CN117551808A - 玉米抗盐qtl基因及其分子标记和应用 - Google Patents
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Abstract
本申请提供了一种玉米抗盐QTL基因ZmSnRK2.10，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1；本申请还提供了其编码蛋白及其在调控禾本科植物对盐胁迫的敏感性中的应用。此外，本申请在玉米抗盐QTL基因ZmSnRK2.10启动子中发现了玉米抗盐分子标记ZmSALT4，可用于鉴定玉米抗盐性能，进而用于抗盐玉米育种。
Description
技术领域
本申请属于农业分子生物学领域，具体地，本申请提供了一种玉米抗盐QTL基因及其分子标记和应用。
背景技术
盐胁迫是农业生态中的主要非生物胁迫之一，是影响全球农业可持续发展的主要环境限制因素。近年来，全球耕地盐碱化程度的不断恶化进一步加重了盐碱对农业生产的威胁。我国有15亿亩盐碱地，其中有近5亿亩可耕种盐碱地，培育耐盐碱作物，对提高盐碱地的利用效率，合理应对盐碱胁迫对农业生产(尤其是主要作物生产)的负面影响，增加粮食产量具有重要实践意义。
玉米抗盐应答是一个复杂的生理过程，涉及去离子毒害、渗透调节等多个方面。已有研究表明，玉米自然群体的遗传多样性十分丰富，不同玉米自交系的抗盐能力存在显著差异，这些差异是多种生理性状的综合体现，属于多基因控制的数量性状(QTL)(Luo etal.,2019；Zhang et al.,2019)。在此基础上，一些研究试图通过转录组、蛋白质组及代谢组分析来解析玉米自然群体中抗盐性变异的分子机制，但这些研究大多止步于组学数据分析，缺乏机制解析(Zhang et al.,2015；Zhao et al.,2019)。最近，国内外多个实验室尝试通过全基因组关联分析(GWAS)来揭示玉米抗盐性变异的分子遗传基础，关注的表型包括存活率、株高、生长速率等(Luo et al.,2019；Xie et al.,2019；Sandhu et al.,2019)，并找到了一些候选基因，但这些基因抗盐功能和作用机制仍有待进一步确证和探究。因此，克隆抗盐QTL基因，研究其分子机制，开发抗性分子标记，开展基于分子辅助选择的多基因聚合育种已成为当前抗盐玉米培育的当务之急。
盐胁迫条件下，植物根系吸收过量的Na+，地上部Na+的大量积累对植物产生离子毒害，因此维持Na+稳态是提高植物抗盐应答的关键途径(Munns and Tester,2008；Yang andGuo,2018)。在玉米中的研究表明，当生长在盐胁迫条件下，不同玉米自交系叶片中积累的Na+浓度存在显著差异，同时叶片中的Na+含量与玉米抗盐能力具有一定相关性(Zhao etal.,2010；Zhang et al.,2018)，但到目前为止只有少数相关QTL基因被精细定位/克隆，这些基因对抗盐玉米培育是远远不够的，因此克隆调控玉米Na+稳态和抗盐的QTL基因仍是当前玉米抗盐机制研究的重要任务。
发明内容
本发明通过反向遗传学筛选发现ZmSnRK2.10的突变体对盐胁迫更为敏感，如图1所示。抗盐QTL基因ZmSnRK2.10正调控玉米的抗盐性，基因全长(从起始密码子到终止密码子)2114bp(SEQ ID No.1)，编码362个氨基酸(SEQ ID No.2)；设计引物，分别以抗盐自交系郑58和盐感自交系E588基因组总DNA为模板进行PCR扩增，对扩增产物进行测序和序列比对，不同抗感玉米植株中ZmSnRK2.10的启动子上存在一个20个核苷酸的插入或缺失，缺失这20个核苷酸的玉米中ZmSnRK2.10基因的转录水平降低，玉米抗盐性下降，可以根据此基因来判定玉米是否为抗盐型；将包含这20个核苷酸的一段序列作为分子标记，对于分子标记的检测，可以判定玉米是否为抗盐型。
一方面，本申请提供了一种玉米抗盐QTL基因ZmSnRK2.10，其核苷酸序列为SEQ IDNO.1。
另一方面，本申请提供了玉米抗盐QTL基因ZmSnRK2.10编码的蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2。
另一方面，本申请提供了上述玉米抗盐QTL基因ZmSnRK2.10或者玉米抗盐QTL基因ZmSnRK2.10编码的蛋白在调控禾本科植物抗盐胁迫中的应用。
进一步地，所述禾本科植物为玉米。
