CN117551670A - 牛结核分枝杆菌与表位基因重组减毒沙门菌的构建及应用 - Google Patents
牛结核分枝杆菌与表位基因重组减毒沙门菌的构建及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种牛结核分枝杆菌重组减毒沙门菌疫苗的方法。通过选择牛结核病特异性抗原基因Ag85B、MPT63和HSP65，并利用生物在线软件分析其B细胞和T细胞表位，将筛选出的表位肽段连接成新的表位基因AMH。对AMH进行免疫原性、理化性质和结构分析后，将其与特异性抗原基因连接至真核表达载体pEGFP。经过转染和表达验证后，将重组质粒转入减毒沙门菌中，并进行体外和体内试验。结果显示，该重组减毒沙门菌具有较高的安全性和免疫效果，为牛结核病基因疫苗研究提供了基础和理论支持。
Description
技术领域
本发明属于基因生物工程领域，涉及牛结核分枝杆菌三种特异性抗原基因Ag85B、MPT63和HSP65及其表位基因AMH构建重组减毒沙门菌的方法，具体说，是将携有牛结合分枝杆菌特异抗原的重组质粒融合导入减毒沙门菌LH430获得的重组减毒沙门菌LH430制备方法及其应用。
背景技术
牛结核病（Bovine tuberculosis）主要是由牛结核分枝杆菌（Mycobacteriumbovis, M. bovis）引起的一种慢性传染病，每年全球约有5 000万头牛患病，给畜牧业造成了严重的经济损失。卡介苗（BCG）是利用牛结核杆菌所制的一种减毒活疫苗，主要用于人类预防结核病。因动物接种BCG后在后续PPD检测中呈阳性的几率极高，为区分疫苗接种和自然感染带来难度，且自然环境中BCG在动物体内提供的保护作用不稳定，故目前尚未有国家在牛体内接种BCG预防结核病。因此，亟需研发一种安全、有效防控牛结核病的新型疫苗。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，选取牛结核分枝杆菌的三种特异性抗原基因Ag85b、MPT63和HSP65，利用生物信息学技术设计表位蛋白AMH，并对其理化性质、蛋白特性、免疫模拟进行分析，将4个蛋白借助柔性肽连接构建至真核表达载体pEGFP-N1，再借助减毒沙门菌为中间体递送至动物体。重组减毒沙门菌免疫动物后先激活机体免疫系统，将外源质粒递送至机体，使表位蛋白AMH诱导机体的细胞和体液免疫，同时三种特异性抗原基因发挥特异性免疫作用，实现多基因的联合免疫效应，籍此实现对牛结核病的协同免疫效果。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：
一种重组质粒,命名为：pEGFP-AMH-Ag85B-MPT63-HSP65。
本发明进一步公开了重组质粒的构建的方法，其特征在于包括以下步骤：
1）从NCBI网站上的GenBank中分别检索Ag85B、MPT63和HSP65的基因序列，利用生物在线软件分析其各种表位，然后将筛选出的表位连接构建出新的表位序列AMH；
2）表位基因AMH和牛结核病的三种特异性抗原基因利用T2A或者P2A连接并构建至真核表达载体pEGFP，将构建的重组真核表达质粒pEGFP-AMH-Ag85B-MPT63-HSP65转染至HEK293细胞观察绿色荧光的表达，经RT-PCR及Western Blotting试验和间接免疫荧光检测目的蛋白的表达；
