTCACCGGCGTCATCACGCTGCCGGAAGGCGTCGAGATGGTTCAGCCT
将以上鉴定结果与《伯杰氏系统细菌学手册》及International Journal ofSystematic and Evolutionary Microbiology有关研究论文进行比对，鉴定BL-G75为动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animalis subsp.lactis)，即乳双歧杆菌。
实施例4动物双歧杆菌乳亚种BL-G75(Bifidobacterium animalis subsp.lactisBL-G75)的耐酸性
1.动物双歧杆菌乳亚种BL-G75冻干菌粉制备：
将实施例1制得的动物双歧杆菌乳亚种BL-G75菌泥与灭菌后的冻干保护剂混匀，-50℃预冻3h，然后真空冻干20h，粉碎，得到动物双歧杆菌乳亚种BL-G75冻干菌粉，活菌含量4×1011CFU/g；
冻干保护剂的组成及其与菌泥的比例：以质量计，冻干保护剂中，脱脂乳粉：海藻糖：丙三醇：甘氨酸：抗坏血酸钠＝3:4:1:3:1，菌泥：冻干保护剂＝1:2；
2.准备耐酸实验材料：
(1)配制0.85％(w/w)生理盐水，用10％盐酸调节pH值为2、3，分装到15*150mm的玻璃试管中，每支4.5mL，121℃灭菌15分钟备用；
(2)生理盐水36mL分装至100ml容积的试剂瓶中，加入数粒粒径5-6mm的玻璃珠，同时分装到15*150mm的玻璃试管中，每支4.5mL，121℃灭菌15分钟备用；
3.实验步骤：
(1)称取4g动物双歧杆菌乳亚种BL-G75冻干菌粉溶解于36mL生理盐水，充分混匀为菌悬液，备用；
(2)吸取步骤(1)制得的菌悬液0.5mL至4.5mL生理盐水试管中，充分混匀，制备10-2稀释度菌悬液，以此方法制备10-3～10-10稀释度菌悬液，用平板倾注法进行菌落计数；
(3)吸取步骤(1)制得的菌悬液0.5mL至4.5mL酸性生理盐水试管中，充分混匀，制备10-2稀释度菌悬液，置于37℃水浴中；分别在1h、2h、3h和4h时取出，用生理盐水稀释后，平板倾注法进行菌落计数。
4.实验结果
以步骤(2)中生理盐水稀释的菌悬液计数结果作为0h对照，统计经酸性生生理盐水处理1h、2h、3h和4h后的菌悬液计数结果，以处理时间作为横坐标，计数结果作为纵坐标绘制曲线，结果如图3所示。动物双歧杆菌乳亚种BL-G75在pH2.0的酸性生理盐水中处理1小时后，活菌数从3.6×1011CFU/g降至2.3×1010CFU/g，存活率6.39％。处理时间增加至4小时，活菌数降低至5.0×109CFU/g。在pH3.0的酸性生理盐水中处理1小时后，活菌数从3.6×1011CFU/g降至9.0×1010CFU/g，存活率25.00％。处理时间增加至4小时，活菌数降低至2.0×1010CFU/g。实验结果显示该菌具有良好的耐酸特性。
实施例5动物双歧杆菌乳亚种BL-G75(Bifidobacterium animalis subsp.lactisBL-G75)的耐胆盐特性
1.准备耐胆盐实验材料：
(1)配制0.85％(w/v)生理盐水，添加猪胆盐形成浓度分别为0.2％、0.3％的胆盐溶液，分装到15*150mm的玻璃试管中，毎支4.5mL，121℃灭菌15分钟备用；
(2)配制0.85％(w/v)生理盐水36mL，分装至100ml容积的试剂瓶中，加入数粒粒径5-6mm的玻璃珠，同时分装到15*150mm的玻璃试管中，毎支4.5mL，121℃灭菌15分钟备用；
(3)实施例4制得的动物双歧杆菌乳亚种BL-G75冻干粉。
2.实验步骤
(1)称取4g待测菌粉溶解于36mL生理盐水，充分混匀；
(2)吸取步骤(1)制得的菌悬液0.5mL至生理盐水试管中，充分混匀，制备10-2稀释度菌悬液，以此方法制备10-3～10-10稀释度菌悬液，用平板倾注法进行菌落计数；
(3)吸取步骤(1)制得的菌悬液0.5mL至4.5mL浓度为0.2％和0.3％的猪胆盐试管中，充分混匀，置于37℃水浴中，分别在1h、2h、3h和4h时取出，用生理盐水稀释后，平板倾注法进行菌落计数。
