CN117561279A - 嵌合抗原受体的cd28/cd40共刺激结构域 - Google Patents
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Abstract
本公开内容是嵌合抗原受体的CD28/CD40共刺激结构域。合成方法包括，在所述方法中通过重叠聚合酶链反应(重叠PCR)的DNA合成，获得了3个DNA片段：HindIII‑CD19scFV‑28TM‑CD28‑CD40、CD28‑CD40‑CD3z和CD40‑CD3z‑tEGFR‑NotI。DNA装配CD19.28.40z组合每个构建的第一、第二和第三DNA片段以获得纯CD19.28.40z CAR基因。CD19.28.40z CAR基因连接到质粒或载体DNA中，然后CD19.28.40z CAR质粒基因转化至大肠杆菌(Escherichia coli)感受态细胞中。进行DNA测序检查。所述步骤获得了CD19.28.40z CAR基因级的质粒。
Description
技术领域
本发明涉及用于治疗白血病和淋巴瘤的嵌合抗原受体的创新共刺激结构域。
干预的背景
嵌合抗原受体T-细胞(CAR-T)是一种与施用基因修饰宿主免疫细胞以根除癌症有关的过继细胞治疗(ACT)。当前，基因修饰以表达抗-CD19(一种泛-B-细胞(pan-B-cell)抗原)的CAR-T细胞在B-细胞恶性肿瘤中表现出有希望的结果，尤其在复发的/难治性急性B-细胞成淋巴细胞性白血病/淋巴瘤(B-ALL)患者中，报道了70-93％的完全缓解率(completeresponse rate)。另一方面，CAR-T细胞在B-细胞非霍奇金淋巴瘤(B-NHL)中的功效不太大，完全缓解率为约20-70％。
CAR的结构主要由单链抗体可变区片段(scFv)细胞外结构域、铰链、跨膜结构域(TM)和共刺激结构域组成。第一代CAR仅由CD3ζ细胞内结构域组成，其在有限的CAR-T细胞持久性的情况下在临床试验中显示出令人失望的结果。因此，第二代和第三代CARs被开发出来，以通过并入一种或多种共刺激分子来改善CAR-T细胞功能。最近，并入了CD28或4-1BB共刺激结构域的CAR-T细胞被广泛用于治疗复发的/难治性B-ALL和B-NHL患者。尽管初始缓解率(initial response rates)高，但由于差的CAR-T细胞增殖以及CAR-T细胞在体内的长期持续存在，仍在显著数目的患者中出现复发。
因此，需要创新的CAR的共刺激分子以使T-细胞持久性和强烈的杀肿瘤作用两者达到最大，以增强抗肿瘤功能和存活结果。
公开内容概述
本公开内容是嵌合抗原受体的CD28/CD40共刺激结构域。合成方法包括，在所述方法中通过重叠聚合酶链反应(重叠PCR)的DNA合成，获得了3个DNA片段：HindIII-CD19scFV-28TM-CD28-CD40、CD28-CD40-CD3z和CD40-CD3z-tEGFR-NotI。DNA装配CD19.28.40z组合每个构建的第一、第二和第三DNA片段以获得纯CD19.28.40z CAR基因。CD19.28.40z CAR基因连接到质粒或载体DNA中，然后CD19.28.40z CAR质粒基因转化至大肠杆菌(Escherichiacoli)感受态细胞中。进行DNA测序检查。所述步骤获得了CD19.28.40zCAR基因级的质粒。
发明详述
定义
如本文所用的，“嵌合抗原受体(CAR)”是一种合成受体蛋白，其已被人工改造以在人免疫细胞上表达以靶向癌细胞表面上的特定抗原。CAR的结构包含三个主要部分；衍生自特异性靶向肿瘤抗原的单链可变区片段(scFv)的细胞外结构域继之以铰链区、跨膜结构域(TM)和通常衍生自T-细胞信号传导分子且充当CAR的功能结构域以传递下游T-细胞信号传导以活化T-细胞的细胞内共刺激结构域(图2)。
如本文所用的，“结构域”意指被翻译和折叠以形成CAR的特定结构的氨基酸链。
如本文所用的，“单链可变区片段(scFv)”意指衍生自与抗原结合的单克隆抗体的抗原结合片段(Fab)部分的多肽单链。它由经由间隔区序列连接的每个重链(H)和轻链(L)片段的恒定结构域和一个可变结构域组成。
如本文所用的，“铰链”意指将细胞外结构域连接至大部分衍生自CD8、CD28、IgG1或IgG4分子的跨膜结构域的多肽。
如本文所用的，“跨膜结构域(TM)”意指衍生自任何跨膜蛋白的多肽，例如T-细胞受体CD3z链、CD8、CD4或CD28分子。