3）重组质粒pEGFP-AMH-Ag85B-MPT63-HSP65运用热激方法转入减毒沙门菌LH430中，对所构建的菌株进行PCR及测序验证，对构建成功的重组减毒沙门菌进行生长曲线、体外稳定性、侵染效果验证，验证重组减毒沙门菌LH430是否可用于动物免疫试验；以此来评价疫苗免疫效果；
4）重组减毒沙门菌LH430口服免疫小鼠后，采集不同时间段的小鼠血清，检测血清中相关抗体及细胞因子水平的变化。
本发明同时也公开了采用所述方法构建的重组减毒沙门菌LH430在用于提高牛免疫力方面的应用。实验结果显示利用表位蛋白所构建的重组减毒沙门菌安全性较高且具有良好的免疫效果，为牛结核病的基因疫苗研究提供试验基础和理论支持。
本发明更加详细的描述如下:
一种重组减毒沙门菌LH430的制备方法，包括以下步骤：
1) 选取牛结核病的三种特异性抗原Ag85b、MPT63和HSP65，首先利用生物在线软件IEBD和BepiPred分析其各种表位，然后将筛选出的表位连接构建出新的表位AMH。接下来利用VaxiJen、Expay、TMHMM、Sopma和MODEL软件对表位序列AMH进行免疫源性、理化性质、亲水性、跨膜区、二级结构和三级结构的分析。之后利用C-IMMSIM对AMH进行免疫模拟，最终获得一条结构稳定、无细胞毒性且免疫源性较高的表位蛋白；
2) 构建的表位基因AMH和牛结核病的三种特异性抗原基因利用T2A或者P2A连接并构建至真核表达载体pEGFP，然后对重组质粒进行双酶切和PCR鉴定。将成功构建的重组质粒pEGFP-AMH-Ag85B-MPT63-HSP65转染至HEK293细胞，检测重组质粒在细胞内的转染情况，并进行反转录、Western Blot试验和间接免疫荧光试验来验证重组质粒在细胞水平上的表达情况。
3)重组表达载体pEGFP-AMH-Ag85B-MPT63-HSP65通过热激的方式转入减毒沙门菌中，经过PCR和测序验证构建成功后，对重组减毒沙门菌进行生长曲线、体外稳定性和侵染细胞试验，分别验证外源基因是否影响减毒沙门菌的生长、减毒沙门菌是否可以稳定的携带外源基因以及减毒沙门菌是否可以有效地传递外源基因；
4) 将前期构建并验证完成的重组减毒沙门菌通过口服方式免疫小鼠，采集不同时间段的小鼠血清，检测血清中相关抗体及细胞因子水平的变化。二免14天后处死小鼠，解剖并摘取相关脏器称重计算脏体比，提取脾淋巴细胞进行分型实验，取相关脏器做病理切片HE染色，通过对以上实验结果分析比对，验证本研究所制的重组减毒沙门菌是否对小鼠具有免疫作用，以及是否影响小鼠正常生长。
上述重组质粒pEGFP-AMH-Ag85B-MPT63-HSP65的制备方法获得重组质粒。
上述重组减毒沙门菌LH430的制备方法获得的重组减毒沙门菌LH430。
上述重组减毒沙门菌口服免疫小鼠后评价疫苗的免疫效果。
本发明公开的具有免疫原性的表位肽段AMH，所述该肽段的蛋白氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示；
本发明的有益效果是：所构建的表位基因AMH利用各种在线生物软件进行免疫原性、理化性质、二级结构、三级结构和免疫模拟的分析，经过分析后确认所构建的表位基因AMH稳定性、亲水性、细胞毒性以及免疫原性均良好。构建成功的重组减毒沙门菌进行生长曲线、体外稳定性、侵染效果验证，结果表明外源基因对减毒沙门菌的生长无明显影响，且重组减毒沙门菌在含Kan的环境中可稳定携带外源基因，在细胞水平上也可顺利将外源基因传递出来。重组减毒沙门菌免疫小鼠后可刺激小鼠体内抗体IgG和sIgG的生成，刺激细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-10的生成，并提高CD3+、CD4+、CD8+的占比，以上结果证明重组减毒沙门菌可有效激发小鼠体内的细胞免疫和体液免疫，具有良好的免疫效果。对免疫后小鼠相关脏器的脏体比和病理切片进行比对，结果发现结果均正常且不存在显著差异，说明重组减毒沙门菌对小鼠不具有损害性，是一种安全性较高的疫苗。
