CN117551171A - 豌豆肽、修饰豌豆肽的制备方法及改善胃肠道功能的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及豌豆肽技术领域，具体涉及豌豆肽、修饰豌豆肽的制备方法及改善胃肠道功能的用途。该豌豆肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。该修饰豌豆肽的制备方法是将如SEQ ID NO.1所示的豌豆肽与单甲氧基聚乙二醇‑丁醛反应制得。该用途包括制备肠道抗菌或抑菌产品、制备提高肠道免疫功能产品、制备治疗肠道炎症产品、制备改善炎症肠道形态产品、制备改善胃肠激素紊乱产品和制备提高肠道短链脂肪酸含量产品。

Description

豌豆肽、修饰豌豆肽的制备方法及改善胃肠道功能的用途
技术领域
本发明涉及豌豆肽技术领域，具体涉及豌豆肽、修饰豌豆肽的制备方法及改善胃肠道功能的用途。
背景技术
豌豆，学名Pisum sativum Linn.，其营养丰富，其淀粉含量55～68％，而蛋白含量20～30％，粗纤维含量8～10％，脂肪含量低于2％。由于豌豆含有丰富的淀粉，除食用外，主要用于生产豌豆淀粉及相关产品。豌豆蛋白是豌豆的重要组成部分，其生物价48～64％，功效比0.6～1.2，且不易过敏，具有较高的营养价值。豌豆蛋白的氨基酸比例较为均衡，易于消化吸收，同时赖氨酸含量较高，是一种良好的蛋白质来源。因此，综述近年来豌豆蛋白及其抗氧化肽的提取方法、分析豌豆蛋白的理化性质及其抗氧化肤的生物活性，为豌豆蛋白的生产和综合开发利用提供参考。
发明内容
本发明人经过对豌豆假设蛋白KIW84_055578的氨基酸序列和前期功能研究发现，其中序列中一个短肽具有相较于该假设蛋白特有的生物学功能，即该豌豆肽具有抗菌、抑菌、提高肠道免疫功能、治疗肠道炎症、改善炎症肠道形态、改善胃肠激素紊乱和提高肠道短链脂肪酸含量的功能。
基于此，本发明提供了一种豌豆肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明提供了一种修饰豌豆肽的制备方法，将如SEQ ID NO.1所示的豌豆肽与单甲氧基聚乙二醇-丁醛反应。
进一步地，所述豌豆肽与所述单甲氧基聚乙二醇-丁醛的反应加入量为1:2。
进一步地，反应体系为100mM pH5.0的乙酸-乙酸钠的缓冲液。
进一步地，所述反应时间为40～60min。
进一步地，所述反应以乙醇胺为进行终止。
本发明提供了一种所述的制备方法制得的修饰豌豆肽。
本发明提供了一种在制备改善肠道健康的制品中的用途。
本发明提供了一种制得的修饰豌豆肽的如下至少一项用途：
1)制备肠道抗菌或抑菌产品；
2)制备提高肠道免疫功能产品；
3)制备治疗肠道炎症产品；
4)制备改善炎症肠道形态产品；
5)制备改善胃肠激素紊乱产品；
6)制备提高肠道短链脂肪酸含量产品。
附图说明
图1为豌豆肽修饰产物的ZORBAX SB-C18反相色谱图，A为实验组修饰反应产物，B为对照组修饰反应产物。
图2为豌豆肽(Pep)和修饰豌豆肽(Mod-pep1)的时间-杀菌曲线。
图3为不同pH值下豌豆肽(Pep)、修饰豌豆肽1(Mod-pep1)和修饰豌豆肽2(Mod-pep2)的杀菌效率，“*”表示统计学差异，p<0.05。
图4为胃蛋白酶(Pepsin,3000-3500NFU)、胰蛋白酶(Trypsin,250NFU)和α-糜蛋白酶(α-chymotrypsin,1200U)分别处理豌豆肽(Pep)、修饰豌豆肽(Mod-pep1)和修饰豌豆肽(Mod-pep2)后的杀菌效率，“*”表示统计学差异，p<0.05。