如本文所用的，“共刺激分子或共刺激结构域或信号传导结构域”意指与抗原呈递细胞或癌细胞表面上的关联配体结合的T-细胞上的具体受体，其介导通过T-细胞的共刺激反应以促进基因转录。CAR的细胞内信号传导结构域由大部分衍生自CD3ζ链的细胞质免疫受体(immunoreceptor)酪氨酸基激活基序信号传导结构域组成，即所谓的第一代CAR。因此，已通过将大部分衍生自B7蛋白或肿瘤坏死因子受体超家族的一种或多种共刺激分子例如CD28、4-1BB、CD27、可诱导的T-细胞共刺激物(ICOS)、CD40或CD134分子并入CAR结构中以增强T-细胞反应而开发了第二代和第三代CARs。
如本文所用的，“肿瘤抗原或癌抗原”是由肿瘤细胞产生以触发宿主免疫应答的抗原物质。
如本文所用的，“CD19”是在所有B谱系细胞中表达的跨膜蛋白，并且可以用作B-细胞白血病和淋巴瘤中的免疫治疗的靶。
如本文所用的，“CD37”是四跨膜蛋白(tetraspanin)，其可以是免疫治疗的潜在靶，这是因为其表达主要限于成熟B-细胞恶性肿瘤，例如，滤泡淋巴瘤、套细胞淋巴瘤和慢性淋巴细胞白血病。
如本文所用的，“CD28共刺激受体”是T-细胞的天然受体，其与其他T-细胞受体共激活以促进T-细胞活化。并入了CD28共刺激结构域的CD19CAR-T细胞导致美国食品和药物管理局(US Food and Drug Administration)(FDA)批准用于治疗复发的/难治性急性B-细胞成淋巴细胞白血病或淋巴瘤(B-ALL)和B-细胞非霍奇金淋巴瘤(B-NHL)患者。
如本文所用的，“CD40共刺激受体”是在B细胞上天然表达的肿瘤坏死因子受体超家族的成员。CD40与T辅助细胞上表达的CD40配体(CD154)结合后，激活B-细胞的各种下游信号传导通路，以促进B-细胞增殖和分化。
如本文所用的，“嵌合抗原受体T-细胞(CAR-T细胞)”是使用基因转移方法以在表面上稳定表达CAR的基因修饰宿主T-细胞，其是重编程序的T-细胞以识别癌症抗原并根除癌细胞。
如本文所用的，术语“CAR-T细胞疗法或治疗”是与通过任何适当途径向癌症患者施用基因修饰CAR-T细胞以减轻患者来自癌症的体征和症状有关的过继细胞治疗(ACT)之一。
如本文所用的，术语“核酸或脱氧核酸或DNA”意指通过磷酸二酯键连接的可天然在DNA或RNA中发现的核苷的聚合物，或对于某些应用化学修饰的一些碱基、主链等。除非另有说明，否则本文使用的“核酸或核苷酸序列”意指以5’至3’方向显示的核酸序列信息。
如本文所用的，术语“多肽或蛋白质”意指氨基酸的聚合物，其是可以天然纯化或使用重组DNA技术合成的短多肽。除非另有说明，否则如本文所用的术语“多肽或氨基酸序列”意指以N-末端至C-末端方向显示的多肽序列信息。
本发明提供了编码嵌合抗原受体的创新共刺激分子的核酸，其已被人工改造以组合T-细胞和B-细胞信号传导分子两者，CD28/CD40，其与短GGG肽序列融合。创新的CD28/CD40共刺激分子促进CAR-T细胞持久性和强烈的杀肿瘤作用，以增强抗肿瘤功能和存活结果。
本发明提供了CD19CAR结构模型中CD28/CD40共刺激分子的创新重组DNA。编码CD28/CD40的核酸可以通过重叠聚合酶链反应从CD19.28z CAR和CD19.79a.40z CAR基因主链制备，并通过与特定设计的短核苷酸序列的DNA片段装配来装配以获得CD19.28.40z CAR基因。编码氨基酸序列的碱基序列可以从上述各结构域的氨基酸序列的NCBI RefSeq IDs或GenBank获得。
编码CD19.28.40z CAR基因的核酸可以插入载体中，并且载体可以将基因引入细胞中。例如，可以使用病毒载体，例如致癌反转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体或腺伴随病毒载体。例如，当使用反转录病毒时，反转录病毒包装细胞系基于适合于制备反转录病毒颗粒的LTR序列和包装信号序列。Phoenix双嗜性(Amphotropic)(AMPHO)细胞系能够携带反转录病毒载体，用于长期稳定生产反转录病毒颗粒。
本发明提供了使用待用CD19.28.40z CAR T-细胞处理的细胞系的方法。K562-CD19细胞系是被人工改造以表达CD19抗原的慢性髓细胞性白血病细胞系。Nalm6细胞系是具有CD19抗原的高表达的前-B-细胞急性成淋巴细胞白血病(ALL)。Raji细胞系是具有CD19和CD37抗原的高表达的伯基特淋巴瘤(BL)。Nalm6-FF(萤火虫萤光素酶)和Raji-FF细胞系是稳定的细胞系，其被转导以表达萤火虫萤光素酶和GFP。本发明人已经生产了CD19.28.40z CAR-T细胞以靶向表达CD19抗原的癌细胞。CD19.28.40z CAR基因可以以高转导效率在个别T-细胞中稳定表达。
CD19.28.40z CAR-T细胞通过分泌高水平的针对癌细胞的细胞因子，与天然表达或基因工程改造以表达的细胞系表面上的CD19抗原特异性结合。