附图说明
图1 AMH蛋白特性分析（A.亲水性分析；B.跨膜结构分析）；
图2 AMH的空间结构预测（A.二维结构预测；B.三维结构预测）；
图3 AMH的免疫模拟结果（A.抗原暴露后不同状态下的B细胞数量；B.抗原暴露后不同状态下的TH细胞数量；C.抗原暴露后不同状态下的TC细胞数量；D.抗原暴露后产生的抗体；E.抗原暴露后产生的细胞因子）；
图4 重组质粒和重组减毒沙门菌验证结果（A.重组质粒双酶切结果；B.重组质粒PCR结果；C.重组减毒沙门菌菌液PCR结果）；
图5 重组质粒转染结果（A~D：重组质粒转染细胞；E~H：空载质粒转染细胞；I~L：空细胞）；
图6 重组质粒蛋白表达结果；
图7 重组质粒间接免疫荧光结果；
图8 重组减毒沙门菌生长曲线；
图9 重组减毒沙门菌体外稳定性结果；
图10 重组减毒沙门菌侵染细胞结果（A~D：重组减毒沙门菌侵染细胞；E~H：减毒沙门菌侵染细胞）；
图11 小鼠血清中牛结核杆菌特异性IgG浓度；
图12 小鼠血清细胞因子浓度（A.小鼠血清IFN-γ浓度；B.小鼠血清IL-4浓度；C.小鼠血清IL-10浓度）；
图13 小鼠脾淋巴细胞流式结果(A.CD8流式结果；B.CD4流式结果；C.CD3流式结果)；
图14 小鼠脾T淋巴细胞中相关亚群占比（A.CD4+和CD8+T淋巴细胞在CD3+T淋巴细胞中的占比；B.CD4+/CD8+比值）；
图15 小鼠各器官脏体比；
图16 小鼠各器官组织切片（A.心脏组织切片；B.肝脏组织切片；C.脾脏组织切片；D.肺脏组织切片；E.肾脏组织切片；F.小肠组织切片）。
实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。本发明所用原料及试剂均有市售。
牛结核分枝杆菌具有多种特异性抗原，其中，Ag85复合物可诱导Th1型免疫应答，在调控牛结核分枝杆菌胞内感染过程中具有重要作用；MPT63是牛结核分枝杆菌分泌的与毒力相关的小分子质量蛋白；HSP65是牛分枝杆菌中免疫应答的主要靶点，也是结核分枝杆菌黏附巨噬细胞的关键成分。多表位疫苗又称为鸡尾酒式疫苗，可同时携带多个目标抗原的辅助性表位。与传统疫苗相比，多表位疫苗可被多种MHC分子识别，抗原呈递更加高效，同时还具有独特的细胞免疫优势，其免疫作用不受病原微生物变异的影响。进一步研究发现，将沙门菌在基因水平上进行基因缺失减毒处理后，减毒的沙门菌虽毒力减弱但其对细胞的侵袭力依旧完整，因此，非常适宜作为疫苗载体。本研究选取牛结核分枝杆菌的三种特异性抗原基因Ag85b、MPT63和HSP65，利用生物信息学技术设计表位蛋白AMH，并对其理化性质、蛋白特性、免疫模拟进行分析，将4个蛋白借助柔性肽连接构建至真核表达载体pEGFP-N1，再借助减毒沙门菌为中间体递送至动物体。
实施例1
本发明利用牛结核病的三种特异性抗原Ag85b、MPT63和HSP65基因机器表位基因AMH构建重组质粒pEGFP-AMH-Ag85B-MPT63-HSP65，以减毒沙门菌为载体递送至动物体内，包括以下步骤：
1) 多表位基因AMH的筛选及构建；