图5为模型组(MOD)、实验组I(EXP1)和实验组II(EXP2)的小鼠十二指肠(duodenum)、空肠(jejunum)和回肠(ileum)中sIgA的表达量，“*”表示统计学差异，p<0.05。
图6为正常组(NOM)、模型组(MOD)、实验组I(EXP1)和实验组II(EXP2)的小鼠肠道中的乙酸含量，“*”表示统计学差异，p<0.05。
图7为正常组(NOM)、模型组(MOD)、实验组I(EXP1)和实验组II(EXP2)的小鼠肠道中的丙酸含量，“*”表示统计学差异，p<0.05。
图8为正常组(NOM)、模型组(MOD)、实验组I(EXP1)和实验组II(EXP2)的小鼠肠道中的丁酸含量，“*”表示统计学差异，p<0.05。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。本发明中未详细单独说明的试剂均为常规试剂，均可从商业途径获得；未详细特别说明的方法均为常规实验方法，可从现有技术中获知。
实施例1、豌豆肽的合成
以NCBI公开的>KAI5410143.1hypothetical protein KIW84_055578豌豆(Pisumsativum L.)蛋白氨基酸序列和前期实验研究为依据，本发明主要集中研究豌豆肽ISQIQRPVKELAFP的相关生物学活性。为此，采用相册的化学固相合成方法合成该豌豆肽，所得豌豆肽具有良好的水溶性，分子量为1625.91g/mol，等电点为10.12左右，-20℃冰箱中长期保存。
实施例2、豌豆肽的修饰
即使本发明制得的豌豆肽具有水溶性高的特点，但在生物体内也由于其水溶性高而导致易于被水解酶破坏、易于被肾小球滤过清除等造成其在体内不易被吸收等问题。因此，本实施例利于聚乙二醇对豌豆肽进行修饰，得到了一种聚乙二醇修饰的豌豆肽。具体如下：
1、修饰反应
实验组：以100mM pH5.0的乙酸-乙酸钠为缓冲体系，于20℃条件下进行反应，反应体系中豌豆肽初始浓度为1.5mg/mL，用mPEG-ButyrALD 5000(单甲氧基聚乙二醇-丁醛，分子量为M.W.5000，广东翁江化学试剂有限公司)为修饰剂初始浓度为1.5mg/mL，充分反应50min，加入过量乙醇胺(20mg/mL，加量为总反应体积的一半)终止反应，并稀释5倍后进行产物分析，得到修饰豌豆肽1。
对照组：用mPEG-ButyrALD 5000(单甲氧基聚乙二醇-丁醛，分子量为M.W.20000Da，广东翁江化学试剂有限公司)，其他反应条件与上述相同，得到修饰豌豆肽2。
2、修饰产物分析
利于ZORBAX SB-C18反相柱进行梯度洗脱，流动相A相：100mM乙酸-乙酸钠缓冲液(pH5.0)(含0.1三氟乙酸，w/v)；B相：甲醇含0.1三氟乙酸，w/v)；流速0.9mL/min；检测波长280nm。梯度洗脱程序为：0→50min，95％A→20％A。标准曲线：精密称取50mg豌豆肽，用100mM乙酸-乙酸钠缓冲液(pH5.0)配置成不同梯度，以上述色谱条件进样20μL，建立色谱峰面积与相应豌豆肽浓度的标准曲线。结果如图1所示，在280nm条件下，50min的反应时间可以得到大量修饰豌豆肽，而对照组中的修饰豌豆肽色谱峰面积较小(说明其反应收率较低)。
3、修饰豌豆肽的分离纯化
将上述反应产物上样至Sp Sepharose Fast Flow(柱体积10ml)进行层析纯化，以pH＝4、含0.5M的NaCl的0.02M醋酸盐液以0％→100％体系20个柱体积能够得到修饰豌豆肽的纯的为96％以上(上述液相纯度)。
实施例3、豌豆肽及修饰豌豆肽的体外杀菌活性和抗逆性
1、试剂及仪器