比起其他相应的CD19CAR-T细胞来，无论细胞因子补充如何，本发明的CD19.28.40z CAR-T细胞都在CD19抗原暴露后是高度增殖且持久。
比起其他相应的CD19CAR-T细胞来，本发明中的CD19.28.40z CAR-T细胞的较高增殖能力的优点已经在细胞因子耗尽的培养基中以各种E:T比产生了有效的针对CD19阳性癌细胞的细胞毒活性。
比起其他相应的CD19CAR-T细胞来，目前的CD19.28.40z CAR-T细胞可以在保持幼稚和中央记忆T-细胞群体并减少T-细胞衰竭表型的情况下在用CD19抗原阳性癌细胞重复刺激后扩充。
本发明中用CD28/CD40共刺激分子对诸如CD37等的scFv的修饰可用于增加CAR-T细胞的增殖和细胞毒能力。
本发明中并入了CD28/CD40信号传导分子的CAR可用于产生其他类型的细胞，例如CAR-天然杀伤细胞、同种异体CAR-T细胞、基因编辑的CAR-T细胞和其他造血表达-CAR细胞，其可用于靶向各种癌细胞。
因此，本发明中的CD28/CD40共刺激分子已增强了CAR-T细胞的增殖和细胞毒功能，其可用作各种类型癌症中的治疗方法。
本发明将通过实施例进行描述，其意欲服务于本发明的结果之一。
发明的公开内容
如下通过基因工程产生了新的第三代CD19CAR，其并入了复合T-细胞；CD28和B-细胞共刺激分子；CD40(CD19.28.40z)(图3)，并测试免疫学过程：
1.通过重叠聚合酶链反应(重叠PCR)的DNA合成
2.CD19.28.40z DNA装配
3.CD19.28.40z基因连接和转化
4.转染和反转录病毒上清液收集
5.使用反转录病毒介导的基因转移系统从健康供体产生CD19.28.40z CAR-T细胞
6.体外测试
7.体内测试
解释了产生过程和免疫学测定：
1.通过重叠聚合酶链反应(重叠PCR)的DNA合成
CD19scFv.28z CAR和CD19scFv.79A.40z CAR是使用由本发明人设计用于装配总共3个DNA片段的特异性的6个引物的重叠PCR的模板。然后产生复合了CD28.40z的共刺激结构域的CD19CAR，如图5中所示的。
1.1)片段1 DNA合成：HindIII-CD19scFV-28TM-CD28-CD40
设计了用于重叠PCR的与CD19scFv.28z CAR模板一起使用的引物。正向引物含有酶HindIII(AAGCTT)作为起始序列。正向和反向引物两者为了在反应中更高的特异性和稳定性均设计为具有33bp，其中GC百分比为50-60％且解链温度(Tm)为70-90摄氏度。
用于DNA片段1合成的引物：
-正向引物：HindIII-19CARscFv
5’AAGCTTATGCTGCTGCTGGTGACCAGCCTGCTG 3’
-反向引物：CD40-GGG-CD28IC
5’CTTTTTCCCTCCGCCGGAGCGATAGGCTGCGAA 3’
用于PCR的组分(MAX DNA聚合酶)：
用于PCR的最佳条件：
未纯化的HindIII-CD19scFV-28TM-CD28-CD40是反应完成后的产物。
1.2)HindIII-CD19scFV-28TM-CD28-CD40的DNA纯化
通过琼脂糖凝胶电泳分析DNA以确认产物的正确大小。使用在(1x)Tris/硼酸盐/EDTA(TBE)缓冲液中添加有溴化乙锭的1-2％浓度的琼脂糖凝胶。用于电泳的设置为120-150V达30-40分钟。然后，拍摄凝胶图像，并提取和纯化正确大小的DNA。测量DNA的量并保持于-20摄氏度。
1.3)片段2DNA合成：CD28-CD40-CD3z
设计了用于重叠PCR的与CD19scFv.79A.40z CAR模板一起使用的引物。在正向引物的末端含有CD28的cDNA，而对于反向引物为CD3ζ的cDNA。正向和反向引物两者为了在反应中更高的特异性和稳定性均设计为具有33bp，其中GC百分比为50-60％且解链温度(Tm)为70-90摄氏度。
用于DNA片段2合成的引物：
-正向引物CD28IC-GGG-CD40
5’GCAGCCTATCGCTCCGGCGGAGGGAAAAAGGTG 3’
-反向引物CD3z-CD40
5’GCTGAACTTCACCCGCTGTCTCTCCTGCACTGA 3’
用于PCR的组分(MAX DNA聚合酶)：
用于PCR的最佳条件：
未纯化的CD28-CD40-CD3z是反应完成后的产物。
1.4)CD28-CD40-CD3z的DNA纯化
通过琼脂糖凝胶电泳分析DNA以确认产物的正确大小。使用在(1x)Tris/硼酸盐/EDTA(TBE)缓冲液中添加有溴化乙锭的1-2％浓度的琼脂糖凝胶。用于电泳的设置为120-150V达30-40分钟。然后，拍摄凝胶图像，并提取和纯化正确大小的DNA。测量DNA的量并保持于-20摄氏度。
