CN117567574A - 植物含油率相关蛋白及其相关生物材料与应用 - Google Patents

植物含油率相关蛋白及其相关生物材料与应用 Download PDF

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左毅
李彬
陈家廷
张冬冬
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Salt Alkali Land Comprehensive Utilization Technology Innovation Center
Institute of Botany of CAS
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Abstract

本发明涉及生物技术领域，本发明公开了与山桐子果实含油率相关的蛋白质IpSTP5及其相关生物材料与应用。所述IpSTP5蛋白质具体可为如下A1)、A2)或A3)的蛋白质：A1)氨基酸序列是序列表中SEQ ID No.2的蛋白质；A2)将A1)的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有90％以上的同一性且具有相同活性的蛋白质；A3)在A1)或A2)的N末端或/和C末端连接蛋白质标签得到的融合蛋白质。IpSTP5蛋白质及其相关生物材料可用于正向调控山桐子果实含油率。

Description

植物含油率相关蛋白及其相关生物材料与应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域中植物含油率相关蛋白及其相关生物材料与应用。
背景技术
食用油是国计民生的重要战略物资，是国家粮食安全的重要组成。国际粮油经贸形势复杂多变，特别是在当今国际纷争不断的新形势下，食用油的国际形势非常严峻，整个国际上，油料作物面积不变，产量不增，需求上扬，价格上行，最为明显的是2021年较2020年价格上涨65.8％。
山桐子，又称山梧桐、半霜红、油葡萄、椅桐、水冬瓜等，起源于新生代第三纪，是距今6000万年的古老树种。山桐子为落叶乔木，中性偏阳性速生树种，树高10-20米左右，迄今为止发现最高的山桐子树王高达20多米。花单性，杂性株，一般表现为雌雄异株，偶有同株。其树型优美、花繁叶茂、果似珍珠；能抗低温-14℃，耐高温40℃，耐酸碱pH4.5-8.5，同时耐贫瘠，适应性强，被植物专家称之为“中华奇树”。山桐子耐寒、耐热、耐旱、耐瘠薄，对土质要求不严，能长树的地方就能种植，石头缝里也可生长，适合在全国推广、大面积造林。
山桐子果实富含油分，又有“树上油库”美誉，盛产期单株产鲜果平均10-30公斤，丰产期的单株产量可达50公斤以上，最高者甚至达到150-200公斤。按一亩50株、每株50公斤计算，则亩产鲜果保守计算可达1吨以上。研究表明，山桐子鲜果出油率为15％-23％，干果出油率22％-26％，果肉含油率43.6％，平均含油率为36.3％由于山桐子鲜果含油率达15-23％。为进一步提高山桐子产油率，挖掘并鉴定其功能基因越来越重要。目前，山桐子转化体系还不成熟，使得山桐子本身的基因功能验证还很困难。
病毒诱导基因沉默(Virus-Induced Gene Silencing，VIGS)技术是通过在病毒基因组中插入一段目标基因片段，侵染植物组织后，能够导致宿主同源RNA降解，从而发生转录后水平的基因沉默，从而快速验证目标基因功能。VIGS体系具有操作方法简便，周期性短以及能够避免植物转化等诸多优点，已广泛应用于植物基因功能鉴定的研究中。因此，采用VIGS方法快速、高效验证山桐子基因功能，将其应用于山桐子实际生产中。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明首先提供一种蛋白质，所述蛋白质名为IpSTP5，为如下A1)、A2)或A3)的蛋白质：
A1)氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质；
A2)将A1)所示的氨基酸序列经过一个以上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的由A1)衍生的或与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；
A3)在A1)、A2)或A3)的N末端或/和C末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质。
上述蛋白质中，所述蛋白质IpSTP5可来源于山桐子。
上述蛋白质中，序列表中SEQ ID No.2由507个氨基酸残基组成。
上文所述一个以上氨基酸残基具体可为十个以内的氨基酸残基。