2)共表达AMH、Ag85B、MPT63和HSP65基因重组质粒的构建及验证；
3) 重组减毒沙门氏菌的构建及验证；
4)重组减毒沙门氏菌的免疫效果评价。
具体包括步骤如下：
1)从NCBI中获得牛结核杆菌Ag85b（GenBank：ADD50055.1）、MPT63（GenBank：ACD61708.1）和HSP65（GenBank：AHH32489.1）的蛋白序列，用生物信息学软件BepiPred、IEBD筛选抗原的B细胞表位，用IEBD筛选抗原的CTL表位和THL表位，将筛选出的肽段按照其在原有蛋白中的先后顺序连接，相同类型肽段用GPGPG连接，不同类型肽段用GPLS连接，构建的表位蛋白序列命名为AMH。用Expasy中的ProtParam工具分析表位蛋白AMH的理化性质；用VaxiJen分析表位蛋白AMH的免疫原性；用Expasy中的ProtScale工具分析表位蛋白AMH的亲水性；用TMHMM分析表位蛋白AMH的跨膜区；用Sopma分析表位蛋白AMH的α螺旋、β折叠、β转角和无规则卷曲等二级结构；用SWISS-MODEL分析表位蛋白的三级结构；用C-IMMSIM模拟表位蛋白AMH的动态免疫反应，预测AMH诱导免疫细胞产生特异性抗体和细胞因子的能力；
2) 由生工生物工程（上海）股份有限公司合成AMH、Ag85b、MPT63和HSP65的基因序列，利用T2A和P2A将上述基因串联，并使用限制性内切酶EcoR I和Hand III连接至真核表达载体pEGFP-N1。将成功构建的重组质粒pEGFP-AMH-Ag85B-MPT63-HSP65转染至HEK293细胞，检测重组质粒在细胞内的转染情况，并进行反转录、Western Blot试验和间接免疫荧光试验来验证重组质粒在细胞水平上的表达情况；
3) 将重组质粒pEGFP-AMH-Ag85B-MPT63-HSP65运用热激方法转入减毒沙门菌中，对所构建的菌株进行PCR验证，之后培养重组减毒沙门菌提取质粒送去公司测序。对构建成功的重组减毒沙门菌进行生长曲线、体外稳定性、侵染效果验证。验证外源基因是否影响减毒沙门菌的生长、减毒沙门菌是否可以稳定的携带外源基因以及减毒沙门菌是否可以有效地传递外源基因；
4)选择6~8周龄的昆明雄鼠共15只，随机分为3组，每组5只，分别为重组减毒沙门菌组（CZ组）、空载减毒沙门菌组（KZ组）和PBS组。采集不同时间段的小鼠血清，检测血清中相关抗体及细胞因子水平的变化。二免14天后处死小鼠，解剖并摘取相关脏器称重计算脏体比，提取脾淋巴细胞进行分型实验，取相关脏器做病理切片HE染色，通过对以上实验结果分析比对，验证本研究所制的重组减毒沙门菌是否对小鼠具有免疫作用，以及是否影响小鼠正常生长。
上述重组质粒pEGFP-AMH-Ag85B-MPT63-HSP65的制备方法获得重组质粒。
上述重组减毒沙门菌LH430的制备方法获得的重组减毒沙门菌LH430。
上述重组减毒沙门菌口服免疫小鼠后评价疫苗的免疫效果。
也就是说，利用在线生物软件对牛结核病的三种特异性蛋白Ag85B、MPT63和HSP65进行B细胞表位和T细胞表位筛选，将获得的优势表位设计串联，构建出一条新的表位基因AMH。对所构建的表位基因AMH利用各种在线生物软件进行免疫原性、理化性质、二级结构、三级结构和免疫模拟的分析。利用连接肽将表位基因AMH、Ag85B、MPT63和HPS65连接并构建至真核表达载体pEGFP，并对其进行双酶切和PCR验证。