CN117535277A - 一种固定化酶及利用该固定化酶制备d-塔格糖方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种固定化酶及利用该固定化酶制备D‑塔格糖方法，涉及生物技术领域领域，将发酵液用盐酸溶液调节pH，然后与十六烷基三甲基溴化铵和硫酸铵混合，加入硅藻土，用板框进行压榨，收集滤液，滤液经超滤膜和重力纯化柱纯化，取活化的氨基树脂加入洗脱液中，搅拌吸附后，用去离子水进行洗涤、抽滤，得固定化酶。制备方法操作简单，反应条件温和，且酶的固定化率高，且固定化酶可重复使用，对D‑半乳糖的转化率高。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域领域，具体涉及一种固定化酶及利用该固定化酶制备D-塔格糖方法。
背景技术
D-塔格糖是一种天然己酮糖，分子式为C6H10O6，是D-半乳糖的酮糖异构体，甜度是蔗糖的92％，热量不到蔗糖的1/3，是一种低热量甜味剂，具有改善肠道菌群、降血糖、抗龋齿，预防肥胖等功效。D-塔格糖可代替蔗糖广泛应用于果汁、饮料、口香糖等食品领域，同时还用作药用辅料应用于医药行业中。
目前，D-塔格糖的生产主要有化学法和生物法两种，其中化学法存在副产物多、纯化繁琐、污染大等缺点，不利于工业化生产。生物法通常以D-半乳糖为底物，利用L-阿拉伯糖异构酶(L-AI)将其异构化为D-塔格糖。使用纯酶催化转化样检测D-塔格糖含量的反应速度快、效率高，但是纯酶存在着易失活、以及纯化过程繁琐的不足，不利于工业化生产，这些因素导致塔格糖合成途径的生产成本高昂，因此需要开发一种固定化方法，固定塔格糖合成途径中的酶，使其重复利用，降低生产成本。
目前虽有报道固定化法生产塔格糖的情况，如中国专利CN101265460A公开了一株重组L－阿拉伯糖异构酶的大肠杆菌及制备塔格糖的方法，通过培养工程菌并抽提粗酶液后，用5％(w/w)的海藻酸钠固定化粗酶，利用半乳糖的转化生产D-塔格糖，转化率可达60.2％，重复反应10次批，转化率在50-60％之间；再如，中国专利CN101531975B公开了一种发酵乳酸杆菌及利用其制备D-塔格糖的方法，利用游离的或者经固定化的Lactobacillusfermentum细胞的方式转化D-半乳糖制备D-塔格糖，D-塔格糖对底物的转化率可达50％。如Oh等利用海藻酸钙固定E.coli来源的L-阿拉伯糖异构酶，在24h内得到30g/L塔格糖，转化率30％，该固定化酶在8个转化批次内活性基本保持稳定(Oh DK,Kim HJ,KimP,etal.Developmet of an immobilization method of L ara binose isomerase forindustrial production of tagatose.Biotechnology Lette rs,2001,23,1859-1862)；再如中国CN107937454B公开了一种固定化酶催化剂生物合成D-塔格糖的方法，用枯草芽孢杆菌的芽孢固定化L-阿拉伯糖异构酶，重复利用20次后仍可维持85％以上的残留活力，但是，以上研究D-塔格糖的转化率均比较低，固定化酶重复利用后，残余酶活力较低，稳定性较差，进而影响到D-半乳糖到D-塔格糖的产量，也不太适合于塔格糖的工业化生产。
发明内容
本发明所要解决的第一个技术问题是：针对现有技术存在的不足，提供一种固定化酶的制备方法，D-塔格糖的转化率高，酶的稳定性高。
为解决上述第一个技术问题，本发明的技术方案是：
一种固定化酶的制备方法，包括以下步骤：