上述应用中，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、98％或99％的同一性。
本发明还保护与蛋白质IpSTP5相关的生物材料，所述与蛋白质IpSTP5相关的生物材料，为下述B1)至B5)中的任一种：
B1)编码IpSTP5的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B1)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有B3)所述重组载体的转基因植物细胞系。
其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
上述生物材料中，B1)所述核酸分子为编码序列是SEQ ID No.1核苷酸的cDNA分子或DNA分子。
其中，序列表中SEQ ID No.1由1524个核苷酸组成，编码SEQ ID No.2所示的蛋白质。
上述生物材料中，B2)所述的含有所述核酸分子的表达盒(IpSTP5基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达IpSTP5的核酸分子，该核酸分子不但可包括启动IpSTP5基因转录的启动子，还可包括终止IpSTP5转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S；来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人(1999)Plant Physiology120:979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白质酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸曱酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利20071 0099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白质、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBO J.4:3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell等人(I985)Nature 313:810；Rosenberg等人(1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)Cell,64:671；Sanfacon等人Genes Dev.,5:141；Mogen等人(1990)Plant Cell,2:1261；Munroe等人(1990)Gene,91:151；Ballad等人(1989)Nucleic Acids Res.17:7891；Joshi等人(1987)Nucleic AcidRes.,15:9627)。
上述生物材料中，所述重组微生物具体可为酵母，细菌，藻和真菌。
本发明还提供调控所述蛋白质IpSTP5活性或含量的物质，或调控所述蛋白质IpSTP5的编码基因表达物质的应用，所述应用为下述任一种：
P1、在调控山桐子果实含油率中的应用；
P2、在制备调控山桐子果实含油率的产品中的应用；
P3、在山桐子育种中的应用。
上述应用中，所述蛋白质IpSTP5可来源于山桐子。
上述应用中，所述蛋白质IpSTP5的编码基因可为如下a1)或a2)或a3)所示的DNA分子：
a1)编码序列是序列表中SEQ ID No.1所示的DNA分子；
a2)与a1)限定的核苷酸序列具有90％或90％以上同一性，且编码上文所述蛋白质IpSTP5的DNA分子；
a3)在严格条件下与a1)或a2)限定的核苷酸序列杂交，且编码上文所述蛋白质IpSTP5的DNA分子。
上述应用中，所述调控所述蛋白质IpSTP5的编码基因可为进行如下6种调控中至少一种调控的物质：1)在所述基因转录水平上进行的调控；2)在所述基因转录后进行的调控(也就是对所述基因的初级转录物的剪接或加工进行的调控)；3)对所述基因的RNA转运进行的调控(也就是对所述基因的mRNA由细胞核向细胞质转运进行的调控)；4)对所述基因的翻译进行的调控；5)对所述基因的mRNA降解进行的调控；6)对所述基因的翻译后的调控(也就是对所述基因翻译的蛋白质的活性进行调控)。
上述应用中，所述调控可为促进或提高所述蛋白质IpSTP5的编码基因表达以提高山桐子的果实含油率，还可为抑制或降低所述蛋白质IpSTP5的编码基因表达以降低山桐子的果实含油率。
上述应用中，所述抑制或降低所述蛋白质IpSTP5的编码基因表达可为敲除所述蛋白质IpSTP5的编码基因的物质，和/或抑制或降低所述蛋白质IpSTP5的编码基因表达的物质。