1.5)片段3DNA合成：CD40-CD3z-tEGFR-NotI
设计了用于重叠PCR的与CD19scFv.28z CAR模板一起使用的引物。在反向引物的末端含有酶NotI(GCGGCCGC)。正向和反向引物两者为了在反应中更高的特异性和稳定性均设计为具有33bp，其中GC百分比为50-60％且解链温度(Tm)为70-90摄氏度。
用于DNA片段3合成的引物：
-正向引物CD40-CD3z
5’GTGCAGGAGAGACAGCGGGTGAAGTTCAGCAGA 3’
-反向引物NotI-tEGFR
5’GCGGCCGCTCACATGAAGAGGCCGATCCCCAGG 3’
用于PCR的组分(MAX DNA聚合酶)：
用于PCR的最佳条件：
未纯化的CD40-CD3z-tEGFR-NotI是反应完成后的产物。
1.6)CD40-CD3z-tEGFR-NotI的DNA纯化
通过琼脂糖凝胶电泳分析DNA以确认产物的正确大小。使用在(1x)Tris/硼酸盐/EDTA(TBE)缓冲液中添加有溴化乙锭的1-2％浓度的琼脂糖凝胶。用于电泳的设置为120-150V达30-40分钟。然后，拍摄凝胶图像，并提取和纯化正确大小的DNA。测量DNA的量并保持于-20摄氏度。
2.用于CD19.28.40z的DNA装配
使用重叠PCR产物利用HiFi DNA装配克隆(Assembly Cloning)的DNA装配：
DNA的3个片段比例1：1：1 总量0.03-0.2皮摩尔
NEBBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix 量10微升
蒸馏水 添加至20微升的总体积
DNA于50摄氏度温育30分钟-1小时。来自3个片段的CD19.28.40z的产物示于图6中。
然后，进行PCR检查以确认DNA的完整。
-正向引物HindIII-19CARscFv
5’AAGCTTATGCTGCTGCTGGTGACCAGCCTGCTG 3’
-反向引物NotI-tEGFR
5’GCGGCCGCTCACATGAAGAGGCCGATCCCCAGG 3’
用于PCR的组分(MAX DNA聚合酶)：
用于PCR的最佳条件：
未纯化的CD19.28.40z CAR是反应完成后的产物。
CD19.28.40z CAR的DNA纯化
通过琼脂糖凝胶电泳分析DNA以确认产物的正确大小。使用在(1x)Tris/硼酸盐/EDTA(TBE)缓冲液中添加有溴化乙锭的1-2％浓度的琼脂糖凝胶。用于电泳的设置为120-150V达30-40分钟。然后，拍摄凝胶图像，并提取和纯化正确大小的DNA。测量DNA的量并保持于-20摄氏度。
3.CD19.28.40z基因连接和转化
CD19.28.40z基因和质粒需要用酶HindIII和NotI切割用于特异性基因连接(图6)。用于限制酶切割的组分：
(总体积30微升)
将样品在水浴中于37摄氏度温育至少16小时。未纯化的限制性酶切割的CD19.28.40z CAR和质粒是反应完成后的产物。
3.1)限制酶切割后的CD19.28.40z CAR和质粒的纯化
使用纯化试剂盒纯化限制酶切割后的DNA和质粒。测量DNA和质粒的量并保持于-20摄氏度。
3.2)CD19.28.40z CAR连接入质粒载体中
使用T4连接酶连接纯化的CD19.28.40z CAR和质粒(图6)。用于基因连接的组分：
样品在PCR仪中于16摄氏度温育至少16小时。反应完成后构建含有CD19.28.40zCAR基因的质粒。
3.3)含有CD19.28.40z CAR的质粒的转化和纯化以及完整检查使用NEB 5-α感受态大肠杆菌将含有CD19.28.40z CAR基因的质粒转移至大肠杆菌。然后，将细菌培养在含有100微克/毫升氨苄青霉素的LB琼脂培养皿上，并在培养箱中于37摄氏度温育16小时。
进行了PCR检查。正向和反向引物两者为了在反应中更高的特异性和稳定性均设计为具有33bp，其中GC百分比为40-50％且解链温度(Tm)为70-80摄氏度。
-正向引物LZRS-HindIII
5’GATCCCAGTGTGGTGGTAGGGAATTCAAAGCTT 3’
-反向引物LZRS-NotI
5’TATTTTATCGTCGACCACTGTGCTGGCGGCCGC 3’
用于PCR的组分(MAX DNA聚合酶)：
用于PCR的最佳条件：
通过琼脂糖凝胶电泳分析含有CD19.28.40z CAR的质粒以确认产物的正确大小。使用在(1x)Tris/硼酸盐/EDTA(TBE)缓冲液中添加有溴化乙锭的1-1.5％浓度的琼脂糖凝胶。用于电泳的设置为120-150V达30-35分钟。然后，拍摄凝胶图像。因此，鉴定了正确的大肠杆菌菌落。