将重组质粒pEGFP-AMH-Ag85B-MPT63-HSP65转染细胞后对重组质粒在细胞水平上的转染效率、反转录情况和目的蛋白表达效果进行验证。将重组质粒pEGFP-AMH-Ag85B-MPT63-HSP65运用热激方法转入减毒沙门菌中，对所构建的菌株进行PCR验证，之后培养重组减毒沙门菌提取质粒送去公司测序。对构建成功的重组减毒沙门菌进行生长曲线、体外稳定性、侵染效果验证。重组减毒沙门菌免疫小鼠，采集不同时间段的小鼠血清，检测血清中相关抗体及细胞因子水平的变化。二免14天后处死小鼠，解剖并摘取相关脏器称重计算脏体比，提取脾淋巴细胞进行分型实验，取相关脏器做病理切片HE染色，通过对以上实验结果分析比对，验证本研究所制的重组减毒沙门菌是否对小鼠具有免疫作用。
下面结合具体实例对本发明作进一步详细说明：
1 材料与方法
1.1 抗原表位的筛选
从NCBI中获得牛结核杆菌Ag85b（GenBank：ADD50055.1）、MPT63（GenBank：ACD61708.1）和HSP65（GenBank：AHH32489.1）的蛋白序列，用生物信息学软件BepiPred、IEBD筛选抗原的B细胞表位，用IEBD筛选抗原的CTL表位和THL表位，将筛选出的肽段按照其在原有蛋白中的先后顺序连接，相同类型肽段用GPGPG连接，不同类型肽段用GPLS连接，构建的表位蛋白序列命名为AMH。
1.2 理化性质、免疫原性、亲水性和跨膜区预测
用Expasy中的ProtParam工具分析表位蛋白AMH的理化性质；用VaxiJen分析表位蛋白AMH的免疫原性；用Expasy中的ProtScale工具分析表位蛋白AMH的亲水性；用TMHMM分析表位蛋白AMH的跨膜区。
1.3 空间结构分析及免疫模拟
用Sopma分析表位蛋白AMH的α螺旋、β折叠、β转角和无规则卷曲等二级结构；用SWISS-MODEL分析表位蛋白的三级结构；用C-IMMSIM模拟表位蛋白AMH的动态免疫反应，预测AMH诱导免疫细胞产生特异性抗体和细胞因子的能力。
1.4 重组质粒及重组减毒沙门菌的构建
由生工生物工程（上海）股份有限公司合成AMH、Ag85b、MPT63和H
SP65的基因序列，利用T2A和P2A将上述基因串联，并使用限制性内切酶EcoR I和Hand III连接至真核表达载体pEGFP-N1；通过PCR和双酶切鉴定阳性重组菌。根据构建的目的基因序列设计特异性引物，F（SEQ ID NO.2）：5'-GAATTCATGGGCTATTTTGTTACCGATGCG-3'；R（SEQ ID NO.3）：5'-ATAAGCTTGGTGATGGTGATGATGGACGAC-3'，加粗碱基为酶切位点。PCR反应程序为：95℃，预变性5 min；{95℃，30 s；58℃，30 s；72℃，2 min}35个循环；72℃，延伸10 min。PCR产物利用琼脂凝胶电泳检测，并进行测序。
扩大培养阳性菌并提取质粒，将质粒通过热激方法转化至减毒沙门菌感受态中，随后涂布于含5%卡那霉素抗性的固体培养基上培养24 h，挑取单个菌落进行PCR验证。阳性菌即为阳性重组减毒沙门菌。
1.5 重组减毒沙门菌免疫小鼠
将30只雄性昆明小鼠随机分为重组减毒沙门菌组（CZ组）、空载减毒沙门菌组（KZ组）和PBS组，每组10只。免疫前30 min需先用7.5 %的NaHCO3给小鼠灌胃中和胃酸，100 μL/只。小鼠灌胃免疫沙门氏菌剂量为2×107 cfu/200 μL/只，PBS组灌服等体积PBS28 d加强免疫一次。
1.6 血清抗体和细胞因子测定