上述应用中，所述抑制或降低所述蛋白质IpSTP5的编码基因表达可通过基因敲除实现或通过基因沉默实现。
所述基因敲除(gene knockout)是指通过同源重组使特定靶基因失活的现象。基因敲除是通过DNA序列的改变使特定靶基因失活。
所述基因沉默是指在不损伤原有DNA的情况下使基因不表达或低表达的现象。基因沉默以不改变DNA序列为前提，使基因不表达或低表达。基因沉默可发生在两种水平上，一种是由于DNA甲基化、异染色质化以及位置效应等引起的转录水平的基因沉默,另一种是转录后基因沉默，即在基因转录后的水平上通过对靶标RNA进行特异性抑制而使基因失活，包括反义RNA、共抑制(co-suppression)、基因压抑(quelling)、RNA干扰(RNAi)和微小RNA(miRNA)介导的翻译抑制等。
上述应用中，所述抑制或降低所述蛋白质IpSTP5的编码基因表达可为抑制或降低所述基因表达的试剂。所述抑制或降低所述基因表达的试剂可为敲除所述基因的试剂，如通过VIGS沉默所述基因的试剂。所述抑制或降低所述基因表达的试剂可以包含靶向所述基因的多核苷酸，例如sgRNA、shRNA、siRNA、miRNA或反义RNA。
上述应用中，所述抑制或降低所述蛋白质IpSTP5的编码基因表达，可为向山桐子中导入如下c1)-c4)任一种物质：
c1)抑制或降低所述蛋白质IpSTP5编码基因表达的核酸分子；
c2)含有c1)所述核酸分子的重组微生物。
上述应用中，c1)所述的核酸分子可为含有核苷酸序列是SEQ ID NO.1的第621-1026位或SEQ ID NO.1的第1123-1521位DNA分子的沉默载体。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了一种调控山桐子果实含油率的方法，包括通过抑制或降低山桐子基因组中所述蛋白质IpSTP5的编码基因的表达量来降低山桐子果实含油率。
上述抑制或降低山桐子基因组中所述蛋白质IpSTP5的编码基因的表达量可采用现有技术中的任何方式实现，以使基因产生缺失突变、插入突变或碱基变换突变，进而实现基因功能降低或丧失，具体可为化学诱变、物理诱变、RNAi、基因组定点编辑或同源重组等。
上述基因组定点编辑方法中，可采用锌指核酸酶(Zinc finger nuclease，ZFN)技术、类转录激活因子效应物核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease，TALEN)技术或成簇的规律间隔的短回文重复序列及其相关系统(Clustered regularlyinterspaced short palindromic repeats/CRISPR associated，CRISPR/Cas9 system)技术，以及其它能实现基因组定点编辑的技术。无论采取哪种方法，既可对上文所述蛋白的整个编码基因作为靶标，又可将调控上文所述蛋白编码基因表达的各个元件作为靶标，只要能实现基因功能丧失或降低即可。如可以将上文所述蛋白的编码基因的外显子或5’UTR等作为靶标。
上述方法中，所述抑制或降低山桐子基因组中所述蛋白质IpSTP5的编码基因的表达量通过病毒诱导的基因沉默实现。所述病毒诱导的基因沉默包括将VIGS基因沉默载体导入所述目的山桐子，所述沉默载体的靶点为SEQ ID NO.1的第621-1026位或SEQ ID NO.1的第1123-1521位。
上述方法中，所述抑制或降低山桐子基因组中所述蛋白质IpSTP5的编码基因的表达量可为向山桐子中导入如下任一种物质：
c1)抑制或降低上文所述蛋白质IpSTP5编码基因表达的核酸分子；
c2)含有c1)所述核酸分子的重组微生物。
上述方法中，c1)所述的核酸分子为含有核苷酸序列是SEQ ID NO.1的第621-1026位或SEQ ID NO.1的第1123-1521位DNA分子的沉默载体。
本发明公开了对山桐子IpSTP5基因进行沉默，降低山桐子果实含油率的方法。具体利用VIGS方法对出发山桐子中IpSTP5基因进行沉默，证明IpSTP5基因沉默后山桐子果实含油率显著下降，证实了IpSTP5基因为含油率相关基因，为山桐子品种选育提供新材料。
附图说明
图1为本发明实施例1中获得IpSTP5基因的过程。图1的A为GWAS分析42份山桐子材料的含油率和重测序的关联性；图1的B为高低油含油率材料在候选区间20个基因的表达情况。
图2为本发明所用载体示意图。其中pTRV2-IpSTP5_1载体插入的IpSTP5_1为IpSTP5序列(SEQ ID NO.1)的621-1026bp；pTRV2-IpSTP5_2载体插入的IpSTP5_2为IpSTP5序列(SEQ ID NO.1)的1123-1521bp。
图3为本发明实施例1中IpSTP5的VIGS处理后山桐子含油率检测结果，显示的值为平均值±标准误，三次生物学重复；p<1e-2，差异极显著，统计分析方法为单因素方差分析。