豌豆肽由奥林贝尔科技有限公司提供，其通过枯草芽孢杆菌表达系统分泌而来；LB培养基、MH肉汤培养基购于青岛海博生物；氨苄青霉素购于生工生物工程；麦氏比浊管购于中诺泰安；胃蛋白酶、胰蛋白酶和α-糜蛋白酶购于北京索莱宝科技有限公司；pH计(上海雷兹phs-3c)；酶标仪(BioTek，美国)等。
2、试验菌株和试验品
大肠杆菌ATCC25922、鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028、金黄色葡萄球菌ATCC25923、幽门螺杆菌ATCC43504和巴氏杆菌ATCC19427均来源于美国标准菌种收藏所(American TypeCulture Collection；ATCC,美国)。
试验品为上述实施例1提供的豌豆肽和实施例2提供的修饰豌豆肽。
3、抑菌效果测定
豌豆肽及修饰豌豆肽的杀菌效果通过抑菌圈-牛津杯法进行直观评价，以最小抑菌浓(MIC)确定豌豆肽和修饰豌豆肽的抑菌效果。MIC通过液体微量稀释法来测定。具体步骤如下：1)制备LB固体培养基，灭菌后在超净工作台上接种细菌，放入37℃恒温培养箱内培养16-24h；2)制备MH肉汤培养基，灭菌后在LB固体培养基上挑取单克隆至MH肉汤培养基中，37℃、220r/min培养8h；3)取10mLMH肉汤培养基于灭菌的离心管中，用生理盐水稀释到0.5个麦氏比浊管，此时浓度约为1.5×108CFU/mL；4)再加入刚配制的无菌的MH肉汤培养基，稀释到约5×105CFU/mL；5)在96孔板上加入180μL、5×105CFU/mL上述溶液；6)并加入20μL的豌豆肽溶液，轻轻吹打混合。7)放入37℃恒温培养箱培养16-24h，肉眼观察细菌的生长情况，未变浑浊的浓度即为最小抑菌浓度。
结果可知，豌豆肽对大肠杆菌ATCC25922、鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028、巴氏杆菌ATCC19427、幽门螺杆菌ATCC43504和金黄色葡萄球菌ATCC25923的MIC分别是0.25、0.5、0.7、0.6和1.4μg/mL；实验组得到的修饰豌豆肽的MIC分别是0.5、0.5、0.8、0.8和1.6μg/mL。而对照组得到的修饰豌豆肽的MIC分别是1.6、0.8、1.2、5.0和5.0μg/mL。
4、豌豆肽及修饰豌豆肽的时间-杀菌曲线
时间-杀菌曲线也是反映抗菌肽的杀菌效果之一，通过在时间和剂量上比较，初步显示了豌豆肽发挥杀菌作用的动力学，具体步骤如下：1)将大肠杆菌作为指示菌，接种于LB固体培养基上，37℃培养24h后，挑取单克隆至MH肉汤培养基，培养8h；2)将上述菌液稀释至1×106CFU/mL，取180μL于96孔板中；3)取0、0.25、1和10倍的MIC值的浓度的豌豆肽20μL，加入到96孔板中，设置三个复孔；4)将96孔板放入37℃恒温培养箱16h，并在1、2、4、8和16h时，检测每个孔的OD值，统计数据，根据公式结算结果。5)公式如下：杀菌效率＝(A-A1)/(A1-A2)×100％，其中，A、A1和A2代表阴性对照、不同处理因素和阳性对照试验在反应之后紫外分光光度计A520波长下的吸光值。
本试验以大肠杆菌ATCC25922为指示菌，选用1倍MIC值的豌豆肽或修饰豌豆肽1以不同时间点(第1、2、4、8、16h)检测OD值，得出图2。由图2得知，随着杀菌时间的延长，豌豆肽或修饰豌豆肽在第6h杀菌效率达到峰值后开始下降；下降到第10h后，杀菌效率开始趋于平缓。
5、豌豆肽的抗逆性测定