3.4)含有CD19.28.40z CAR的质粒的扩增
将含有具有CD19.28.40z CAR的质粒的正确大肠杆菌在含有100微克/毫升氨苄青霉素的LB液体培养基中培养，并在振荡培养箱中温育16小时。纯化含有CD19.28.40z CAR的质粒。测量DNA的量并保持于-20摄氏度。
通过使用4个引物的DNA测序确认了准确性，所述引物设计为19-33bp，其中GC百分比为30-50％且解链温度(Tm)为50-80摄氏度。
CD19.28.40z CAR测序中使用的引物：
-正向引物LZRS-HindIII
5’GATCCCAGTGTGGTGGTAGGGAATTCAAAGCTT 3’
-正向引物CD28TM
5’ATGTTCTGGGTGCTGGTGG 3’
-正向引物CD3z-ITAM2
5’CCAGGAAGGCCTGTATAACG 3’
-反向引物tEGFR
5’TGATGGAGATGTGATAATTTCAGG 3’
含有CD1928.40z CAR的整个质粒被完全确认并保持于-20摄氏度。
4.反转录病毒包装细胞系转染和病毒上清液收集
通过基于脂质的转染(非脂质体脂质试剂)将正确的CD19.28.40z CAR基因转染至反转录病毒包装细胞系中。下面将解释细节：
第-1天将反转录病毒包装细胞在含有具有胎牛血清和青霉素-链霉素的培养基的平板中于37摄氏度在CO2培养箱中培养1天。
第0天进行使用转染试剂盒的CD19.28.40z CAR的转染，且然后将转染的细胞在CO2培养箱中于37摄氏度温育2天。
第2天将细胞转移至新瓶中，并在CO2培养箱中在有嘌呤霉素的情况下于37摄氏度培养，直到细胞适当汇合用于产生含有CD19.28.40z CAR基因的病毒上清液为止。
然后，将细胞在没有嘌呤霉素的情况下在CO2培养箱中于37摄氏度培养2天。之后，通过离心和过滤收集病毒上清液。
所有病毒上清液均保持于-80摄氏度。
5.使用反转录病毒介导的基因转移系统从健康供体产生CD19.28.40z CAR-T细胞第0天分离经由外周静脉从健康志愿者供体获得的全血的外周血单核细胞(PBMC)。通过免疫磁珠从PBMC中分离CD3+细胞，并使用Dynabeads人T-激活物(Human T-Activator)CD3/CD28进行激活。下面将解释细节：
-使用Lymphoprep以1,500RPM 25摄氏度将全血离心30分钟。然后分离血沉棕黄层或PBMC层并用磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤。进行离心达另外两轮。通过以1：1的比例用Turk溶液进行计数来测量PBMC。
-通过使用人CD3微珠(microbeads)抗体和MACS缓冲液从PBMC分离CD3+细胞。然后，将样品在冰上(4摄氏度)温育15分钟并用MACS缓冲液洗涤。进行利用300RCF 4摄氏度的离心达10分钟。然后用磁珠分离PBMC染色CD3+细胞。通过计数锥虫蓝染色的活细胞来测量细胞。
-CD3+细胞用1:1的比例的抗体CD3/CD28微珠激活，并在IL-2补充的情况下培养。
第3天在以2100RPM 32摄氏度离心1小时的情况下使用Retronectin片段包被的平板将CD19.28.40z CAR基因反转录病毒转导入CD3+细胞中。将CAR-转导的CD3+细胞在CO2培养箱中于37摄氏度培养2天。
第7天通过流式细胞术进行转导功效和截短的表皮生长因子受体(tEGFR)-表达CD19.28.40z CAR选择(图7)。CAR-T细胞用含有hEGFR-生物素化的抗体的MACS缓冲液进行染色。将样品在冰上(4摄氏度)温育15分钟，用MACS缓冲液洗涤并在300RCF 4摄氏度离心10分钟。然后，使用生物素微珠对细胞进行染色、温育、洗涤并再次离心。经由磁柱分离细胞并在CO2培养箱中于37摄氏度培养1天。
第8天将CD19.28.40z CAR-T细胞进行计数，用深低温保藏介质冷冻，第一天保持于-80℃，且然后转移到-196摄氏度的氮气罐(nitrogen tank)中直到进一步实验为止。
6.体外测试
6.1表达CD19的肿瘤细胞刺激后CD19.28.40z CAR T-细胞的T-细胞增殖测定-将CD19CAR-T细胞与100Gyγ-照射的肿瘤靶细胞(K562-表达CD19)以1:1的效应物与靶(E:T)比值共培养，并于37摄氏度在有或没有IL-2补充的情况下培养14天。从第3天后起，通过计数锥虫蓝染色的活细胞来测量T-细胞增殖。将结果与在相同条件下产生和培养的CD19.28z、CD19.BBz和CD19.79A.40z CAR-T细胞进行比较(图8)。