进一步地，所述调控为敲除玉米抗盐QTL基因ZmSnRK2.10以降低玉米对盐胁迫的耐受性；或者过表达玉米抗盐QTL基因ZmSnRK2.10以增加玉米对盐胁迫的耐受性。
另一方面，本申请提供了玉米对盐胁迫敏感性的分子标记ZmSALT4，其位于玉米B73参考基因组第二版5号染色体的chr5:18448191-18448313。
进一步地，所述分子标记ZmSALT4为SEQ ID No.7则为抗盐型；所述分子标记ZmSALT4为SEQ ID No.8，则为盐敏感型。
进一步地，所述分子标记的核苷酸序列为SEQ ID NO.9。
另一方面，本申请提供了使用分子标记鉴定玉米对盐胁迫敏感性的方法，所述方法包括使用序列为SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11的引物扩增待测玉米样本的基因组DNA；检测扩增条带；扩增出123bp条带的玉米样本为抗盐型，扩增出103bp条带的玉米样本为盐敏感型。
进一步地，所述检测扩增条带为电泳检测。
进一步地，所述扩增待测玉米样本的基因组DNA的PCR体系为20μl：2×SuperMultiplex PCR Mix 10μl,10μM的上游和下游引物各1μl,DNA 1μl,ddH2O 7μl；PCR程序为：预变性95℃2min,变性95℃30s,退火58℃30s,延伸72℃30s,由变性到延伸进行34个循环，最后延伸72℃5min。
另一方面，本申请提供了上述方法在抗盐玉米育种中的应用。
另一方面，本申请提供了检测玉米抗盐性能的试剂盒，其包含序列为SEQ IDNO.10和SEQ ID NO.11的引物。
附图说明
图1为野生型和ZmSnRK2.10敲除突变体在对照和盐胁迫条件下生长2周的对比结果；其中(A)为利用CRISPR-Cas9技术构建ZmSnRK2.10敲除突变体的示意图；(B)为野生型和ZmSnRK2.10敲除突变体中蛋白翻译示意图；(C)为野生型和ZmSnRK2.10敲除突变体在对照和盐胁迫条件下生长2周的植株生长状况；(D)A图中各植株的地上部Na+含量；(E)A图中各植株的根部Na+含量；(F)A图中各植株的木质部汁液Na+含量。
图2为ZmSnRK2.10基因的结构示意图。
图3为162份玉米关联群体的eGWAS分析结果；其中(A)为ZmSnRK2.10表达水平的GWAS分析结果及效应值最高点示意图；(B)为效应值最高点对应不同单倍型自交系中ZmSnRK2.10的转录水平比较；(C)为效应值最高点对应不同单倍型自交系中地上部的Na+含量比较。
图4为ZmSnRK2.10基因上的自然变异与转录水平关联分析的结果；其中(A)为ZmSnRK2.10表达水平的GWAS分析结果及效应值最高点示意图；(B)为ZmSnRK2.10基因的结构示意图；(C)为ZmSnRK2.10基因上的自然变异的连锁不平衡分析结果。
图5为ZmSnRK2.10的单倍型分析数据；其中(A)为不同ZmSnRK2.10单倍型材料中效应值最高点变异比较；(B)为不同ZmSnRK2.10单倍型材料中ZmSnRK2.10在对照和盐胁迫条件下的转录水平检测；(C)为不同ZmSnRK2.10单倍型材料地上部Na+含量比较。
图6为ZmSnRK2.10启动子区域不同突变形式载体构建示意图。
图7为不同自然变异位点SNP-467、SNP-357、Del-356对ZmSnRK2.10转录水平的影响检测。
图8为利用引物对在郑58和E588中进行PCR扩增的结果。
图9为ZmSnRK2.10Zheng58和ZmSnRK2.10E588基因型材料地上部Na+含量检测。以郑58和E588为亲本构建的F2分离群体,在对照和盐处理下萌发、生长10天后测定单株地上部Na+含量。
具体实施方式
实施例1玉米抗盐QTL基因的克隆及功能分析
ZmSnRK2.10的突变体对盐胁迫更为敏感，如图1所示。通过对近1000个玉米基因的突变体材料进行盐表型分析，本发明发现ZmSnRK2.10的多个敲除突变体株系具有盐敏感表型。重测序结果显示两个突变体株系ZmSnRK2.10crispr-1在靶点位置缺失1个碱基A，ZmSnRK2.10crispr-2在靶点位置插入1个碱基A，如图1的A部分所示。两个突变体中的突变都造成了ZmSnRK2.10蛋白翻译提前终止，如图1的B部分所示。将野生型与ZmSnRK2.10的两个突变体植株(ZmSnRK2.10crispr-1、ZmSnRK2.10crispr-2)分别在对照和盐处理条件下萌发，生长14天后观察盐表型,并对地上部，根中和木质部汁液中钠离子含量进行测定。结果显示,对照条件下,ZmSnRK2.10crispr突变体植株大小及各部分钠离子含量与野生型之间无明显差别，而在盐处理条件下，突变体较野生型植株对盐胁迫更敏感，地上部和木质部汁液中钠离子含量明显高于野生型。