加强免疫后14 d，采集小鼠血液，室温静置2 h，2 500 rpm离心20 min，取上清样品进行血清抗体水平和细胞因子水平。参照ELISA试剂盒说明书，分别取100 μL小鼠血清作为待检血清样品，根据操作步骤分别检测血清中牛结核杆菌特异性IgG和细胞因子IFN-γ、IL-4和IL-10水平，使用分光光度计检测各样品在450 nm波长处的吸光度值。
1.7 T淋巴细胞的分析检测
加强免疫后14 d，待处死小鼠后，在无菌环境中取脾脏，并制备单个脾淋巴细胞。分别取制备好的1×106个淋巴细胞于离心管中，按照试剂说明书分别加入FITC anti-mouse CD3、APC anti-mouse CD4和PE anti-mouse CD8特异性抗体，避光4℃孵育30 min。染色后，离心弃上清，用1 mL PBS重悬过200目筛网，将细胞悬液移入5 mL流式管，上机分析收集数据。
1.8 脏体系数检测及病理切片观察
二免后14 d每组随机取3只小鼠，称量体重后处死摘取心脏、肝脏、脾脏、肾脏分别称重并记录，计算各脏器的脏体比（脏体比=脏器的重量/体重×100），观察并分析疫苗免疫对小鼠脏器是否存在影响。每组取3只小鼠的新鲜脏器切片进行HE染色，用光学显微镜拍照并记录。
2 结果与分析
2.1 抗原表位的筛选与连接
利用表位筛选工具对Ag85b、MPT63和HSP65的B细胞、CTL和THL表位进行分析，将筛选的优势肽段（表1）用短肽GPGPG和GPLS连接构成新的表位蛋白AMH，其蛋白氨基酸序列SEQID NO.1为：GYFVTDAERQEAVLGPGPGGISAGDASIGPLSEGLRNVAAGANPLGLGPGPGIDTKEQIAATAGISAGPLSESNTFGLQLGPLSLKSSTAVIPGYPVAGQVWEAGPGPGPDTISGATIPQGEQSTGKGPLSKIYFDVTGPSPTIVAGPLSSSTAVIPGYGPGPGSQFNARTADGINYGPLSAGGYKAADMWGPSSDPAWERNDGPGPGFYSDWYSPACGKAGCGPLSKFQDAYNAAGGHNAVGPGPGPQQFIYAGSLSALLDGPLSAVFNFPPNGTHGPGPGNTPAFEWYYGPGPGSAMILAAYH。
表1 表位预测的肽段位置
2.2 AMH的理化特性分析
AMH的理化性质分析显示：AMH的分子质量为30213.39 Da，理论等电点为4.54，不稳定指数为26.78，脂肪族指数为26.46，亲水性指数为-0.187；抗原性预测结果显示，AMH的保护性抗原总体分值为0.8071；亲水性分析发现，AMH的氨基酸中亲水性最高的是第195位的丝氨酸（Ser），值为-2.222，疏水性最高的是第59位的异亮氨酸（Ile），值为1.589，表位蛋白AMH的平均亲水性值为-0.198（图1A）；AMH的跨膜区分析发现，AMH的跨膜螺旋数为0，无跨膜区（图1B）。分析结果表明，表位蛋白AMH为非跨膜蛋白，具有良好的免疫原性、亲水性和稳定性。
2.3 AMH的空间结构分析
AMH的二级结构分析显示，AMH中α螺旋占比11.80%，β折叠占比8.85%，无规则卷曲占比59.02%，延伸链占比20.33%（图2 A）。 AMH模型显示，Ag85b、MPT63、HSP家族的晶体结构与AMH的重合度分别为64.81%、92.98%和21.74%（图2 B）。结果表明，AMH的整体结构松散，有利于抗原抗体的结合，与MPT63的三级结构重合度最高，可能发挥的免疫效果也最接近。