图4为本发明实施例1中IpSTP5的VIGS处理后山桐子IpSTP5表达水平检测结果，显示的值为平均值±标准误，三次生物学重复；p<1e-2，差异极显著，统计分析方法为单因素方差分析。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的pTRV1载体和pTRV2载体记载于非专利文献“Liu et al.,2002.Tobacco Rar1,EDS1 and NPR1/NIM1 like genes are required for N-mediatedresistance to tobacco mosaic virus.Plant J.30(4):415-429”，公众可从申请人处获得，以重复本实验。
下述实施例中的感受态农杆菌为GV3101为北京金沙生物科技有限公司产品。
下述实施例中的LB固体培养基配制方法如下(以1L为例)：蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠10g、琼脂粉15g，蒸馏水定容至1L，用5mol/L NaOH调pH至7.2，121℃灭菌30min。
下述实施例中的LB液体培养基配制方法如下(以1L为例)：蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠10g，蒸馏水定容至1L，用5mol/L NaOH调pH至7.2，121℃灭菌30min。
下述实施例中的抗生素硫酸卡那(Kana)浓度为50mg/L，抗生素利福平(Rif)浓度为50mg/L。
侵染液配方为：10mM MgCl2，10mM MES(pH5.7)，100μm AS。
实施例1
一、IpSTP5及其编码基因IpSTP5基因的发现
全基因组关联分析(GWAS)结合转录组(RNA-seq)分析获得候选基因。
为了分析山桐子的含油率的差异，本研究从不同地区收集42份山桐子材料并进行重测序。针对这42份材料的含油率进行GWAS分析，在Chr4找到一个候选区间，结合连锁不平衡距离150Kb，锁定候选区间为Chr4:13.99-14.35。同时，结合基因组注释文件，确定了该区间有20个候选基因。进一步结合高低油材料的转录组数据，发现IpSTP5的表达在两种材料之间表达差异巨大(见图1)。因此，将IpSTP5作为油含量相关的后续基因。
IpSTP5基因的编码序列如SEQ ID NO.1所示；该基因编码的蛋白命名为IpSTP5，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
SEQ ID NO.1
ATGGCCGGAGGAGGTTTTGTTGCCGATGGACCTGCCAGTGGCTTTAACGGTAAGATAACTGTGTCAGTGGTGATCACCTGCATTGTTGCTGCATCAAGTGGTCTCATTTTCGGCTATGACATTGGAATTTCAGGAGGTGTAACAACAATGGCACCATTTCTCATTAAATTTTTCCCTGAGGTATTCAGAAAGGCATCAGAGGTCAAAACAAACATGTATTGTCAATTTGATAGCCAAGTTTTAACAGCATTCACATCATCACTCTACATAGCAGGGTTAGCTTCTTCCCTTGTTGCTAGCCGCCTCACTGCAGCAATGGGCCTCAAAAACACCATGGTGCTTGGTGGCTGCACTTTCCTTGCCGGTGCCGCCATCAATGGTGGCGCTGCCAATATTGCCATGCTCCTACTTGGCCGTATTTTGCTTGGTTTTGGGGTTGGTTTCACTAACCAGGTTGCAACTCCTGTTTACCTATCAGAGGTAGCGCCTCCAAAATGGCGTGGTGCATTCGGCACTGGCTTCCAATTTTTTATTGGCATTGGGGTAGTAGCAGCCAATTGCATAAATTTTGGCATGGCGAAGCATAGCTGGGGCTGGCGTTTCTCCCTCGGCCTCGCCGTTGTACCCGCAGCTCTAATGACGATTGGTGCGCTCTTCATCTCAGATACGCCAAGTAGCCTAGTGGAGCGTGGCAAGGTTAAACAAGCTCGACAATCTCTGACCAAAGTTCGAGGAATCAACAGTAACGTGGAAGCTGAACTAGCTGATCTTCTTAAGTTCAATGAAATGTCAAAAGATGCTCAAAAAGAACCTTTTCTGACCATATTCGAGAGGCAGCATAGGCCTCACCTGGTGATGTCAATTGCTATACCTTTTTTCCAACAACTAACTGGGATTAACATAATTGCATTCTACGCGCCAGTTATTTTTCAATCAGTTGGCTTTGGAAGCAATTCAGCATTAATTGCAGCTATTGTGCTAGGATTAGTTAATCTTGGTTCAATCCTTGTGTCTACGGGTATGGTTGATCGGCATGGTCGAAGATTTTTGTTCATAATTGGAGGGATTCAAATGTTCATCTGTCAGGTTGCGGTGACAATAATGCTGGTTGTCACTACGGGCATTTCAGGCACGAAGCAGGTCTCCAAGGGCTACGGCATATTATTACTTGTTTTAATGTGCATCTATGCTTCTGGTTTTGGTTGGTCTTGGGGTCCCCTAAGCTGGCTCGTGCCAAGTGAAATATTCCCTATGAAAATTCGACCCACAGGCCAAAGCATAAATGTTGCTGTGAATTTTGCTACTACATTTGTGCTATCGCAAACCTTTTTGACCATGCTATGTCAATTCAAATTTGGCACATTCCTATTCTATGCTGGTTGGATTGCCTTGATGACAATTTTTGTCATGCTTTTCTTGCCGGAGACAAAAGGAATTCCCTTGGACTCGATGTATGCAGTGTGGGAACGGCACTGGTATTGGGGTCGGTTTGTTCGAGGCAGTGGTAGGCAAATCTTGGTCTAA
SEQ ID NO.2
MAGGGFVADGPASGFNGKITVSVVITCIVAASSGLIFGYDIGISGGVTTMAPFLIKFFPEVFRKASEVKTNMYCQFDSQVLTAFTSSLYIAGLASSLVASRLTAAMGLKNTMVLGGCTFLAGAAINGGAANIAMLLLGRILLGFGVGFTNQVATPVYLSEVAPPKWRGAFGTGFQFFIGIGVVAANCINFGMAKHSWGWRFSLGLAVVPAALMTIGALFISDTPSSLVERGKVKQARQSLTKVRGINSNVEAELADLLKFNEMSKDAQKEPFLTIFERQHRPHLVMSIAIPFFQQLTGINIIAFYAPVIFQSVGFGSNSALIAAIVLGLVNLGSILVSTGMVDRHGRRFLFIIGGIQMFICQVAVTIMLVVTTGISGTKQVSKGYGILLLVLMCIYASGFGWSWGPLSWLVPSEIFPMKIRPTGQSINVAVNFATTFVLSQTFLTMLCQFKFGTFLFYAGWIALMTIFVMLFLPETKGIPLDSMYAVWERHWYWGRFVRGSGRQILV*
二、山桐子IpSTP5的pTRV2载体构建
1、cDNA模板的获得
所用山桐子材料为生长于北京香山中国科学院植物研究所的山桐子雌株，其它山桐子雌株均可用于复现本实施例，公众可购买获得。
提取山桐子果实RNA，并反转录为cDNA。
2、以步骤1获得的cDNA为模板，采用引物IpSTP5_BamHⅠ_F1和引物IpSTP5_XhoⅠ_R1组成的引物对，以及引物IpSTP5_BamHⅠ_F2和引物IpSTP5_XhoⅠ_R2组成的引物对进行如下方式扩增。
表1构建IpSTP5的pTRV2载体所用引物
所述PCR扩增的反应体系及PCR反应程序如下：
表2普通PCR反应体系
反应组分 用量
2×Taq MasterMix 10μL
IpSTP5_BamHⅠ_F 1μL
IpSTP5_XhoⅠ_R 1μL
ddH2O 7μL
cDNA 1μL
Total Volume 20μL
瞬时离心混合均匀，PCR反应采用步降(Touch down)退火程序，前10个循环的退火温度降低0.5℃。设定程序为：
表3普通PCR扩增程序
步骤 温度(℃) 时间 备注
预变性 95 5min
变性 95 30s
退火 62 30s -0.5℃
延伸 72 30s 10cycles
变性 95 30s
退火 57 30s
延伸 72 30s 24cycles
延伸 72 5min
保存 4 ∞
PCR产物取4μL，经1％琼脂糖凝胶电泳检测，反应产物目的条带均约为400bp。
用诺唯赞公司生产的普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒切胶回收，方法参考试剂盒说明书。
将引物IpSTP5_BamHⅠ_F1和引物IpSTP5_XhoⅠ_R1组成的引物对扩增得到的特异性片段称为IpSTP5_1。
将引物IpSTP5_BamHⅠ_F2和引物IpSTP5_XhoⅠ_R2组成的引物对扩增得到的特异性片段称为IpSTP5_2。
使用NEB公司生产的限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ同时对pTRV2进行双酶切，酶切后回收大片段，得到酶切后的pTRV2。
使用诺唯赞公司生产的一步法重组试剂盒，将上述IpSTP5_1重组到酶切后的pTRV2上，操作方法按照试剂盒说明书，得到连接产物1。