基于MaizeGDB网站对ZmSnRK2.10基因结构的预测，基因全长(从起始密码子到终止密码子)2114bp，包含八个外显子，七个内含子，其中编码区序列全长1089bp，如图2所示。其核苷酸序列见SEQ ID No.1，对应的蛋白质的序列为SEQ ID No.2所示。
SEQ ID No.1(抗盐QTL基因ZmSnRK2.10基因序列)
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CGACATCGGCTCCGGCAACTTCGGCGTCGCGCGCCTCATGCGCAACCGCGCCGACGGCCAGCTCGTCGCCGTCAAGTACA
TCGAGCGAGGCGAGAAGGTTGGTTCTTTTTTGCTACTACTCCCTGCCTGCCTGTGCGTGTCCGGCTCTCCGATACCAACA
TCATCAACCAAACCAACCGCTGCAGATTGACGAGAACGTGCAGCGGGAGATCATCAACCACCGCTCCCTGCGCCACCCCA
ACATCATCCGCTTCAAGGAGGTCATCCTCACCCCGACGCACCTCGCCATCGTCATGGAGTACGCCTCCGGCGGGGAGCTC
TTCGAGCGCATCTGCAACGCTGGCAGGTTCAGCGAGGACGAGGTCCATTCCTTTTCTTTCGTCTTCTCTCGCTTTCATCA
ACGCTGCTTGCTCGTGCTGCCTTTCCTCTGTACTTGTGATGACACTCCTGCCCTGTACAACTACAAACATGGTACACTAA
TCAAACTGTCAAAGCTTCTTTCAGGCGCGTTTCTTTTTCCAGCAACTCATATCAGGGGTCAGCTACTGCCATTCCATGGT
ACTGCTCCTTATCTTCTTTCCTTCCAATAACATTTACTACCAAAATATAGCACGTGGATCCGCAATCTTTATACTGTACC
GGCCTCATCTGTTTAAAATTGCTCTGTTTTGTGCCTACATTTTTTGTCAAGCAAGTATGCCATCGCGACTTGAAGCTAGA
GAACACCCTGTTGGACGGGAGCACCGCGCCTCGCCTCAAGATATGTGATTTTGGCTACTCAAAGGTACTGCTAGATGCTT
ACAGCTTACACATTTTGGGGGGGAAAGAAACACAGTTTCAATTAACAATGCACACTTTACGCTGTTAGTATACCAAAACG
AGGAGTAAAATTATTCTAACTGTAATTAGCAGCCCATGATGTAGTCAAGGAAAAAAATTAACTGAACTCGTCTGCTTATA
ATTTTAACTCTATCAGTAGAGTAGATACTGTTATCAGGTGCCTTTAAAAAGATGTGGGACATTTGTCTTCAACTGTTGGT
CTACTTATACCTCTTTTTTGCATTGCAGTCATCAGTTCTACACTCGCAGCCGAAATCTACAGTGGGAACTCCTGCATACA
TTGCTCCTGAGGTTCTTCTGAAGAAGGAATACGATGGAAAGGTATCATGTGTATTGTCATTGATTATTCTACATACCGTT
TCTATTCATGCACACGTTATTGCTCTCCCCTTAAACAACATGTTTGTGTGGCAACTGGCAAAGCATTTTATACACGCACG
GTTTGTAGTCATGTATATGTATAGCAGGAAACTATGTTGGCAAGTTGGAACCCTATGTCAGTCACTAACTCTTCGTTACT
GAAAACAAGGTCGCTGATGTGTGGTCATGTGGAGTAACGCTGTACGTGATGCTGGTCGGTGCATATCCATTTGAGGACCC
AGATGAGCCTAAGAATTTCAGGAAGACAATTCAGGTTTCCTTTGCAGACTGGTTTACACCAGCGTCTCTCAATTGACTGC