A：将表达L-阿拉伯糖异构酶的毕赤酵母工程菌以2-5％v/v接种于种子培养基中，于30-40℃的条件下培养8-10h，得培养液；
再将培养液以2-5％v/v的接种量接种于发酵培养基中培养30-40h，得到发酵液；
B：将发酵液用盐酸溶液调节pH至6-7，然后加入占发酵液体积1.0-3.0％g/L的十六烷基三甲基溴化铵和占发酵液体积2.0-5.0％g/L的硫酸铵，升温至40-50℃，搅拌1-3h，加入占发酵液体积3-10％g/L的硅藻土，然后用板框进行压榨，收集滤液；
C：将滤液经超滤膜进行浓缩，得到浓缩酶液；
D：将浓缩粗酶液加入重力纯化柱中，用0.1-0.5mol/L含咪唑的磷酸盐缓冲液进行洗脱，收集洗脱液；
E：取活化的氨基树脂加入洗脱液中，在20-40℃温度的条件下搅拌吸附2-6h，用去离子水进行洗涤3次，抽滤，得固定化酶。
优选的，步骤A中表达L-阿拉伯糖异构酶的毕赤酵母工程菌的宿主菌为毕赤酵母GS115,分泌表达载体质粒为pGAPZB，目的基因的基因序列为SEQ ID No:1所示，具体为：TGGCCAGATCGATGCGTTCCAGGGTGGTGGCAGGGGCAGTGGCATGCGCGATG AGCGTCGCGCCGTTCGCGGGGGCGACCGCGGTGATGACGCTTGCGACGACGCACGCGGCGATGGCGGCGACCGCGCCCGCCGACGACTACGCGACGACGCGTTATCCGATCATCCTCGTGCACGGGCTCACGGGTACCGACAAGTACGCGGGCGTGCTCGAGTACTGGTACGGCATCCAGGAAGACCTGCAGCAGCATGGCGCGACCGTCTACGTCGCGAACCTGTCGGGCTTCCAGAGCGACGACGGGCCGAACGGGCGCGGCGAACAGTTGCTCGCGTACGTGAAGACGGTGCTCGCGGCGACGGGCGCGACCAAGGTCAATCTCGTCGGCCACNCGCAGGGCGGGCTCACGTCGCGTTACGTTGCGGCTGTCGCGCCCGATCTCGTCGCGTCGGTGACGACGATCGGCACGCCGCATCGTGCNNCCGAGTTCGCCGACTTCGTGCAGGGCGTGCTCGCATACGATCCGACCGGGCTTTCGTCATCGGTGATCGCGGCGTTCGTCAATGTGTTCGGAATCCTGACGAGCAGCAGCCACAACACGAACCAGGACGCACTCGCGTCGCTGAAGACGCTGACGACCGCCCAGGCCGCCGCGTACAACCAGAACTATCCGAGCGCGGGCCTCGGTGCGCCGGGCAGTTGCCAGACCGGCNNNCCGACGGAAACCGTGCGGTNCAACACGCATCTGCTGTATTCGTGGGCCGGCACGGCGATCCAGCCGACGCTCTCCGTGTTCGGTGTCACGGGCGCGACGGACACGAGCACCATTCCGCTCGTCGATCCGGCGAACGCGCTCGACCCGTCGACGCTTGCGCTGTTCGGCACGGGCACGGTGATGATCAACCGCGGCTCGGGCCCGAACGACGGGCTCGTATCGAAGTGCAGCGCGCTGTACGGCCAGGTGCTGAGCACGAGCTACAAGTGGAACCATATCGACGAGATCAACCAGTTGCTCGGCGTGCGCGGCGCGAATGCGGAAGATCCCGTCGCGGTGATCCGCACGCATGCGAACCGGCTGAAGCTGGCGGGCG。