3.实验结果
以步骤2中生理盐水稀释的菌悬液计数结果作为0h对照，统计经胆盐处理1h、2h、3h和4h后的菌悬液计数结果，以处理时间作为横坐标，计数结果作为纵坐标绘制曲线，结果如图4所示。动物双歧杆菌乳亚种BL-G75在0.2％的胆盐中处理1小时后，活菌数从3.6×1011CFU/g降至1.4×1011CFU/g，存活率达到38.9％，处理时间增加至4小时后，活菌数为1.2×1010CFU/g，存活率为3.3％。在0.3％的胆盐中处理1小时后，活菌数为8.0×1010CFU/g，存活率22.2％，处理时间增加4小时后，活菌数为3.4×109CFU/g。实验结果显示该菌具有良好的耐胆盐特性。
实施例6动物双歧杆菌乳亚种BL-G75(Bifidobacterium animalis subsp.lactisBL-G75)冻干菌粉的稳定性
将实施例1制得的动物双歧杆菌乳亚种BL-G75菌泥在RH≤50±2％，温度≤25±1℃环境下，调整至水活度Aw0.125，水分4.5％，封装到铝箔袋中，作为待测样品菌粉；样品放在-18℃±2℃、4±2℃、25±2℃下进行保存，定时取样跟踪菌数变化；动物双歧杆菌乳亚种计数采用《GB4789.34食品安全国家标准食品微生物学检验双歧杆菌的鉴定》方法。
稳定性测试结果如表2，数据图形分析如图5。
表2贮藏过程温度对动物双歧杆菌乳亚种BL-G75活菌数的影响
从表2及图5中可见，在25℃贮藏条件下，样品中的活菌数会随着存放时间的推移而下降，存放24个月后，样品中的活菌数维持在4.6×1011cfu/g，存活率68％。在4℃及-18℃贮藏条件下，样品中活菌数量随存放时间的推移基本无变化，可见动物双歧杆菌乳亚种BL-G75具有极佳的存储稳定性，低温贮存有利于改善动物双歧杆菌乳亚种BL-G75菌粉稳定性。
实施例7动物双歧杆菌乳亚种BL-G75(Bifidobacterium animalis subsp.lactisBL-G75)冻干菌粉的促进肠蠕动效果
将实施例4制得的动物双歧杆菌乳亚种BL-G75冻干菌粉以铝箔袋封装，送往第三方机构(广东省华微检测股份有限公司)，通过小鼠小肠运动实验，排便时间、粪便粒数和粪便重量的测定，检测其促肠蠕动效果。阳性(有效)标准：6小时内排粪便重量和粪便粒数任一项结果阳性，同时小肠运动实验和排便时间任一项结果阳性，可判定该项实验结果阳性。
(一)小肠运动实验
1、材料和动物
(1)受试样品：实施例4制得的动物双歧杆菌乳亚种BL-G75冻干菌粉。
(2)实验动物：50只SPF级ICR小鼠，雄性，试验开始体重为18～22g，由广东维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号：SCXK(粤)2022-0063；动物质量合格证编号：44829700008220。动物购进后在本司屏障环境动物房每笼5只饲养，检疫合格后使用。
(3)饲养环境：实验动物使用许可证编号：SYXK(粤)2023-0249。动物房温度：20℃～25℃，相对湿度：40％～70％，温湿度变化无异常现象。光照控制明暗比为12小时:12小时。
(4)饲料来源：河南省环宇禾康生物科技有限公司；生产许可证号：SCXK(豫)2020-0004；生产日期：2023年01月20日；质量合格证号：4109782300011834
2、方法
(1)样品制备：配制成3个浓度样品溶液
高浓度剂量：称取0.0042g受试样品，加入纯水配制成10mL的溶液；
中浓度剂量：称取0.0014g受试样品，加入纯水配制成10mL的溶液；
低浓度剂量：称取0.0004g受试样品，加入纯水配制成10mL的溶液。
(2)剂量分组及受试样品给予时间
根据动物双歧杆菌乳亚种BL-G57冻干菌粉人体推荐剂量0.025g/60kg/天，按1倍、3.3倍、10倍作为3个剂量组；故设计剂量分别是：低剂量组0.0004g/kg/天，中剂量组0.0014g/kg/天、高剂量组0.0042g/kg/天。阴性对照组和模型对照组按照0.0042g/kg/天同样途径给纯水。连续经口给药7天。
(3)动物模型的建立