使用诺唯赞公司生产的一步法重组试剂盒，将上述IpSTP5_2重组到酶切后的pTRV2上，操作方法按照试剂盒说明书，得到连接产物2。
取5uL连接产物1转入大肠杆菌DH5α，在含有卡那霉素(Kana)固体LB培养基上培养12h，挑取单克隆菌落放置到含有Kana液体LB中培养，菌液PCR鉴定为阳性克隆后，提取质粒，进行双酶切验证，验证成功的质粒，送擎科生物进行测序，测序正确后，得到成功构建的沉默载体pTRV2-IpSTP5_1(见图2)。对沉默载体pTRV2-IpSTP5_1进行结构描述如下：将pTRV2的限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ识别序列间的小片段替换为SEQ ID NO.1自5’末端起第621-1026位所示的双链DNA分子，保持载体pTRV2的其它序列不变，得到的沉默载体pTRV2-IpSTP5_1。
取5uL连接产物2转入大肠杆菌DH5α，在含有卡那霉素(Kana)固体LB培养基上培养12h，挑取单克隆菌落放置到含有Kana液体LB中培养，菌液PCR鉴定为阳性克隆后，提取质粒，进行双酶切验证，验证成功的质粒，送擎科生物进行测序，测序正确后，得到成功构建的沉默载体pTRV2-IpSTP5_2(见图2)。对沉默载体pTRV2-IpSTP5_2进行结构描述如下：将pTRV2的限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ识别序列间的小片段替换为SEQ ID NO.1自5’末端起第1123-1521位所示的双链DNA分子，保持载体pTRV2的其它序列不变，得到的沉默载体pTRV2-IpSTP5_1。
三、VIGS验证山桐子IpSTP5基因功能
1、侵染山桐子果实
所用山桐子材料为生长于北京香山中国科学院植物研究所的毛叶山桐子雌株，其它山桐子雌株均可用于复现本实施例，公众可购买获得。
将pTRV1、pTRV2，以及获得的质粒pTRV2-IpSTP5_1和pTRV2-IpSTP5_2分别转入农杆菌GV3101，在含有50mg/L Kana和50mg/L Rif(利福平)的固体LB培养基上28℃生长48h，挑取单克隆菌落放置到含有Kana和Rif的液体LB中28℃，150rmp培养过夜，菌液PCR验证为阳性克隆的，取一部分加入50％甘油保存菌液，其他用液体LB(含有Kana+Rif+10mM MES+20μM AS)扩培，分别得到摇好的GV3101/pTRV1农杆菌液、GV3101/pTRV2农杆菌液、GV3101/pTRV2-IpSTP5_1农杆菌液和GV3101/pTRV2-IpSTP5_2农杆菌液。
将摇好的GV3101/pTRV1农杆菌液、GV3101/pTRV2农杆菌液、GV3101/pTRV2-IpSTP5_1农杆菌液和GV3101/pTRV2-IpSTP5_2农杆菌液分别倒入50mL离心管中，室温4000rmp离心10min，弃上清，用侵染液重悬菌体，调整OD600至0.5，涡旋混匀后，室温静置3h，得到GV3101/pTRV1农杆菌重悬液、GV3101/pTRV2农杆菌重悬液、GV3101/pTRV2-IpSTP5_1农杆菌重悬液和GV3101/pTRV2-IpSTP5_2农杆菌重悬液。
设置对照对照组和两个实验组，具体如下：
将pTRV1农杆菌重悬液与pTRV2农杆菌重悬液等体积充分混合，得到对照组侵染菌液。使用一次性1mL注射器吸取制备的对照组侵染菌液，使用针头扎入长在树上的山桐子果实，再将菌液通过轻微压力直接注射果实内，使菌液在果实中扩散。
将pTRV1农杆菌重悬液与pTRV2-IpSTP5_1农杆菌重悬液等体积充分混合，得到实验组1侵染菌液。使用一次性1mL注射器吸取制备的实验组1侵染菌液，使用针头扎入长在树上的山桐子果实，再将菌液通过轻微压力直接注射果实内，使菌液在果实中扩散。
将pTRV1农杆菌重悬液与pTRV2-IpSTP5_2农杆菌重悬液等体积充分混合，得到实验组2侵染菌液。使用一次性1mL注射器吸取制备的实验组2侵染菌液，使用针头扎入长在树上的山桐子果实，再将菌液通过轻微压力直接注射果实内，使菌液在果实中扩散。
将注射侵染菌液后的山桐子果实用袋子罩起来，12h后，转入正常的自然条件下生长。
2、山桐子含油率测定
菌液侵染果实两周后，分别采取实验组1、实验组2和对照组果实，每组设置三次平行重复。120℃杀青30min，65℃烘干后采用核磁共振仪器检测果实含油率，实验进行了三次生物学重复，统计结果取三次的平均值，如图3所示。结果表明，IpSTP5沉默后，山桐子果实含油率显著下降，尤其导入pTRV2-IpSTP5_2载体的实验组2果实含油率下降更明显。
3、山桐子IpSTP5表达检测
菌液侵染果实两周后，分别采取实验组1、实验组2和对照组果实，使用TRIzol试剂抽提RNA，并反转录成cDNA，方法参考试剂盒说明书。