TCATCCTGATCAAACGCTGACGAGATCTGCTTGGCAGAGAATATTGGGTGTGCAGTACTCAATTCCAGACTATGTCCACA
TATCTCCAGAGTGCCAAAATCTTGTCTCTAGGATTTTCGTCGCCGACCCAGCCACCGTGAGTACATGCAGCTTCATAATG
TTTCACTAGCTTCTGCACTGCACATGTTTGCTTTTGAACAAATTACTGACGTTACCTATACAGAGGATCACCATCCCTGA
GATAAGGAACCATCCATGGTTCTTGAAGAACCTGCCAGCTGACCTAATGGATGACAGCACGATGAGCAAGCAGTACGAGG
AGCCTGAGCAACCGATGCAGAGCATGGATGAGATCATGCAGATCCTGGCTGAGGCGACCATTCCAGCAGCTGGTCCCCAT
GGACTCAATCAGTTCCTGAACGACGGCCTTGACCTCGACGATGACATGGACGACCTGGACTCAGATACCGATCTTGACCTGGAAAGCAGTGGGGAAATCGTGTATGCTATTTGA；
SEQ ID No.2(抗盐QTL基因ZmSnRK2.10氨基酸序列)
MDRAALTVGPGMDMPIMHDGDRYELVRDIGSGNFGVARLMRNRADGQLVAVKYIERGEKIDENVQREIINHRSLRHPNII
RFKEVILTPTHLAIVMEYASGGELFERICNAGRFSEDEARFFFQQLISGVSYCHSMQVCHRDLKLENTLLDGSTAPRLKI
CDFGYSKSSVLHSQPKSTVGTPAYIAPEVLLKKEYDGKVADVWSCGVTLYVMLVGAYPFEDPDEPKNFRKTIQRILGVQY
SIPDYVHISPECQNLVSRIFVADPATRITIPEIRNHPWFLKNLPADLMDDSTMSKQYEEPEQPMQSMDEIMQILAEATIPAAGPHGLNQFLNDGLDLDDDMDDLDSDTDLDLESSGEIVYAI。
实施例2玉米抗盐QTL基因ZmSnRK2.10启动子中20个核苷酸的缺失导致ZmSnRK2.10的转录水平下降
前期研究结果显示，ZmSnRK2.10的转录水平在不同自交系之间存在显著差异,且对应材料的地上部钠离子含量也存在较大差异。本发明基于162份玉米自交系中ZmSnRK2.10的表达水平进行了全基因组关联分析(eGWAS)。分析结果显示,在5号染色体上定位了1个与玉米地上部ZmSnRK2.10的表达水平显著相关的位点。其中，效应值最大的位点位于ZmSnRK2.10上游约8kb基因间区域，如图3的A部分所示。效应值最高点对应的单核苷酸位点分别为胸腺嘧啶T(单倍型1)和胞嘧啶C(单倍型2)，根据该位点将162份玉米自交系分成两种单倍型。统计结果显示，两种单倍型中ZmSnRK2.10的转录水平存在显著差异，单倍型1中ZmSnRK2.10的转录水平显著高于单倍型2，如图3的B部分所示。同时，两种单倍型的地上部钠离子含量同样存在显著差异，单倍型1材料的地上部钠离子含量显著低于单倍型2材料，如图3的C部分所示。
为检测导致ZmSnRK2.10的转录水平存在差异的原因，对105份玉米自交系中ZmSnRK2.10的基因组信息进行PCR扩增和重测序，重测序区域包括ZmSnRK2.10的启动子区、CDS区和3′UTR区(测序在北京擎科生物技术有限责任公司完成)。分别取自交系幼苗的叶片材料，使用天根生化科技(北京)有限公司的植物基因组DNA提取试剂盒提取总DNA，用ZmSnRK2.10特异的引物(正向引物ZmSnRK2.10-F：ATGGACCGGGCGG(SEQ ID NO.3)；反向引物ZmSnRK2.10-R：TCAAATAGCATACACGATTT(SEQ ID NO.4)进行PCR扩增，获得了与预期大小(2114bp)相符的产物。
其中，PCR扩增体系为50μl，包括：2×Super Multiplex PCR Mix 25μl；10μMPrimer ZmSnRK2.10-F 2μl；10μM Primer ZmSnRK2.10-R 2μl；DNA 1μl；ddH2O 20μl)。
PCR扩增条件为：预变性95℃2min,变性95℃30s,退火58℃30s,延伸72℃1min,由变性到延伸进行34个循环，最后延伸72℃5min。