给受试样品7天后，各组小鼠禁食不禁水16小时。
模型对照组和三个剂量组灌胃给予洛哌丁胺(4mg/kgBW)，阴性对照组给予纯水。
(4)指标测定的方法
给洛哌丁胺后0.5小时，各剂量组分别给予含相应受试样品的墨汁(含5％的活性炭粉、10％阿拉伯树胶)，阴性和模型对照组给墨汁灌胃。
25分钟后立即脱颈椎处死动物，打开腹腔分离肠系膜，剪取上端自幽门、下端至回盲部的肠管，置于托盘上，轻轻将小肠拉成直线，测量肠管长度为“小肠总长度”，从幽门至墨汁前沿为“墨汁推进长度”。
按下式计算墨汁推进率：
(5)数据处理及结果判定
墨汁推进率需进行数据转换，式中p为墨汁推进率，用小数表示。在进行方差分析时，需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值＜F0.05，结论：各组均数间差异无显著性；F值≥F0.05，P≤0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。
在模型成立的前提下，受试样品组小鼠的墨汁推进率显著高于模型对照组的墨汁推进率时，可判定该项实验结果阳性。
3、实验结果
实验结果如下表3。
表3小鼠肠道墨汁推进率
组别 墨汁推进率(％)
阴性对照组 82.46±6.63
模型对照组 51.12±5.47
低剂量组 65.59±6.01
中剂量组 71.28±6.84
高剂量组 76.74±7.10
经过数据分析表明：
在方差齐性检验中，P＝0.697>0.05，认为方差齐。
计算F值＝14.299，P值＝0.000<0.05，则F值≥F0.05，P≤0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计。
两两比较结果，LSD法中，模型对照组与阴性对照组、模型对照组与低剂量组、模型对照组与中剂量组、模型对照组与高剂量组间均有显著差异。
小鼠小肠蠕动抑制模型成立，受试样品各剂量组小鼠的墨汁推进率显著高于模型对照组的墨汁推进率，判定该项实验结果阳性。
(二)排便时间、粪便粒数和粪便重量的测定
材料与动物、样品制备、模型建立、数据同(一)小肠运动实验。
指标测定的具体方法：给洛哌丁胺后0.5小时后，剂量组分别给予含相应受试样品的墨汁(含5％的活性炭粉、10％阿拉伯树胶)，阴性和模型对照组给墨汁灌胃。动物均单笼饲养，正常饮水进食。
从灌墨汁开始，记录每只动物首粒排黑便时间、6小时内排黑便粒数及重量。
应去除小鼠排出第一粒黑便前的粪便。
数据处理：
资料使用方差分析，需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值<F0.05，结论：各组均数间差异无显著性；F值≥F0.05，P≤0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。
在小肠便秘模型成立的前提下，受试样品组小鼠的首粒排黑便时间明显短于模型对照组，即可判定该项指标结果阳性。
实验结果如下表4。
表4小鼠排便时间、粪便粒数和粪便重量的测定结果
(1)首粒排黑便时间实验结果
在方差齐性检验中，P＝0.105>0.05，认为方差齐。
计算F值＝28.960，P值＝0.000<0.05，则F值≥F0.05，P≤0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计。
两两比较结果，LSD法中，模型对照组与阴性对照组、模型对照组与低剂量组、模型对照组与中剂量组、模型对照组与高剂量组组间首粒排黑便时间均有显著差异。
(2)排黑便粒数实验结果
在方差齐性检验中，P＝0.062>0.05，认为方差齐。
计算F值＝35.938，P值＝0.000<0.05，则F值≥F0.05，P≤0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计。
两两比较结果，LSD法中，模型对照组与阴性对照组、模型对照组与低剂量组、模型对照组与中剂量组、模型对照组与高剂量组组间6小时内排黑便粒数均有显著差异。
(3)排黑便重量实验结果