为了检测病毒载体的沉默效果，设计IpSTP5实时定量引物，采用实时荧光定量PCR检测果实中的表达量，内参使用IpPP2A，引物序列如表4所示：
表4检测IpSTP5基因相对表达的RT-qPCR引物
所述实时荧光定量PCR扩增的反应体如下：
表5 RT-qPCR反应体系
反应组分 用量
2×SuperRealPreMixPlus 7.5μL
IpSTP5_qF 0.3μL
IpSTP5_qR 0.3μL
ddH2O 3.9μL
cDNA 3μL
Total Volume 15μL
瞬时离心混合均匀，实时荧光定量PCR扩增反应程序如下：95℃预变性2min，95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸15s，进行40个循环。程序结束后导出数据进行分析，采用相对定量的方法对目的基因表达量进行分析。
实验结果如图4所示，IpSTP5表达量显著下降，尤其导入pTRV2-IpSTP5_2载体的实验组2果实IpSTP5表达量下降更明显，表明本发明所提供的特异性片段构建的VIGS载体，可以成功侵染山桐子果实，有效降低了山桐子IpSTP5基因的表达水平，并降低含油率，可以实现简单、高效、低成本鉴定山桐子IpSTP5基因功能。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (10)

1.蛋白质，其特征在于：所述蛋白质为如下A1)、A2)或A3)的蛋白质：
A1)氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质；
A2)将A1)所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的由A1)衍生的或与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；
A3)在A1)、A2)或A3)的N末端或/和C末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质。
2.与权利要求1所述的蛋白质相关的生物材料，其特征在于：所述生物材料，为下述B1)至B5)中的任一种：
B1)编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B1)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有B3)所述重组载体的转基因植物细胞系。
3.根据权利要求2所述的生物材料，其特征在于：B1)所述核酸分子为编码序列是SEQID No.1核苷酸的cDNA分子或DNA分子。
4.调控权利要求1所述蛋白质活性或含量的物质，或调控权利要求1所述蛋白质的编码基因表达物质的应用，其特征在于：所述应用为下述任一种：
P1、在调控山桐子果实含油率中的应用；
P2、在制备调控山桐子果实含油率的产品中的应用；
P3、在山桐子育种中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述调控为促进或提高所述蛋白质IpSTP5的编码基因表达以提高山桐子的果实含油率，或为抑制或降低所述蛋白质IpSTP5的编码基因表达以降低山桐子的果实含油率。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述抑制或降低权利要求1所述蛋白质的编码基因表达，为向山桐子中导入如下任一种物质：
c1)抑制或降低所述蛋白质IpSTP5编码基因表达的核酸分子；
c2)含有c1)所述核酸分子的重组微生物。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：c1)所述的核酸分子为含有核苷酸序列是SEQ ID NO.1的第621-1026位或SEQ ID NO.1的第1123-1521位DNA分子的沉默载体。
8.一种调控山桐子果实含油率的方法，其特征在于，包括通过抑制或降低山桐子基因组中所述蛋白质IpSTP5的编码基因的表达量来降低山桐子果实含油率。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述抑制或降低山桐子基因组中权利要求1所述蛋白质IpSTP5的编码基因的表达量通过沉默山桐子中所述蛋白质IpSTP5的编码基因实现。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述抑制或降低山桐子基因组中所述蛋白质IpSTP5的编码基因的表达量为向山桐子中导入如下任一种物质：
c1)抑制或降低权利要求1所述蛋白质编码基因表达的核酸分子；
c2)含有c1)所述核酸分子的重组微生物。
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