CN117535243A - 人肝内胆管癌细胞系及其应用 - Google Patents

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CN117535243A CN202311513634.2A CN202311513634A CN117535243A CN 117535243 A CN117535243 A CN 117535243A CN 202311513634 A CN202311513634 A CN 202311513634A CN 117535243 A CN117535243 A CN 117535243A
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冯雁
张大东
许晓雅
李志宽
年宝宁
陈升
谢正华
熊磊
姜小清
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Abstract

本发明公开了人肝内胆管癌细胞系及其应用。所述人肝内胆管癌细胞系包括人肝内胆管癌细胞JXQ‑3D‑727；所述人肝内胆管癌细胞JXQ‑3D‑727于2023年4月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C2023107。能够大量扩增，且可长期在体外传代培养，对顺铂、吉西他滨等具有不同的敏感性，丰富了人肝内胆管癌细胞库，为揭示肝内胆管癌发生发展机制及相应药物开发的临床前研究提供新的试验材料。

Description

人肝内胆管癌细胞系及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及人肝内胆管癌细胞系及其应用。
背景技术
肝内胆管癌(intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC)是指左右肝管汇合部以上的胆管上皮细胞起源的恶性肿瘤。ICC的恶性程度高，但同时发病隐匿，早期缺少特异性症状，多数患者确诊时已处于晚期，治疗手段有限。晚期患者可手术率低，常规放化疗对ICC的疗效非常有限，在其他肿瘤中已显示明确疗效的靶向治疗和免疫治疗等手段在ICC中也鲜见成功。且ICC恶性程度高，预后普遍较差，5年生存率低于5％～10％。切除后肿瘤复发率仍令人失望。因此，迫切需要增强对胆管癌的机制及治疗方案的研究。
人类肿瘤细胞系是肿瘤生物学研究的重要工具。在合适的条件下，肿瘤细胞系可以反映其来源肿瘤组织的基因型和表型特征，可以用于对相应肿瘤的生物学特征、发生机制及药物治疗研究。现有的ICC模型研究较少，过去三十年来已报道的ICC细胞系大约有90余株。根据文献和ATCC数据库等资料，按照人群来源分类，已有报道的ICC细胞株包括：(1)日本：OZ、KMCH-1、HuH-28、HuCC-T、KMCH-2、ETK-1、KMCH-2TKKK、NCC0CC1-4、KKK-D049、KKK-D068、KKK-D131和KKK-D138；(2)泰国：HuCCA-1、KKU-213-A/B/C、HubCCA-1、KKU-100、KKU-055、KKU-OCA17、RCMCCA-1和KKU-023；(3)韩国：Choi-CK、Cho-CK-JCK、SCK和SNU-1079；(4)欧美：CC-LP-1、MT-CHC01和82.3；(5)中国：HKGZ-CC、ZJU-1125、ICC-1、ICC-2。此外，还有Dong等文章报导来源6例病人来源的多株细胞(PMID:29551704)。
总体而言，目前中国人来源的ICC模型细胞株仅来源于13例病患，较难充分涵盖这类疾病的特征。由于遗传背景的不同，为更好的研究中国人的肝内胆管癌疾病特征，需要建立更多的中国人特有的ICC模型细胞株。尽管这些细胞株都来源于肝内胆管癌组织，但是由于肿瘤异质性的存在，肝癌胆管癌患者缺少明显的共同基因突变特征。根据CCLE数据库已收录的细胞株结果分析，每一种ICC细胞株均具有独特的基因突变特征。而根据文献报道，这些细胞往往也具有不同的药物敏感性特征。因此，每一个新的ICC细胞系建立都可以丰富ICC肿瘤细胞研究库，提供更多的研究支持。
综上所述，挖掘新型人胆管癌细胞系是肝内胆管癌领域亟需解决的问题之一。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供人肝内胆管癌细胞系及其应用，旨在建立一种新型人胆管癌细胞系，生物遗传性状稳定，代数明确，对顺铂和吉西他滨敏感、对卡培他滨耐药，丰富人胆管癌细胞库，为揭示中国人群的原发性胆管癌发生、发展或转移机制以及抗胆管癌药物开发提供新的试验材料。
为达上述目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供人肝内胆管癌细胞系，所述人肝内胆管癌细胞系包括人肝内胆管癌细胞JXQ-3D-727；所述人肝内胆管癌细胞JXQ-3D-727于2023年4月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C2023107。