抗逆性检测主要包括pH和蛋白酶对豌豆肽发挥抗菌效果的影响，具体步骤为：2)利用pH计制备pH为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0的6份溶液，取100μL不同pH的溶液等体积与40μg/mL的豌豆肽均匀混合，在37℃的水浴锅中孵育30min，设置三个重复；4)配制胃蛋白酶(3000-3500NFU)、胰蛋白酶(250NFU)和α-糜蛋白酶(1200U)溶液，取100μL等体积与40μg/mL的豌豆肽均匀混合，在37℃的水浴锅中孵育30min，设置三个重复；5)取20μL处理后的豌豆肽于96孔板中，并加入180μL备用的5×105的菌液，吹打混匀，放置37℃恒温培养箱中培养24h，检测OD值；6)计算公式与时间—杀菌曲线计算公式一致。
结果如图3所示(图3中，“*”表示不同pH值下相对于豌豆肽的杀菌效率有显著性差异，p<0.05)，豌豆肽在不同pH值下的杀菌效率不如修饰豌豆肽1，说明修饰豌豆肽1更适合于体内胃部酸性环境进行杀菌或抑菌，并且对照组制得的修饰豌豆肽2相对于豌豆肽在不同pH值下的杀菌效率无明显提高。如图4所示，胃蛋白酶(Pepsin,3000-3500NFU)、胰蛋白酶(Trypsin,250NFU)和α-糜蛋白酶(α-chymotrypsin,1200U)分别处理豌豆肽及修饰豌豆肽1后，豌豆肽的抗菌活性显著降低，而修饰豌豆肽1无明显降低，说明采用上述修饰方式得到修饰豌豆肽提高了豌豆肽的抗菌性，更利于其体内发挥抗菌功能。
实施例4、体内试验
1、材料与方法
(1)实验动物和试验品
SPF级昆明种小鼠，由济南朋悦实验动物繁育有限公司提供，实验动物生产许可证号为SCXK鲁)2019-0003。环境温度22℃±2℃，相对湿度50％±10％，光照周期设定为12h明暗自动控制。试验品为上述实施例提供的豌豆肽及修饰豌豆肽(实验组制得的修饰豌豆肽)，用无菌水稀释以便进行小鼠灌胃。
(2)急性毒性试验
以20g/kg·bw的剂量连续灌胃14d后，两性别小鼠状态良好，行为正常，未见明显的中毒症状及死亡。将受试动物处死后进行解剖检查，肝、脾、肾、心脏、肺、胃和肠等主要器官，均未见明显异常改变。认为受试样品对SPF级昆明种小鼠的最大耐受剂量(MTD)均大于20g/kg·bw(LD50>20g/kg·bw)，根据经口急性毒性分级标准划为实际无毒级别。
(3)慢性胃炎小鼠模型建立及分组实验
慢性胃炎小鼠模型的建立方法为：1×109CFU/mL Hp菌液(幽门螺杆菌，Hp标准菌株SSI，中国药品生物制品鉴定所)，灌胃SPF级昆明种小鼠，剂量为0.2mL，每2d灌胃一次，连续5次，灌胃前6h和灌胃后0.5h禁食禁水。距离末次灌胃Hp细菌悬液结束后4周，麻醉处死小鼠，取胃窦组织用于快速尿素酶实验、病理学检测和Hp培养实验，革兰染色结果呈红色、快速尿素酶结果阳性(酚红颜色变为红色)、Hp细菌培养结果阳性判定为Hp感染，则表示Hp感染模型制备成功。
分组实验，依次分为正常组、模型组、实验组I和实验组II。正常组和模型组不进行灌胃。实验组I以20g/kg·bw的剂量连续灌胃豌豆肽慢性胃炎模型小鼠14d。实验组II以20g/kg·bw的剂量连续灌胃修饰豌豆肽慢性胃炎模型小鼠14d。
(3)组织样品制备
分别取的15d小鼠，空腹8h后，从各处理中的每个重复随机挑选一只体重接近各重复平均体重的正常小鼠，将十二指肠、空肠、回肠肠段分开，剪去各肠段两端部分，取中间较好肠段分成两段：一段用生理盐水轻轻洗去内容物，取中部大约3cm左右放入4％的多聚甲醛中固定，转入4℃保存，用于制作石蜡切片；另一段用生理盐水轻轻洗去内容物后纵向剪开，轻轻刮取黏膜组织于冻存管，放入液氮暂存后转入-80℃保存，用于测定小肠营养物质转运载体的表达。将盲肠分出，轻轻挤出盲肠食糜，装入无菌的冻存管中，液氮暂存后转至-80℃保存。