将PCR产物送至北京擎科生物技术有限责任公司测序，测序结果通过CodoncodeAligner软件进行比对和差异位点获取，所有基因型数据通过Tassle5软件进行候选基因关联分析。同时，通过hapview软件对自然变异位点进行连锁不平衡分析。结果显示，共获得42个与ZmSnRK2.10的转录水平显著相关的自然变异位点，其中核苷酸变异有37处，插入缺失变异有5处。位于启动子上的两个核苷酸变异(第-467和-357位)和一个20核苷酸的片段的插入/缺失(-356)变异与ZmSnRK2.10的转录水平显著相关并且完全连锁，如图4所示。
将105份自交系根据三个完全连锁的效应值最高点(SNP-467、SNP-357、Del-356)可分成两种单倍型，其中单倍型1和单倍型2分别由31个和74个自交系组成，如图5的A部分所示。对不同单倍型材料中ZmSnRK2.10转录水平进行统计分析，结果表明，无论在对照还是盐处理条件下，单倍型1材料中ZmSnRK2.10的转录水平均显著高于单倍型2材料，如图5的B部分所示。而单倍型1材料中钠离子含量则显著低于单倍型2材料，如图5的C部分所示。本发明发现,不同玉米自交系中ZmSnRK2.10启动子区域的自然变异是导致其转录水平差异的原因，进而影响玉米地上部钠离子含量和耐盐性。
ZmSnRK2.10基因在单倍型1材料中表现为：其启动子核苷酸序列如SEQ ID No.5(TGTTACCTCGGCACCACAGCTTATGGCGCCGAGCTTCGGGTCCAAACGTGCAAATAAA ATTTCTGAGGGTCCAAACGTAAATTTTTGTCTCGAAAGGGGCTAAAAAACAAAAAATTCGGGTTACTGGTCACCGGTGTCCTCGGTCGACACGGAATGACATCTGGGACCACCTGGGCCCACGTGGCGGTGTGATATACTGTATTAGGTAAGACGAGCAGGGTCACAGGCCGTCGCAGCCCACATCGTCGTCTTCGGTTCGTCTCTTCTGTTGCTGGGCTCGTCGCGAGGGTAGCAGAGGCCAGATGAGGGACAGAGCAAGCGAGAGAAGCTGAAGAAACAATTTGTTTTTTTTCTTTCTTATCGAAACAGCACAGACCAGTGAAAGAGGGAGCGAATTAGCGAAAAGAAGAAGACAATATAAAAAATAAATAAATAAATAACTACACCGAATGCAGCGAGCGAGGTGGAGGTGGGGGAAAAAGGGCGAGGTGACACCGTGACAGAGAGAAGGCGAGGGAGGGATCACGAGGTGTGCTTCCTCCTCCGCCCAATCCTGCCCAACCAAATCCGCCAGCGCCGCCTCCTTTACACTCCCACCTCTGTCCCGGAGCAAAAAAAGGAGGGAGAGGCTCGCTTCTTGGATCGCGGGGTCACGGGACGCGCGCCGCGGGCCGGTACGCTGCTGCTGGCGGACTGCTCGACCCTTGCCTACCAGCTGCTGCCTGCTGCTGCTTCCTTGGCTGGCGCCGGCGAGAGACGGAGGCGAGGCGAGGCGAGGCGACGACG)所示。
ZmSnRK2.10基因在单倍型2材料中表现为：其启动子核苷酸序列如SEQ ID No.6(TGTTACCTCGGCACCACAGCTTATGGCGCCGAGCTTCGGGTCCAAACGTGCAAATAAA ATTTCTGAGGGTCCAAACGTAAATTTTTGTCTCGAAAGGGGCTAAAAAACAAAAAATTCGGGTTACTGGTCACCGGTGTCCTCGGTCGACACGGAATGACATCTGGGACCACCTGGGCCCACGTGGCGGTGTGATATACTACTGTATTAGGTAAGACGAGCAGGGTCACAGGCCGTCGCAGCCCACATCGTCGTCTTCGGTTCGTCTCTTCTGTTGCTGGGCTCGTCGCGAGGGTAGCAGAGGCCAGATGAGGGACAGAGCAAGTGAGAGAAGCTGAAGAAACAATTTGTTTTTTTCTTTCTTATCGAAACAGCACAGACCAGTGAAAGAGGGAGCGAATTAGTGAAAAGAAGACAATAAATAAATACAACGAATGCAGCGAGCGAGGTGGAGGTGGGGGGAAAAGGGCGAGGTGACACCGTGACAGAGAGAAGGCGAGGGAGGGATCACGAGGTGTGCTTCCTCCTCCGCCCAATCCTGCCCAACCAAATCCGCCAGCGCCGCCTCCTTTACACTCCCACCTCTGTCCCGGAGCAAAAAAGGGAGGGAGAGGCTCGCTTCTTGGATCGCGGGGTCACGGGACGCGCGCCGCGGGCCGGTACGCTGCTGCTGGCGGACTGCTCGACCCTTGCCTACCAGCTGCTGCCTGCTGCTGCTTCCTTGGCTGGCGCCGGCGAGAGACGGAGGCGAGGCGACGACGATGGACCGGGCGGCGCTCACCGTGGGCCCGGGGATGG)所示。
为了进一步确定ZmSnRK2.10启动子中三个效应值最高的位点对ZmSnRK2.10转录水平的影响,首先构建不同类型启动子启动GFP蛋白表达的载体，如图6所示。
具体实验流程为：
(1)分别以郑58(单倍型1)和E588(单倍型2)的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，获得郑58和E588中ZmSnRK2.10的启动子序列，将其构建到pCAMBIA3300-GFP载体上，最终获得正确的pZmSnRK2.10zheng58-GFP和pZmSnRK2.10E588-GFP载体；
(2)将E588中ZmSnRK2.10的启动子序列在两个差异核苷酸(第-467和-357位)和缺失20个核苷酸处进行单个核苷酸的突变和20个核苷酸的引入，构建pZmSnRK2.10E588(+20bp)-GFP、pZmSnRK2.10E588(C/A)-GFP和pZmSnRK2.10E588(T/C)-GFP载体。
将这些载体利用农杆菌侵染注射到烟草叶肉细胞，48h后取烟草叶片液氮速冻,通过检测GFP转录水平比较不同启动子的转录活性。结果显示,pZmSnRK2.10zheng58-GFP烟草叶片中GFP表达水平显著高于pZmSnRK2.10E588-GFP。pZmSnRK2.10E588(C/A)-GFP和pZmSnRK2.10E588(T/C)-GFP烟草叶片中GFP表达水平与pZmSnRK2.10E588-GFP无明显差异。而pZmSnRK2.10E588(+20bp)-GFP烟草叶片中GFP转录水平较pZmSnRK2.10E588-GFP明显增加，而与pZmSnRK2.10zheng58-GFP烟草叶片中的GFP无明显差异。以上结果表明,ZmSnRK2.10启动子中20个核苷酸序列的缺失导致ZmSnRK2.10转录水平降低,从而导致地上部钠离子含量的增加。
实施例3郑58和E588中玉米抗盐基因ZmSnRK2.10的连锁序列作为分子标记
因为郑58(单倍型1)和E588(单倍型2)中ZmSnRK2.10的启动子中20个核苷酸序列的插入/缺失导致ZmSnRK2.10转录水平发生变化，进一步导致玉米的抗盐能力发生变化，因此根据郑58(单倍型1)和E588(单倍型2)中ZmSnRK2.10的启动子核苷酸序列，发明人设计可以用于判断个体是否抗盐的连锁分子标记。
这段序列在5号染色体的具体位置为(玉米B73参考基因组第二版)：
Chr5:18448191-18448313
这段序列信息在郑58(单倍型1)中为(123bp)：
AGACCAGTGAAAGAGGGAGCGAATTAGCGAAAAGAAGAAGACAATATAAAAAATAAATAAATAAATAACTACACCGAATG CAGCGAGCGAGGTGGAGGTGGGGGAAAAAGGGCGAGGTGACAC(SEQ ID NO.7)；
这段序列信息在E588(单倍型2)中为(103bp)：
AGACCAGTGAAAGAGGGAGCGAATTAGCGAAAAGAAGAAAATAAATAACTACACCGAATGCAGCGAGCGAGGTGGAGGTG GGGGAAAAAGGGCGAGGTGACAC(SEQ ID NO.8)。
20个核苷酸序列的插入/缺失为GACAATATAAAAAATAAATA(SEQ ID NO.9)。