本发明中，挖掘制备新型人肝内胆管癌细胞系，其生物遗传性状稳定，代数明确，能够大量扩增，且可长期在体外传代培养，对顺铂、5-氟尿嘧啶、吉西他滨等具有不同的敏感性，为肝内胆管癌病因学、转移机制、耐药机制、药物筛选等用途提供新的实验模型。
优选地，所述人肝内胆管癌细胞系还包括人肝内胆管癌细胞JXQ-3D-727的子代细胞系。
第二方面，本发明提供第一方面所述的人肝内胆管癌细胞系在制备肝内胆管癌发病机制研究的细胞模型中的应用。
第三方面，本发明提供一种细胞模型，所述细胞模型含有第一方面所述的人肝内胆管癌细胞系。
第四方面，本发明提供第一方面所述的人肝内胆管癌细胞系在制备肝内胆管癌动物模型中的应用。
第五方面，本发明提供一种构建肝内胆管癌动物模型的方法，所述方法包括：
利用第一方面所述的人肝内胆管癌细胞系感染免疫缺陷动物，进行成瘤。
优选地，所述免疫缺陷动物包括免疫缺陷裸小鼠、免疫缺陷大鼠或人源化小鼠等。
第六方面，本发明提供第一方面所述的人肝内胆管癌细胞系在制备用于筛选治疗肝内胆管癌药物的模型中的应用。
第七方面，本发明提供第一方面所述的人肝内胆管癌细胞系在筛选预防或治疗肝内胆管癌的药物中的应用。
优选地，所述筛选包括基于候选药物使用前和使用后对所述人肝内胆管癌细胞系的影响，从而确定候选药物是否可以用于预防或治疗肝内胆管癌。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明建立的人肝内胆管癌细胞JXQ-3D-727，性状稳定，可稳定多次传代，经STR鉴定为新的单一细胞株，均有较强的增殖活性，能大量扩增和体外传代培养，具有克隆形成能力，且具有不同的药物敏感性，丰富肝内胆管癌特别是中国人群来源的肝内胆管癌细胞资源库，能够作为有效的体外研究细胞模型，为肝内胆管癌病因学、转移机制、耐药机制、药物筛选等用途提供新的实验模型。
附图说明
图1为人肝内胆管癌细胞JXQ-3D-727形态学观察图；
图2为人肝内胆管癌细胞JXQ-3D-727增殖曲线图；
图3A为人肝内胆管癌细胞JXQ-3D-727划痕0小时拍照图；
图3B为人肝内胆管癌细胞JXQ-3D-727划痕6小时拍照图；
图3C为人肝内胆管癌细胞JXQ-3D-727划痕24小时拍照图；
图4为人肝内胆管癌细胞JXQ-3D-727克隆形成拍照拍照图；
图5为人肝内胆管癌细胞JXQ-3D-727对顺铂药物敏感性测试结果图；
图6为人肝内胆管癌细胞JXQ-3D-727对5-FU药物敏感性测试结果图；
图7为人肝内胆管癌细胞JXQ-3D-727对吉西他滨药物敏感性测试结果图；
图8为人肝内胆管癌细胞JXQ-3D-727对卡培他滨药物敏感性测试结果图。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道购买获得的常规产品。
本发明具体实施例中，人肝内胆管癌细胞JXQ-3D-727于2023年4月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C2023107；地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号，武汉大学，邮编430072。
实施例1
本实施例建立新型肝内胆管癌细胞系。
细胞株来源于一名42岁中国汉族女性肝内胆管癌伴癌栓患者。通过手术获得新鲜组织，用预冷无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤来自患者的新鲜胆囊腺癌组织，去除多余的血液和结缔组织。然后将组织切成1mm3的组织块，并用预冷无菌PBS洗涤3次。将组织块置于10cm培养皿中，并在DMEM/F12完全生长培养基中孵育，该培养基由90％DMEM/F12(GibcoTM，C11330500BT)和10％胎牛血清(FBS)(Gibco；赛默飞世尔科技公司，美国)组成，并添加1％非必需氨基酸(GibcoTM，11140076)和1％青霉素(100U/mL)/链霉素(100μg/mL)(Gibco，15140-122；赛默飞世尔科技公司)。当细胞密度达到约30％时，除去上清液和组织块，并通过0.25％胰蛋白酶-EDTA(GibcoTM，25200072；赛默飞世尔科技公司)消化并转移到24孔板中继续培养6代，获得纯化肿瘤细胞。然后进行扩增培养，培养使用DMEM/F-12完全培养液。培养液中含10％胎牛血清(Gibco,12657-029)、100U/mL青霉素G(Gibco,15140-122)、100μg/mL链霉素(Gibco,15140-122)和1％非必须氨基酸(Gibco,11140050)。细胞培养于37℃、5％CO2培养箱中。
实施例2
本实施例分析细胞系的生物学特性及应用。
(1)细胞形态