优选的，步骤A中发酵条件为：温度为34-40℃，风速1.0-2.0m3/h，转速200-300rpm，压力0.1-0.3Mpa，用氨水调节pH至7.0±0.1，溶氧为20-30％。
优选的，步骤B中的滤液以2-5BV/h的速率过阳离子交换树脂，再以1-3BV/h的速率过阴离子交换树脂，得到脱盐液，将脱盐液经超滤膜进行浓缩，得到步骤C中的浓缩酶液。
优选的，步骤C中超滤膜的孔径为5000-10000Da。
优选的，步骤C中的超滤清液用于十六烷基三甲基溴化铵和硫酸铵的配制。
优选的，步骤E中活化的氨基树脂为0.1-0.5mol/L的磷酸盐缓冲溶液与1.0-3.0％wt的戊二醛溶液混合，并用盐酸溶液调至pH至7-8，然后加入的氨基树脂，搅拌3-10h，过滤，得到一次滤饼，用去离子水进行浸泡、抽滤并重复进行三次以上制得，其中戊二醛溶液的加入量占磷酸盐缓冲溶液体积的2-5％v/v，氨基树脂的加入量与磷酸盐缓冲溶液和戊二醛溶液的混合溶液体积比为1.0-3.0g/100ml。
优选的，步骤E中活化的氨基树脂的加入量与洗脱液的体积比为1:90-110g/mL。
本发明所要解决的第二个技术问题是：针对现有技术存在的不足，提供一种利用固定化酶制备D-塔格糖方法，D-塔格糖的转化率高。
为解决上述第二个技术问题，本发明的技术方案是：
一种利用固定化酶制备D-塔格糖方法，其特征在于包括以下步骤：
F：向50-100g/L的D-半乳糖磷酸盐缓冲溶液中加入固定化酶，搅拌均匀，所述D-半乳糖磷酸盐缓冲溶液中磷酸盐缓冲液的浓度为50mmol/L、pH值为7；
G：转化反应体系pH 6.0-8.0，在60-80℃的条件下进行酶催化反应，得D-塔格糖。
优选的，步骤F中固定化酶的加入量与D-半乳糖溶液体积的比为2-5mg/ml。
由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
1.对发酵液处理采用浸泡的方式，相对采用均质机等处理方法，该方式操作比较简单，易操作，其固定化酶制备方法操作简单，反应条件温和，且酶的固定化率高。
2.固定化酶可重复使用，回用51批后，固定化酶催化剂活力仍在85％以上。
3.固定化酶的转化过程稳定，以50-100g/L的D-半乳糖为底物70℃转化D-塔格糖，其转化率都维持在90％以上。
附图说明
图1为不同D-半乳糖浓度下，固定化酶转化D-半乳糖的转化率图；
图2为固定化酶连续转化后的相对酶活图；
图3为实施例2中D-塔格糖的液相检测色谱图。
具体实施方式
下面结合实施例，进一步阐述本发明。
实施例1
(1)将表达L-阿拉伯糖异构酶的毕赤酵母工程菌以2％v/v接种于种子培养基中，于30℃的条件下培养8h，得培养液；
再将培养液以2％v/v的接种量接种于发酵培养基中培养30h，得到发酵液；
取发酵液60L，用盐酸将发酵液的pH调至6.0，然后加入十六烷基三甲基溴化铵0.6g和硫酸铵1.2g，升温至40℃，在40℃的条件下搅拌1h，1h后加入1.8g的硅藻土，进板框进行过滤，收集滤液60L。
(2)将步骤(1)中收集的滤液以2BV/h的速度进阳离子树脂柱，进完阳离子交换树脂柱后，以1BV/h的速度过阴离子交换树脂柱，收集脱盐液100L，脱盐液进超滤膜装置，收集超滤浓液10L，超滤清液110L。将收集的超滤浓液进入重力纯化柱，用0.1mol/L的含咪唑的磷酸盐缓冲液进行洗脱，收集洗脱液12L。