2.4 AMH的免疫模拟
用C-IMMSIM模拟AMH刺激免疫细胞后所引起特异性抗体和细胞因子的变化。结果显示，AMH刺激机体后处于抗原递呈状态下的B细胞数量快速上升，活化状态下的B细胞数量随后也开始上升（图3 A）；活化和休眠状态下的CD4+T细胞在AMH的刺激下数量同时上升（图3 B）；CD8+T细胞中活化状态的细胞数量上升，而休眠状态的细胞数量下降（图3 C）；AMH刺激B细胞后，主要引起IgM和IgG的大量分泌，在第14天达到最高水平（图3 D）；AMH诱导T细胞主要产生IFN-γ和IL-2（图3 E）。分析结果表明，AMH具有引发体液免疫和细胞免疫的能力。
2.5 重组质粒和重组减毒沙门菌的验证
将AMH、Ag85b、MPT63、HSP65连接构建至真核表达载体pEGFP-N1，用限制性内切酶EcoR I和Hand III对构建的重组质粒双酶切验证，获得大小为4 733 bp和3 313 bp的两条预期片段（图4 A），PCR验证，结果在3 313bp处出现特异性目的条带（图4 B）；重组沙门菌菌液PCR结果显示，在3 313 bp处有一条明亮的目的条带（图4 C）。结果说明，重组质粒和重组减毒沙门菌构建成功。
2.6 抗体水平分析
ELISA检测结果发现（图5），加强免疫后第14天，CZ组小鼠产生的特异性抗体IgG水平（149.15 ng/L）均极显著高于PBS组（59.23 ng/L）和KZ组（68.45 ng/L）（P<0.01；图5），且KZ组与PBS组之间小鼠产生的IgG无显著差异（P>0.05；图5）。
2.7 细胞因子检测
利用ELISA试剂盒检测发现，加强免疫后第14天， CZ组小鼠血清中的IFN-γ、IL-4和IL-10含量（463.96 ng/L、317.30 ng/L、147.29 ng/L）均显著或极显著高于KZ组（374.67ng/L、281.65 ng/L、124.66 ng/L）和PBS组（296.33 ng/L、213.00ng/L、103.08 ng/L）（P<0.05或P<0.01），KZ组小鼠血清中的这三种细胞因子含量也显著或极显著高于PBS组（P<0.05或P<0.01）。
2.8 脾淋巴细胞分型
流式细胞术检测T淋巴细胞分型结果显示：CZ组小鼠脾脏CD4+T淋巴细胞占比（75.17%）显著高于PBS组（68.63%）（P<0.05），而CD8+T淋巴细胞占比（19.47%）显著低于PBS组（25.23%）（P<0.05）；CZ组CD4+/CD8+的比值（3.89）显著高于PBS组（2.78）（P<0.05）；同时，KZ组小鼠脾脏CD4+和CD8+T淋巴细胞占比（72.43%和22.07%）及CD4+/CD8+的比值（3.29）和PBS组小鼠各型T淋巴细胞之间均无显著差异（P>0.05；图7）。
2.9 小鼠脏重比
二免后14 d，小鼠处死后解剖并摘取新鲜脏器，先观察是否有病理变化再称重记录，计算各脏器的脏体比并分析。分别观察三组小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏的大小、色泽、纹理后，未见明显病理变化。计算并分析各小鼠的脏体比，结果显示，三组小鼠各脏器的脏体比值均在正常范围且各组无明显差异（图8）。
2.10 组织切片观察