6.2)在表达表面抗原CD19的肿瘤刺激后的CD19.28.40z CAR-T细胞的细胞毒活性(共培养测定)
-将CD19CAR-T细胞与肿瘤靶细胞(Nalm6-表达基因GFP萤火虫萤光素酶)以1:1、1:4、1:8和1:16的效应物与靶(E:T)比值在不含IL-2的培养基中共培养并于37摄氏度温育12天。通过流式细胞术分析测量残留的肿瘤并与在相同条件下产生的CD19.28z、CD19.BBz和CD19.79A.40z CAR-T细胞进行比较(图9)。
6.3)在表达表面抗原CD19的肿瘤刺激后的CD19.28.40z CAR-T细胞的细胞因子分泌-将未转导的和CD19CAR-T细胞与γ-照射的表达CD19抗原的K562细胞系以1:1的E:T比值在没有IL-2补充的情况下共培养16小时。收获培养基并通过ELISA方法测量IL-2、IFN-γ和TNF-α的细胞因子水平。CD19CAR-T细胞的细胞因子分泌测定示于图10中。
6.4)在重复的表达表面抗原CD19的肿瘤刺激后的CD19.28.40z CAR-T细胞的T-细胞免疫表型(immunophenotypes)
-将未转导的和CD19CAR-T细胞每周用γ-照射的Nalm6细胞系以1:1的E:T比值刺激达连续三周，并连续在有IL-2补充的情况下培养。通过计数锥虫蓝染色的活细胞来测量CD19CAR-T细胞扩充，并在指示的时间点通过FACS分析评估T-细胞免疫表型。CD19CAR-T细胞的CAR-T细胞扩充和T-细胞免疫表型测定示于图11-12中。
6.5)在表达CD37的肿瘤细胞刺激后的CD37.28.40z CAR T-细胞的T-细胞增殖测定-将未转导的和CD37CAR-T细胞与γ-照射的表达CD37抗原的Raji细胞系以1:1的效应物与靶(E:T)比值共培养一次，并且在没有IL-2补充的情况下连续培养。通过在指示的时间点计数锥虫蓝染色的活细胞来测量CD37 CAR-T细胞增殖。CD37 CAR-T细胞的增殖测定示于图13中。
6.6)在表达表面抗原CD37的肿瘤刺激后的CD37.28.40z CAR-T细胞的细胞毒活性(共培养测定)
-将未转导的和CD37CAR-T-细胞与表达CD37抗原和萤火虫-GFP的Raji细胞系共培养。CD37CAR-T细胞和Raji-FF细胞两者均以1:1的E:T比值在没有IL-2补充的情况下培养。在指示的时间点通过FACS分析评估靶细胞系的百分比。CD37 CAR-T细胞的细胞毒性测定示于图14中。
7.体内测试
CD19.28.40z CAR-T细胞在Nalm6-接种的小鼠模型中的体内功效
-在第0天经由尾静脉注射用0.5×106个Nalm6-FF细胞接种NOD-SCID共同-γ链敲除(NSG)小鼠，继之以一周后注射1×106个tEGFR-或CD19CAR-T细胞。在指示的时间点使用生物发光成像(BLI)测量肿瘤负荷。肿瘤负荷BLI示于图15中。
实施例
实施例1：CD19.28.40z CAR基因序列
CD19.28.40z CAR结构的图示于图1-3中。CD28/CD40蛋白的氨基酸序列示于图4中。CD28、CD40的核苷酸序列以及连接CD28和CD40的一些核苷酸序列如下所示。
<CD28共刺激结构域>
-核苷酸 (SEQ ID NO：1)
<连接CD28和CD40的一些核苷酸序列>
-核苷酸 (SEQ ID NO：2)
GGCGGAGGG
<CD40共刺激结构域>
-核苷酸 (SEQ ID NO：3)
-CD28/CD40蛋白的翻译的氨基酸序列 (SEQ ID NO：4)
实施例2：CD19.28.40z CAR基因构建
衍生自鼠FMC63单克隆抗体的CD19-特异性单链可变区片段(scFV)与修饰的人IgG4铰链继之以CD28跨膜结构域融合。然而细胞内结构域并入了CD28(GenBank:J02988.1)和CD40(GenBank:NM_001250)，其继之以细胞质CD3ζ结构域。CD19.28.40z CAR基因构建与自切割T2A和截短形式的表皮生长因子受体(tEGFR)序列融合，其便于转导的CAR-T细胞的选择标记。
实施例3：CAR反转录病毒生产
CD19.28.40z CAR基因被亚克隆到LZRS-pBMN-Z载体的Hind III和Not I位点中。通过在Phoenix-双嗜性(AMPHO)细胞系中转染上述含有CD19.28.40z CAR的载体来产生反转录病毒生产。转染48小时后收获病毒上清液，并冷冻用于后面的T-细胞转导。
实施例4：PBMCs分离、CD3+T-细胞分离和活化