(3)将处理好的氨基树脂135g加入到含戊二醛的磷酸盐缓冲液中(戊二醛溶液的加入量占磷酸盐缓冲溶液体积的2％v/v，氨基树脂的加入量与磷酸盐缓冲溶液和戊二醛溶液的混合溶液体积比为1.0g/100ml，用盐酸调pH至7.0)，进行搅拌3h，然后用去离子水进行洗涤抽滤，重复3次，得到活化的氨基树脂，将收集的洗脱液加入到活化的氨基树脂中，在20℃的条件下进行搅拌2h，2h后用去离子水进行洗涤，抽滤，重复3次，得到固定化酶。
(4)将步骤(3)中得到的固定化酶按2mg/ml的比例加入50g/L的D-半乳糖磷酸盐缓冲溶液中，在pH＝6，温度60℃的条件下进行转化10h，样检测D-塔格糖含量，转化率为94.6％。
实施例2
(1)将表达L-阿拉伯糖异构酶的毕赤酵母工程菌以3％v/v接种于种子培养基中，于35℃的条件下培养9h，得培养液；
再将培养液以3％v/v的接种量接种于发酵培养基中培养35h，得到发酵液；
取发酵液60L，用盐酸将发酵液的pH调至6.5，然后加入十六烷基三甲基溴化铵1.2g和硫酸铵1.8g，升温至45℃，在45℃的条件下搅拌2h，2h后加入3.0g的硅藻土，进板框进行过滤，收集滤液62L。
(2)将步骤(2)中收集的滤液以3BV/h的速度进阳离子交换树脂柱，进完阳离子交换树脂柱，然后以2BV/h的速度进阴离子交换树脂柱，收集脱盐液102L，然后以进超滤膜装置，收集超滤浓液12L，超滤清液110L，将收集的超滤浓液进入重力纯化柱，用0.3mol/L的含咪唑的磷酸盐缓冲液进行洗脱，收集洗脱液14L。
(3)将处理好的氨基树脂140g加入到含戊二醛的磷酸盐缓冲液中(戊二醛溶液的加入量占磷酸盐缓冲溶液体积的3％v/v，氨基树脂的加入量与磷酸盐缓冲溶液和戊二醛溶液的混合溶液体积比为2.0g/100ml，用盐酸调pH至7.0)，进行搅拌5h，然后用去离子水进行洗涤抽滤，重复3次，得到活化的氨基树脂，将步骤(2)收集的洗脱液加入到活化的氨基树脂中，在30℃的条件下进行搅拌4h，4h后用去离子水进行洗涤，抽滤，重复3次，得到固定化酶。
(4)将步骤(3)中得到的固定化酶按3mg/ml的比例加入70g/L的D-半乳糖磷酸盐缓冲溶液中，在pH＝7，温度70℃的条件下进行转化10h，样检测D-塔格糖含量，转化率为96.2％
实施例3
(1)将表达L-阿拉伯糖异构酶的毕赤酵母工程菌以5％v/v接种于种子培养基中，于40℃的条件下培养10h，得培养液；
再将培养液以5％v/v的接种量接种于发酵培养基中培养40h，得到发酵液；
取发酵液60L，用盐酸将发酵液的pH调至6.5，然后加入十六烷基三甲基溴化铵1.5g和硫酸铵2.4g，升温至45℃，在45℃的条件下搅拌2.5h，2.5h后加入3.0g的硅藻土，进板框进行过滤，收集滤液63L。
(2)将步骤(2)中收集的滤液以4BV/h的速度进阳离子交换树脂柱，进完阳离子交换树脂柱，然后以2.5BV/h的速度进阴离子交换树脂柱，收集脱盐液103L，然后以进超滤膜，收集超滤浓液12L，超滤清液111L，将收集的超滤浓液进入重力纯化柱，用0.4mol/L的含咪唑的磷酸盐缓冲液进行洗脱，收集洗脱液14L。
(3)将处理好的氨基树脂140g加入到含戊二醛的磷酸盐缓冲液中(戊二醛溶液的加入量占磷酸盐缓冲溶液体积的5％v/v，氨基树脂的加入量与磷酸盐缓冲溶液和戊二醛溶液的混合溶液体积比为3.0g/100ml，用盐酸调pH至7.0)，进行搅拌5h，然后用去离子水进行洗涤抽滤，重复3次，得到活化的氨基树脂，将步骤(2)收集的洗脱液加入到活化的氨基树脂中，在35℃的条件下进行搅拌5h，5h后用去离子水进行洗涤，抽滤，重复3次，得到固定化酶。
(4)将步骤(3)中得到的固定化酶按3mg/ml的比例加入100g/L的D-半乳糖磷酸盐缓冲溶液中中，在pH＝8，温度80℃的条件下进行转化10h，样检测D-塔格糖含量，转化率为93.2％。