在方差齐性检验中，P＝0.011<0.05，认为方差不齐。对数据进行适当的变量转换:X＝P^(1/2)，式中P为6小时内排黑便重量，用小数表示。待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计。
在方差齐性检验中，P＝0.888>0.05，认为方差齐。
计算F值＝49.542，P值＝0.000<0.05，则F值≥F0.05，P≤0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计。
两两比较结果，LSD法中，模型对照组与阴性对照组、模型对照组与低剂量组、模型对照组与中剂量组、模型对照组与高剂量组组间6小时内排黑便重量均有显著差异。
小鼠小肠便秘模型成立，受试样品组小鼠的首粒排黑便时间明显短于模型对照组，判定该项指标结果阳性。6小时内排黑便粒数明显高于模型对照组，判定该项指标结果阳性；6小时内排黑便重量明显高于模型对照组，判定该项指标结果阳性。
综合小鼠小肠运动实验和排便时间、粪便粒数和粪便重量的测定结果可知，动物双歧杆菌乳亚种BL-G75冻干菌粉能够显著促进小鼠肠蠕动，改善小鼠的实验性便秘，这种效果具有一定的剂量依赖性。
实施例8动物双歧杆菌乳亚种BL-G75(Bifidobacterium animalis subsp.lactisBL-G75)压片糖果的促进肠蠕动效果
将实施例1制得的动物双歧杆菌乳亚种BL-G75菌泥制为压片糖果，以铝箔袋封装，送往第三方机构(广东省华微检测股份有限公司)，通过小鼠小肠运动实验，排便时间、粪便粒数和粪便重量的测定，检测其促肠蠕动效果。阳性(有效)标准：6小时内排粪便重量和粪便粒数任一项结果阳性，同时小肠运动实验和排便时间任一项结果阳性，可判定该项实验结果阳性。
(一)动物双歧杆菌乳亚种BL-G75压片糖果的制备：
将实施例1制得的动物双歧杆菌乳亚种BL-G75菌泥与山梨糖醇、多孔糊精、硬脂酸镁混匀，得预混料1；
另准备乳糖、酸奶粉、低聚果糖、麦芽糖醇、脱脂乳粉混匀，得预混料2；
将预混料2用90％乙醇润湿，60～65℃下制为水分含量2.5～3.5％、目数14的颗粒；
将预混料1按比例与预混料2颗粒混合，压制成片，即得动物双歧杆菌乳亚种BL-G75压片糖果。
以质量份计，动物双歧杆菌乳亚种BL-G75压片糖果配方如下：麦芽糖醇12份、酸奶粉8份、脱脂奶粉1.5份、山梨糖醇13.5份、糊精4.5份、动物双歧杆菌乳亚种BL-G755份、硬脂酸镁0.5份。
(二)小肠运动实验
实验动物、实验方法、模型建立、指标测定方法、数据处理及结果判定同实施例7(一)小肠运动实验。实验动物数量为30只。
受试样品：(一)制得的动物双歧杆菌乳亚种BL-G75压片糖果。
剂量分组：按照人体推荐剂量0.45g/60kg/天，按10倍作为单个剂量组。成品单剂量组0.075g/kg/天，受试样品给予时间7天。
实验结果如下表5。
表5小鼠肠道墨汁推进率
组别 墨汁推进率(％)
阴性对照组 84.50±6.21
模型对照组 48.96±5.05
成品单剂量组 69.77±6.30
上表结果经过数据分析表明：
在方差齐性检验中，P＝0.948>0.05，认为方差齐。
计算F值＝30.652，P值＝0.000<0.05，则F值≥F0.05，P≤0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计。
两两比较结果，LSD法中，模型对照组与阴性对照组、模型对照组与成品单剂量组间均有显著差异。
小鼠小肠蠕动抑制模型成立，受试样品组小鼠的墨汁推进率显著高于模型对照组的墨汁推进率，判定该项实验结果阳性。
(三)排便时间、粪便粒数和粪便重量的测定
实验动物、实验方法、模型建立、指标测定方法、数据处理及结果判定同实施例7(二)排便时间、粪便粒数和粪便重量的测定。实验动物数量为30只。
受试样品：(一)制得的动物双歧杆菌乳亚种BL-G75压片糖果。
剂量分组：称取0.0750g受试样品，加入纯水，配置为10mL的溶液。
实验结果如下表6。
表6小鼠排便时间、粪便粒数和粪便重量的测定结果
(1)首粒排黑便时间试验结果