(4)肠组织形态
从各组小鼠内脏团中分离出肠道，取中肠和后肠内容物即肠道食糜至1.5mL冻存管用于肠道微生物和酶活性的分析(刮取肠道食糜等内容物时，注意防止肠道黏膜损伤)，然后分别取中肠、后肠肠道组织于1.5mL离心管用于肠道基因荧光定量表达分析，液氮速冻用，使用前在-80℃条件下储存，采用尼康Ni-E/Ni-U型正置荧光显微镜进行观察和计算肠绒毛高度IVH/μm、肠绒毛宽度IVW/μm和肌层厚度IWT/μm。
(5)胃肠激素水平检测
在处死小鼠前，在麻醉状态下采集0.2mL眼球取血置于抗凝管中，离心，收集上清液于-80℃保存。随后随机处死6只小鼠，分离胃组织，取0.2g胃组织，研磨制成组织匀浆，离心，取上清液存储于-80℃。采用酶联免疫吸附法检测血浆和胃组织上清液中的胃动素(MTL)、5-色羟胺(5-HT)、胃泌素(Gas)、生长抑素(SS)、胃饥饿素(Grelin)水平，MTL试剂盒(上海莼试生物技术有限公司)，其他试剂盒(上海雅吉生物科技有限公司)，操作严格参照试剂盒说明书进行。
(6)小肠分泌型免疫球蛋白A(sIgA)的表达量
小肠分泌型免疫球蛋白A(sIgA)检测采用免疫组化的方法，山羊抗鼠sIgA单克隆抗体(PMA04C020258，Perfemiker)作为一抗，采用光学显微镜对小肠sIgA阳性信号进行定性分析，利用Image-Pro Plus 6.0软件进行平均光密度(Mean of iod)半定量分析。
(7)肠道食糜短链脂肪酸测定
称取冷冻干燥后的肠道食糜样品100mg，加1mL水混匀，加200μL50％硫酸，再加1000mg/L的内标(环己酮)溶液50μL和乙醚1mL匀浆1min，于4℃、12000rpm离心10min，取上清上气相色谱质谱联用仪机器上(日本，岛津，GCMS QP2010-Ultra)测定。利用GCMSSolution软件进行积分，利用标准曲线进行含量计算得到短链脂肪酸的值。
2、结果
表1示出了各组小鼠肠道形态指标，其中，“*”表示相对于模型组具有显著性差异(P＜0.05)，“#”表示相对于正常组具有显著性差异(P＜0.05)。由表1可知，实验组II相对于正常组和模型组均具有显著性差异，说明本发明提供的修饰豌豆肽能够改善炎症小鼠的肠道形态。
表1各组小鼠肠道形态(平均值±标准误差)
表2各组小鼠胃肠激素水平(平均值±标准误差)
5-HT(ng/mL) Gas(pg/mL) MTL(pg/mL) SS(pg/mL) Grelin(pg/mL)
正常组 19.03±1.97 33.42±4.16 304.23±13.26 249.37±12.36 149.03±6.32
模型组 32.25±2.45 53.19±7.05 378.23±26.02 187.03±10.78 98.72±7.84
实验组I 21.03±2.05* 37.25±4.78* 312.18±17.03* 234.25±14.78* 139.36±10.36*
实验组II 14.63±1.92*# 25.84±6.09*# 268.52±20.24*# 256.92±16.33*# 152.84±9.09*#