以这段序列作为分子标记，发明人设计了一对引物ZmSnRK2.10-Marker-F1/ZmSnRK2.10-Marker-R1，该对引物位于ZmSnRK2.10的启动子区域，利用该对引物，可以筛选ZmSnRK2.10启动子序列来自郑58(抗盐型)或E588(盐敏感型)，分别以抗盐玉米自交系郑58(单倍型1)和盐敏感玉米自交系E588(单倍型2)的基因组DNA为模板，进行PCR扩增。
PCR体系20μl：2×Super Multiplex PCR Mix 10μl,10μM Primer ZmSnRK2.10-Marker-F1 1μl,10μM Primer ZmSnRK2.10-Marker-R1 1μl,DNA 1μl,ddH2O 7μl。
PCR程序：预变性95℃2min,变性95℃30s,退火58℃30s,延伸72℃30s,由变性到延伸进行34个循环，最后延伸72℃5min。
结果发现以玉米抗盐自交系郑58(单倍型1)总DNA为模板进行PCR扩增，该引物对可获得123bp的条带；以玉米盐敏感自交系E588(单倍型2)总DNA为模板进行PCR扩增，该引物对可获得103bp的条带，如图8所示。
因此，以该引物对可以用于玉米抗盐分子辅助育种，把基于该引物对的抗盐分子标记命名为ZmSALT4。其中各引物的序列为：
引物ZmSnRK2.10-Marker-F1：AGACCAGTGAAAGAGGGAGC(SEQ ID NO.10)；
引物ZmSnRK2.10-Marker-R1：GTGTCACCTCGCCCTTTT(SEQ ID NO.11)。
实施例4利用抗盐分子标记检测玉米是否抗盐
以Zheng58和E588为亲本,杂交产生F1代种子,再自交得到F2分离群体。随机选择F2代种子,分别在对照和100mM NaCl处理下生长10d后，收集单株地上部组织进行基因型鉴定和钠离子含量测定。结果显示在盐胁迫条件下,携带抗盐等位基因ZmSnRK2.10Zheng58的F2植株地上部钠离子含量显著低于ZmSnRK2.10E588,如图9所示。本发明发现,ZmSnRK2.10的优异等位基因可促进盐胁迫下玉米地上部钠离子的排斥和耐盐。
Claims (10)
1.一种玉米抗盐QTL基因ZmSnRK2.10，其特征在于，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1。
2.玉米抗盐QTL基因ZmSnRK2.10编码的蛋白，其特征在于，其氨基酸序列为SEQ IDNO.2。
3.根据权利要求1所述的玉米抗盐QTL基因ZmSnRK2.10或者根据权利要求2所述的玉米抗盐QTL基因ZmSnRK2.10编码的蛋白在调控禾本科植物抗盐胁迫中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其中所述禾本科植物为玉米。
5.一种玉米抗盐相关的分子标记ZmSALT4，其特征在于，其位于玉米B73参考基因组第二版5号染色体的chr5:18448191-18448313。
6.根据权利要求5所述的分子标记，其特征在于，所述分子标记ZmSALT4为SEQ ID No.7则为抗盐型；所述分子标记ZmSALT4为SEQ ID No.8，则为盐敏感型。
7.使用分子标记鉴定玉米对盐胁迫抗感性的方法，其特征在于，所述方法包括使用序列为SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11的引物扩增待测玉米样本的基因组DNA；检测扩增条带；扩增出123bp条带的玉米样本为抗盐型，扩增出103bp条带的玉米样本为盐敏感型。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述检测扩增条带为电泳检测；其中所述扩增待测玉米样本的基因组DNA的PCR体系为20μl：2×Super Multiplex PCR Mix 10μl,10μM的上游和下游引物各1μl,DNA 1μl,ddH2O 7μl；PCR程序为：预变性95℃2min,变性95℃30s,退火58℃30s,延伸72℃30s,由变性到延伸进行34个循环，最后延伸72℃5min。
9.根据权利要求7或8所述的方法在抗盐玉米育种中的应用。
10.检测玉米抗盐性能的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含序列为SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11的引物。
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