在方差齐性检验中，P＝0.052>0.05，认为方差齐。
计算F值＝69.611，P值＝0.000<0.05，则F值≥F0.05，P≤0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计。
两两比较结果，LSD法中，模型对照组与阴性对照组、模型对照组与成品单剂量组首粒排黑便时间均有显著差异。
(2)排黑便粒数试验结果
在方差齐性检验中，P＝0.914>0.05，认为方差齐。
计算F值＝61.127，P值＝0.000<0.05，则F值≥F0.05，P≤0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计。
两两比较结果，LSD法中，模型对照组与阴性对照组、模型对照组与成品单剂量组组间6小时内排黑便粒数均有显著差异。
(3)排黑便重量试验结果
在方差齐性检验中，P＝0.006<0.05，认为方差不齐。对数据进行适当的变量转换：X＝P^(1/2)，式中P为6小时内排黑便重量，用小数表示。待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计。
在方差齐性检验中，P＝0.848>0.05，认为方差齐。
计算F值＝107.476，P值＝0.000<0.05，则F值≥F0.05，P≤0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计。
两两比较结果，LSD法中，模型对照组与阴性对照组、模型对照组与成品单剂量组组间6小时内排黑便重量均有显著差异。
小鼠小肠便秘模型成立，受试样品组小鼠的首粒排黑便时间明显短于模型对照组，判定该项指标结果阳性。6小时内排黑便粒数明显高于模型对照组，判定该项指标结果阳性；6小时内排黑便重量明显高于模型对照组，判定该项指标结果阳性。
综合小鼠小肠运动实验和排便时间、粪便粒数和粪便重量的测定结果可知，动物双歧杆菌乳亚种BL-G75压片糖果能够显著促进小鼠肠蠕动，改善小鼠的实验性便秘。
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (12)

1.一株动物双歧杆菌乳亚种BL-G75(Bifidobacteriumanimalissubsp.lactis BL-G75)，保藏编号CCTCCNO：M 20221827。
2.一种权利要求1所述的动物双歧杆菌乳亚种BL-G75(Bifidobacteriumanimalissubsp.lactisBL-G75)在制备促进肠蠕动的微生物制剂中的应用。
3.一种含有权利要求1所述的动物双歧杆菌乳亚种BL-G75(Bifidobacteriumanimalissubsp.lactisBL-G75)的微生物制剂，其特征在于，所述微生物制剂用于促进肠蠕动。
4.根据权利要求3所述的微生物制剂，其特征在于，所述微生物制剂为药品。
5.根据权利要求4所述的微生物制剂，其特征在于，所述微生物制剂为片剂或粉剂。
6.根据权利要求4所述的微生物制剂，其特征在于，所述微生物制剂还含有药学可接受的辅料。
7.根据权利要求4所述的微生物制剂，其特征在于，所述微生物制剂中，所述动物双歧杆菌乳亚种BL-G75(Bifidobacteriumanimalissubsp.lactisBL-G75)的含量为2×1011～6×1011CFU/g。
8.根据权利要求3所述的微生物制剂，其特征在于，所述微生物制剂为食品。
9.根据权利要求8所述的微生物制剂，其特征在于，所述微生物制剂为压片糖果或粉剂。
10.根据权利要求8所述的微生物制剂，其特征在于，还含有食品中可接受的配料。
11.根据权利要求8所述的微生物制剂，其特征在于，所述微生物制剂中，所述动物双歧杆菌乳亚种BL-G75(Bifidobacteriumanimalissubsp.lactisBL-G75)的含量为2×1011～6×1011CFU/g。
12.根据权利要求3所述的微生物制剂，其特征在于，所述微生物制剂为保健品。
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