全血是从个体供体收集的。将血液用菲可帕克分层，并将样品以1500rpm离心30分钟，以分离外周血单核细胞(PBMCs)层。通过CD3微珠从PBMCs分离CD3+T-细胞，并以1:1的比例与抗-CD3/CD28珠混合用于T-细胞活化。CD3+T-细胞在含有10％人血清和白细胞介素-2(IL-2)50IU/mL补充的CTL培养基(RPMI 1640培养基、0.8mM L-谷氨酰胺、1％青霉素-链霉素和0.5μM 2-巯基乙醇)中培养，并在病毒转导前于37℃温育3天。
实施例5：CAR-T细胞转导和选择
将第3天活化的CD3+细胞用retronectin包被的平板和反转录病毒上清液通过以2100rpm于32℃的旋转感染(spinfection)转导1小时，并在CTL培养基中培养且于37℃温育4天。在第7天，通过使用荧光标记的tEGFR的FACS分析来分析CAR-阳性T-细胞的转导功效，并通过抗生物素磁珠纯化CAR-阳性T-细胞。CAR-T选择的转导功效和纯度示于图7中。
实施例6：在表达CD19的K562细胞系刺激后CD19.28.40z CAR-T细胞表现出更大的T-细胞增殖
将未转导的和CD19CAR-T细胞与表达CD19抗原的γ-照射的K562细胞系以1:1的效应物与靶(E:T)比值共培养一次，并在有或没有IL-2补充的情况下连续培养。通过在指示的时间点计数锥虫蓝染色的活细胞来测量CD19 CAR-T细胞增殖。CD19 CAR-T细胞的增殖测定示于图8中。
实施例7：CD19.28.40z CAR-T细胞在共培养细胞毒性测定中有效根除表达CD19的Nalm-6细胞系
将未转导的和CD19CAR-T细胞与表达CD19抗原并人工改造以表达萤火虫-GFP的Nalm6-FF细胞系共培养。CD19CAR-T细胞和Nalm6-FF细胞两者以各种E:T比值在没有IL-2补充的情况下培养。在指示的时间点通过FACS分析评估靶细胞系的百分比。CD19 CAR-T细胞的细胞毒性测定示于图9中。
实施例8：与对照CAR-T细胞相比，CD19.28.40z CAR-T细胞在用CD19阳性靶细胞刺激后产生相似水平的白细胞介素-2(IL-2)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和干扰素-γ(IFN-γ)浓度。
将未转导的和CD19CAR-T细胞与γ-照射的表达CD19抗原的K562细胞系以1:1的E:T比值在没有IL-2补充的情况下共培养16小时。收获培养基并通过ELISA方法测量IL-2、IFN-γ和TNF-α的细胞因子水平。CD19CAR-T细胞的细胞因子分泌测定示于图10中。
实施例9：与对照CAR-T细胞相比，在用表达CD19的Nalm6细胞系连续刺激三次后，CD19.28.40z CAR-T细胞在具有减少的T-细胞衰竭表型发情况下表现出更大的增殖并保持了幼稚和中央记忆T-细胞亚群。
将未转导的和CD19CAR-T细胞每周用γ-照射的Nalm6细胞系以1:1的E:T比值刺激达连续三周，并连续在有IL-2补充的情况下培养。在指示的时间点通过计数锥虫蓝染色的活细胞来测量CD19CAR-T细胞扩充，并通过FACS分析评估T-细胞免疫表型。CD19CAR-T细胞的CAR-T细胞扩充和T-细胞免疫表型测定示于图11-12中。
实施例10：在表达CD37的Raji细胞系刺激后CD37.28.40z CAR T-细胞表现出更大的T-细胞增殖
将未转导的和CD37CAR-T细胞与γ-照射的表达CD37抗原的Raji细胞系以1:1的效应物与靶(E:T)比值共培养一次，并且在没有IL-2补充的情况下连续培养。通过在指示的时间点计数锥虫蓝染色的活细胞来测量CD37 CAR-T细胞增殖。CD37 CAR-T细胞的增殖测定示于图13中。
实施例11：在共培养细胞毒性测定中，CD37.28.40z CAR-T细胞有效根除表达CD37的Raji细胞系
将未转导的和CD37CAR-T-细胞与表达CD37抗原和萤火虫-GFP的Raji细胞系共培养。CD37CAR-T细胞和Raji-FF细胞两者均以1:1的E:T比值在没有IL-2补充的情况下培养。在指示的时间点通过FACS分析评估靶细胞的百分比。CD37 CAR-T细胞的细胞毒性测定示于图14中。
实施例12：CD19.28.40z CAR-T细胞有效抑制Nalm6-接种的小鼠模型中的肿瘤负荷在第0天经由尾静脉注射用0.5×106个Nalm6-FF细胞接种NOD-SCID共同-γ链敲除(NSG)小鼠，继之以一周后注射1×106个tEGFR-或CD19CAR-T细胞。在指示的时间点使用生物发光成像(BLI)测量肿瘤负荷。肿瘤负荷BLI示于图15中。
附图简述