实施例4
(1)将表达L-阿拉伯糖异构酶的毕赤酵母工程菌以3％v/v接种于种子培养基中，于35℃的条件下培养9h，得培养液；
再将培养液以4％v/v的接种量接种于发酵培养基中培养35h，得到发酵液；
取发酵液60L，用盐酸将发酵液的pH调至7.0，然后加入十六烷基三甲基溴化铵1.8g和硫酸铵3.0g，升温至50℃，在50℃的条件下搅拌3h，3h后加入3.0g的硅藻土，进板框进行过滤，收集滤液64L。
(2)将步骤(1)中收集的滤液以5BV/h的速度进阳离子交换树脂柱，进完阳离子交换树脂柱，然后以3BV/h的速度进阴离子交换树脂柱，收集脱盐液106L，然后以进超滤膜装置，收集超滤浓液14L，超滤清液112L，将收集的超滤浓液进入重力纯化柱，用0.5mol/L的含咪唑的磷酸盐缓冲液进行洗脱，收集洗脱液14L。
(3)将处理好的氨基树脂130g加入到含戊二醛的磷酸盐缓冲液中(戊二醛溶液的加入量占磷酸盐缓冲溶液体积的4％v/v，氨基树脂的加入量与磷酸盐缓冲溶液和戊二醛溶液的混合溶液体积比为2.5g/100ml，用盐酸调pH至7.0)，进行搅拌10h，然后用去离子水进行洗涤抽滤，重复3次，得到活化的氨基树脂，将收集的洗脱液加入到活化的氨基树脂中，在40℃的条件下进行搅拌6h，6h后用去离子水进行洗涤，抽滤，重复3次，得到固定化酶。
(4)将步骤(3)得到的固定化酶按5mg/ml的比例加入90g/L的D-半乳糖磷酸盐缓冲溶液中中，在pH＝7，温度70℃的条件下进行转化10h，取样检测D-塔格糖含量，转化率为94.4％。
实施例5
固定化酶的制备方法同实施例2相同，步骤(4)转化体系中D-半乳糖的浓度设置分别为50，60，70，80，90，100g/L，在pH＝7，温度70℃的条件下转化5h，取样检测D-塔格糖浓度，计算其转化率，见图1。
实施例6
固定化酶的制备方法与实施例2相同，用50mmol/L的磷酸盐缓冲液将D-半乳糖配制成70g/L,加入固定化酶，每次转化时间10h，回收固定化酶，连续转化51次，测定转化液中D-塔格糖含量，以第一次转化后的料液中D-塔格糖含量为相对酶活100％，见图2。
对比例1
与实施例2不同的是，步骤(1)中只加入硫酸铵，其余操作条件相同，步骤(4)中得到D-塔格糖，转化率为82.3％。
对比例2
与实施例2不同的是，步骤(1)中用盐酸调发酵液pH为5.0，其余操作条件相同，步骤(4)中得到D-塔格糖，转化率为75.4％。
对比例3
与实施例2不同的是，步骤(2)用磷酸盐缓冲液对重力纯化柱进行洗脱，其余条件相同，步骤(4)得到D-塔格糖，转化率为72.0％。
对比例4
与实施例2不同的是，步骤(3)中用盐酸调pH至9，其余条件不同，步骤(4)中得到D-塔格糖，转化率为79.5％。
对比例5
与实施例2不同的是，步骤(3)中处理好的氨基树脂加入到磷酸盐缓冲液中，其余操作条件相同，步骤(4)中得到D-塔格糖，转化率为80.6％。
通过实施例和对比例，得出以下结果：
1.通过本发明方法对酶进行固定化，所得固定化酶对D-半乳糖的转化率达90％以上，显著提高了酶对D-半乳糖的转化率，同时由于酶固定在树脂上，因此在转化完成后可以通过过滤的方式回收再利用。
2.以50-100g/L的D-半乳糖为底物60-80℃转化D-塔格糖，其转化率都维持在90％以上，说明制备的固定化酶在转化过程中比较稳定。
3.本发明制备的固定化酶连续转化D-半乳糖51批后，固定化酶的酶催化活力仍在85％以上。