表2示出了各组小鼠胃肠激素水平，其中，“*”表示相对于模型组具有显著性差异(P＜0.05)，“#”表示相对于正常组具有显著性差异(P＜0.05)。由表2可知，实验组II相对于正常组和模型组均具有显著性差异。Hp感染会影响宿主胃肠动力、胃肠激素分泌，本研究发现Hp感染小鼠外周血和胃组织5-HT、Gas、MTL水平升高，而SS和Grelin水平降低。5-HT可参与消化系统调节，大部分5-HT合成分泌来自于消化道。Gas是由胃黏膜G细胞分泌的具有刺激胃酸分泌、胃蛋白酶分泌的胃肠激素，可促进细胞生长功能。Hp毒力蛋白可激活Gas启动子，促进Gas分泌。SS可通过旁分泌方式抑制胃酸、胃蛋白酶分泌，还对Gas释放有抑制作用，影响胃肠道功能运转，发挥胃黏膜保护作用。MTL参与胃肠运动、胃肠道水和电解质的运输过程，Grelin在食欲调节、胃排空、胃酸分泌过程中发挥重要作用，Hp感染者胃黏膜Grelin表达水平降低，其水平抑制程度与胃黏膜损伤严重程度有关，Grelin水平持续性降低可引起细胞免疫反应以及慢性活动性胃炎发生。本研究结果显示，本发明提供的豌豆肽及修饰豌豆太肽能够调节Hp感染所致的胃肠激素紊乱。
如图5所示，“*”表示实验组II相对于模型组具有显著性差异(P＜0.05)，由此表明对Hp模型小鼠灌胃修饰豌豆肽能够显著提供其十二指肠、回肠和空肠sIgA的表达量，对空肠的肠道健康有着卓著成效。
如图6所示，“*”表示实验组II相对于模型组和正常组具有显著性差异(P＜0.05)。由此表明，对Hp模型小鼠灌胃修饰豌豆肽能够小鼠肠道中的短链脂肪酸含量。短链脂肪酸通过降低鱼类胃和肠道的PH值以及通过酸的离解和细菌细胞中阴离子的产生抑制革兰氏阴性细菌的生长来调节宿主的生理状态。短链脂肪酸是由小肠内不被消化吸收的复杂碳水化合物进入大肠后由厌氧微生物发酵而产生的，其中乙酸、丙酸和丁酸所占比例高达85％。短链脂肪酸SCFAs具有调节肠道免疫功能以及降低肠道通透性等重要的生理功能，并且是肠道上皮细胞以及肝脏能量的重要来源之一。丁酸对很多突变物质具有抑制活性，是肠道中强的抗癌物质，丁酸是结肠细胞首选的能源物质，并与细胞凋亡和细胞分化的调控有关。由此可见，本发明提供的修饰豌豆肽不仅能够提高小鼠肠道中的短链脂肪酸含量，还能改善肠道免疫功能，降低肠道通透性，调节肠道细胞凋亡和分化，进而调控肠道健康。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种豌豆肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种修饰豌豆肽的制备方法，其特征在于，将如SEQ ID NO.1所示的豌豆肽与单甲氧基聚乙二醇-丁醛反应。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述豌豆肽与所述单甲氧基聚乙二醇-丁醛的反应加入量为1:1。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，反应体系为100mM pH5.0的乙酸-乙酸钠的缓冲液。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述反应时间为40～60min。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述反应以乙醇胺进行终止。
7.权利要求2～6任一所述的制备方法制得的修饰豌豆肽。
8.权利要求1所述的豌豆肽在制备改善肠道健康的制品中的用途。
9.权利要求2～6任一所述的制备方法制得的修饰豌豆肽的如下至少一项用途：
1)制备肠道抗菌或抑菌产品；
2)制备提高肠道免疫功能产品；
3)制备治疗肠道炎症产品；
4)制备改善炎症肠道形态产品；
5)制备改善胃肠激素紊乱产品；
6)制备提高肠道短链脂肪酸含量产品。
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