图1暴露于表达CD19抗原的B-细胞后CD19.z和CD19.28.40z CAR-T细胞活化的图。(CAR：嵌合抗原受体；scFv：单链可变区片段；28TM：CD28跨膜；z：CD3ζ，28.40z：CD28/CD40/CD3z)
图2CAR产生和结构的图。(scFv：单链可变区片段)
图3(A)CD28/CD40的重组DNA和(B)CD19.28.40z CAR结构的图。
图4CD28/CD40蛋白的氨基酸序列(SEQ NO：4)。
图5显示通过重叠PCR扩增的CD19scFV.28.40z CAR的基因工程。CD19scFv.28zCAR基因和CD19scFv.79A.40z CAR基因作为模板。在琼脂糖凝胶上显示了与标准DNA(DNA梯)类似的大小。
图6显示CD19.28.40z DNA装配和连接的构建被亚克隆到质粒载体中。在琼脂糖凝胶上显示了与标准DNA(DNA梯)类似的大小。通过DNA序列分析验证了CD19.28.40z CAR基因的正确装配。
图7显示通过使用荧光标记的截短的表皮生长因子(tEGFR)通过FACS分析检测CD19.28.40z CAR-T细胞。在将反转录病毒CD19.28.40z CAR转导入T-细胞中后，检测到CD19.28.40z CAR阳性T-细胞。结果显示了转导功效(预选择(pre-selection))和CD19CAR阳性T-细胞的纯度(后选择(post-selection))。
图8显示与对照CAR T-细胞相比，CD19.28.40z CAR T-细胞在用表达CD19的K562细胞系刺激后表现出更大的T-细胞增殖，所述K562细胞系在有或没有白细胞介素-2(IL-2)的情况下培养。
图9显示与对照CAR T-细胞相比，CD19.28.40z CAR-T细胞在不同的效应细胞与靶细胞比值(E:T)有效根除CD19阳性Nalm-6细胞系，直到实验的最后日期为止。
图10显示与对照CAR-T细胞相比，CD19.28.40z CAR-T细胞在用CD19阳性靶细胞刺激后产生相似水平的(A)白细胞介素-2(IL-2)、(B)肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和(C)干扰素-γ(IFN-γ)。
图11显示与对照CAR-T细胞相比，CD19.28.40z CAR-T细胞在用表达CD19的Nalm6细胞系连续刺激三次后表现出更大的T-细胞扩充。
图12显示与对照CAR-T细胞相比，在用表达CD19的Nalm6细胞系连续刺激3次后，CD19.28.40z CAR-T细胞(A)保持了幼稚和中央记忆T-细胞亚群，并且(B)减少了T-细胞衰竭表型。
图13显示与对照CAR T-细胞相比，CD37.28.40z CAR T-细胞在用表达CD37的Raji细胞系刺激后表现出更大的T-细胞扩充，所述Raji细胞系在没有白细胞介素-2(IL-2)的情况下培养。
图14显示与对照CAR T-细胞相比，在1:1的效应细胞与靶细胞比值(E:T)，CD37.28.40z CAR-T细胞有效根除表达CD37的Raji细胞系，直到实验的最后日期为止。
图15显示NOD-SCID共同-γ链敲除(NSG)小鼠中的CD19.28.40z CAR-T细胞的体内功效，所述小鼠在第0天经由尾静脉注射用Nalm6-FF细胞接种，继之以一周后注射tEGFR-或CD19CAR-T细胞。在指示的时间点使用生物发光成像(BLI)测量肿瘤负荷。
实施本发明的最佳方式
正如在发明的完整公开内容中已经提到的。
Claims (3)
1.嵌合抗原受体的CD28/CD40共刺激结构域，其包含：
具有来自下述的氨基酸序列的重组CD28/CD40多肽
2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体的CD28/CD40共刺激结构域，其中合成方法包括：
a)在所述步骤中通过重叠聚合酶链反应(重叠PCR)的DNA合成，获得了3个DNA片段：HindIII-CD19scFV-28TM-CD28-CD40、CD28-CD40-CD3z和CD40-CD3z-tEGFR-NotI，
b)在所述步骤中DNA装配CD19.28.40z组合每个片段构建的第一、第二和第三DNA以获得纯CD19.28.40z CAR基因，
c)CD19.28.40z基因连接到质粒或载体DNA中，且CD19.28.40z质粒基因转化至大肠杆菌(Escherichia coli)感受态细胞中，进行DNA测序检查，所述步骤获得了CD19.28.40zCAR基因级的质粒。
3.根据权利要求1或2所述的嵌合抗原受体的CD28/CD40共刺激结构域，其包含T-细胞和B-细胞信号传导受体。
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