综上所述，本发明制备的固定化酶具有酶活高，利用其制备塔格糖的周期短及重复利用率高的优势。
应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种固定化酶的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
A：将表达L-阿拉伯糖异构酶的毕赤酵母工程菌以2-5％v/v接种于种子培养基中，于30-40℃的条件下培养8-10h，得培养液；
再将培养液以2-5％v/v的接种量接种于发酵培养基中培养30-40h，得到发酵液；
B：将发酵液用盐酸溶液调节pH至5-7，然后加入占发酵液体积1.0-3.0％g/L的十六烷基三甲基溴化铵和占发酵液体积2.0-5.0％g/L的硫酸铵，升温至40-50℃，搅拌1-3h，加入占发酵液体积1-5％g/L的硅藻土，然后用板框进行压榨，收集滤液；
C：将滤液经超滤膜进行浓缩，得到浓缩酶液；
D：将浓缩粗酶液加入重力纯化柱中，用0.1-0.5mol/L含咪唑的磷酸盐缓冲液进行洗脱，收集洗脱液；
E：取活化的氨基树脂加入洗脱液中，在20-40℃温度的条件下搅拌吸附2-6h，用去离子水进行洗涤3次，抽滤，得固定化酶。
2.如权利要求1所述的一种固定化酶的制备方法，其特征在于：步骤A中表达L-阿拉伯糖异构酶的毕赤酵母工程菌的宿主菌为毕赤酵母GS115,分泌表达载体质粒为pGAPZB，目的基因的基因序列为SEQ ID No:1所示。
3.如权利要求1所述的一种固定化酶的制备方法，其特征在于，步骤A中发酵条件为：温度为34-40℃，风速1.0-2.0m3/h，转速200-300rpm，压力0.1-0.3Mpa，用氨水调节pH至7.0±0.1，溶氧为20-30％。
4.如权利要求1所述的一种固定化酶的制备方法，其特征在于：步骤B中的滤液以2-5BV/h的速率过阳离子交换树脂，再以1-3BV/h的速率过阴离子交换树脂，得到脱盐液，将脱盐液经超滤膜进行浓缩，得到步骤C中的浓缩酶液。
5.如权利要求1所述的一种固定化酶的制备方法，其特征在于：步骤C中超滤膜的孔径为5000-10000Da。
6.如权利要求1所述的一种固定化酶的制备方法，其特征在于：步骤C中的超滤清液用于十六烷基三甲基溴化铵和硫酸铵的配制。
7.如权利要求1所述的一种固定化酶的制备方法，其特征在于：步骤E中活化的氨基树脂为0.1-0.5mol/L的磷酸盐缓冲溶液与1.0-3.0％wt的戊二醛溶液混合，并用盐酸溶液调至pH至7-8，然后加入的氨基树脂，搅拌3-10h，过滤，得到一次滤饼，用去离子水进行浸泡、抽滤并重复进行三次以上制得，其中戊二醛溶液的加入量占磷酸盐缓冲溶液体积的2-5％v/v，氨基树脂的加入量与磷酸盐缓冲溶液和戊二醛溶液的混合溶液体积比为1.0-3.0g/100ml。
8.如权利要求1所述的一种固定化酶的制备方法，其特征在于：步骤E中活化的氨基树脂的加入量与洗脱液的体积比为1:90-110g/mL。
9.一种利用固定化酶制备D-塔格糖方法，其特征在于包括以下步骤：
F：向50-100g/L的D-半乳糖磷酸盐缓冲溶液中加入固定化酶，搅拌均匀，所述D-半乳糖磷酸盐缓冲溶液中磷酸盐缓冲液的浓度为50mmol/L、pH值为7；
G：转化反应体系pH 6.0-8.0，在60-80℃的条件下进行酶催化反应，得D-塔格糖。
10.如权利要求9所述的一种利用固定化酶制备D-塔格糖方法，其特征在于：步骤F中固定化酶的加入量与D-半乳糖溶液体积的比为2-5mg/ml。
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