对小鼠各脏器进行染色切片处理后用显微镜观察。结果显示，三组心脏切片的心肌纤维呈圆形或多边形，肌纤维膜较清楚，细胞核位于中央，肌纤维之间含少量结缔组织和丰富的毛细血管；肝脏切片中肝细胞形态正常，细胞核居中，可见库普勒细胞，且肝细胞以中央静脉为中心向周围呈放射状排列，形成肝索；脾脏切片中白髓和红髓分界较为清晰，脾被膜伸入脾小梁，可见小梁静脉，红髓中可见脾索和脾血窦结构；肺脏切片中肺泡囊、肺泡管、肺泡结构清晰；肾脏切片中肾小球、肾小管结构清晰，间质细胞形态正常，细胞核居中；十二指肠切片中黏膜层、黏膜下层、肌层和外膜结构清晰且完整（图9）。
3 结论
3.1 利用生物在线软件筛选出牛结核分枝杆菌特异性抗原Ag85B、MPT63和HSP65的B细胞线性表位和T细胞线性表位，将所选的线性设计连接后预测其理化性质、免疫原性、二维结构和三维结构，构建出一条具有良好免疫原性的表位肽段AMH；
3.2 将AMH与特异性抗原Ag85B、MPT63和HSP65用剪切肽连接后构建至真核表达载体pEGFP，成功构建重组质粒；
3.3 重组质粒转染细胞后可顺利反转录成cDNA，四个目的蛋白均在胞质中表达；
3.4 重组质粒导入减毒沙门菌后构建出重组减毒沙门菌，外源质粒的导入对沙门菌的生理特性无明显影响，在抗性环境中重组减毒沙门菌可稳定携带外源质粒，且重组减毒沙门菌侵染细胞后也可传递外源质粒；
3.5 重组减毒沙门菌口服免疫小鼠后血清中相关抗体与细胞因子均有显著升高，可引发体内的细胞免疫和体液免疫，免疫小鼠后无明显的毒副作用。
本发明的创新之处在于，通过激发表位基因启动自身的细胞和体液免疫功能，利用牛结核病三种特异性抗原基因Ag85B、MPT63和HSP65启动特异性免疫反应。实现了多基因协同的免疫效应，试验结果证明利用表位蛋白所构建的重组减毒沙门菌安全性较高且具有良好的免疫效果，为牛结核病的基因疫苗研究提供试验基础和理论支持。
以上所述的实施例仅用于说明本发明的技术思想及特点，其目的在于使本领域内的技术人员能够理解本发明的内容并据以实施，不能仅以本实施例来限定本发明的专利范围，即凡本发明所揭示的精神所作的同等变化或修饰，仍落在本发明的专利范围内。
Claims (4)
1. 一种具有免疫原性的表位蛋白AMH，其特征在于所述该蛋白的氨基酸序列为SEQ IDNO.1所示。
2.一种重组质粒pEGFP-AMH-Ag85B-MPT63-HSP65。
3.权利要求2所述重组质粒的构建的方法，其特征在于包括以下步骤：
从NCBI网站上的GenBank中分别检索Ag85B、MPT63和HSP65的基因序列，利用生物在线软件分析其各种表位，然后将筛选出的表位连接构建出新的表位序列AMH；
表位基因AMH和牛结核病的三种特异性抗原基因利用T2A或者P2A连接并构建至真核表达载体pEGFP，将构建的重组真核表达质粒pEGFP-AMH-Ag85B-MPT63-HSP65转染至HEK293细胞观察绿色荧光的表达，经RT-PCR及Western Blotting试验和间接免疫荧光检测目的蛋白的表达；
重组质粒pEGFP-AMH-Ag85B-MPT63-HSP65运用热激方法转入减毒沙门菌LH430中，对所构建的菌株进行PCR及测序验证，对构建成功的重组减毒沙门菌进行生长曲线、体外稳定性、侵染效果验证，验证重组减毒沙门菌LH430是否可用于动物免疫试验，评价疫苗免疫效果；重组减毒沙门菌LH430口服免疫小鼠后，采集不同时间段的小鼠血清，检测血清中相关抗体及细胞因子水平的变化。
4.采用权利要求3所述方法构建的重组减毒沙门菌LH430在用于提高牛免疫力方面的应用。
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