在倒置显微镜下观察实施例1获得肿瘤细胞的形态，如图1所示，细胞贴壁生长，分散均匀，大小较一致，形态呈短梭形。
(2)STR鉴定
用胰酶消化细胞，用DNA抽提试剂盒提取细胞基因组DNA，采用20位点的STR扩增方案扩增，在ABI3730XL遗传分析仪上对STR位点和性别基因Amelogenin进行检测。检测的位点包括：D5S818、D13S317、D7S820、D16S539、VWA、TH01、AMEL、TPOX、CSF1PO、D12S391、FGA、D2S1338、D21S11、D18S51、D8S1179、D3S1358、D6S1043、PENTAE、D19S433和PENTAD。JXQ-3D-727细胞系STR分析结果如表1所示。
表1
注：Alle代表该检测位点所在的染色体，X即性染色体X，两个位点都是X代表女性来源。
在德国微生物菌种保藏中心DSMZ数据库(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen)和美国典型培养物保藏中心(ATCC)数据库，进行STR序列检索，未发现相同的STR检测结果。在数据库中未找到与该细胞匹配的位点，表明该细胞系为新细胞系；未发现多等位点，表明此细胞株为单一细胞，无其他细胞污染，将该细胞命名为人肝内胆管癌细胞JXQ-3D-727。
(3)细胞增殖
准备需要计数的细胞，采用0.1％胰酶消化细胞并制备细胞悬液，取20μL细胞悬液到1.5mL离心管中，加入20μL台盼蓝(Life,T10282)吹打混匀，吸取20μL混匀液缓慢地注入细胞计数板(Countstar,12000550)中，使用自动细胞计数仪(Countstar,IC 1000)进行活细胞计数，每个计数孔选取3个视野计数。
汇总第24、48、72小时细胞的计数结果，以测定的时间为横坐标，测出的活细胞值为纵坐标，将3天的测量值绘制增殖曲线(图2)。根据倍增时间计算公式：倍增时间＝Log2/曲线斜率，得到JXQ-3D-727细胞的群体倍增时间为19.7小时。
(4)细胞划痕
先用Marker笔在6孔细胞培养板背后(用直尺比着)均匀地画横线，大约每隔0.5～1cm一道，每孔穿过5条线。6孔细胞培养板中每孔加入2mL完全培养液，然后根据细胞计数的结果计算每孔加入约5×105个细胞所需的细胞悬液体积，接种到6孔板中，显微镜下观察细胞的接种密度，待细胞摇晃均匀后放入培养箱中过夜培养。第二天显微镜下观察细胞的密度，待细胞汇合度达到90％及以上时，用200μL的无菌枪头垂直着横线划痕，枪头要垂直，不要倾斜，力度保持一致中间不要停顿。弃去培养液，贴壁缓慢加入2mL PBS清洗细胞，弃去PBS，重复共清洗2次，以便去除划下的细胞，每孔加入2mL新鲜无血清培养液。
使用荧光倒置显微镜(Olympus,U-RFL-T)在4X物镜倍数下，选取3个划痕视野拍照保存，记录此时间点为0h(图3A)。在培养箱中继续培养细胞，分别于6h和24h，找到0h时间点所在的划痕视野拍照保存。
细胞划痕6h后，观察视野内有少量细胞发生迁移(图3B)；细胞划痕24h后，观察视野内有部分细胞发生迁移(图3C)，表明JXQ-3D-727细胞具有迁移能力。
(5)克隆形成
6孔细胞培养板中每孔加入2mL完全培养液，根据细胞计数的结果计算每孔分别加入500、1000、2000、3000、4000和5000个细胞所需的细胞悬液体积，接种到6孔板中摇晃混匀，显微镜下观察细胞是否均匀后放置于培养箱中培养。第二天观察细胞的贴壁状态，换液后继续培养10天(d)左右，根据细胞克隆的大小、分散情况、克隆之间有无连接到一起确定细胞克隆形成的最佳接种数量为2000个/孔。消化细胞后细胞计数，计算每孔加入2000个细胞所需的细胞悬液体积，接种到6孔板中，显微镜下观察是否晃均匀后放置于培养箱中培养。
第二天显微镜下观察细胞的贴壁状态，换液后继续培养10天(d)左右，终止培养；弃去6孔板中的培养液，每孔加入1mL PBS洗一次；弃去PBS，每孔加入500μL甲醇室温固定10min；弃去甲醇，每孔加入1mLPBS洗一次；弃去PBS，每孔加入500μL 0.1％结晶紫(Solarbio,C8470)溶液室温固定10min；弃去结晶紫溶液，每孔加入1mL ddH2O洗3次；弃去ddH2O，空气干燥。使用相机拍摄细胞培养孔的整体效果，使用荧光倒置显微镜计数细胞集落形成的数量。
JXQ-3D-727细胞的平板克隆形成实验，结果如图4，结果表明JXQ-3D-727细胞具有体外成瘤能力，满足肿瘤细胞特性。
(6)药物敏感性测试
12孔细胞培养板中每孔加入1mL完全培养液，然后根据细胞计数的结果计算每孔加入约5×104个细胞所需的细胞悬液体积，共需接种2块板24个孔。显微镜下观察细胞是否摇晃均匀后放入培养箱中过夜培养。
第二天显微镜下观察细胞的贴壁状态。该试验使用4种化合物顺铂、5-氟脲嘧啶(5-Fu)、卡培他滨和吉西他滨，每种化合物均设置6个终浓度梯度，每个浓度设置2个复孔，其中顺铂的浓度梯度为100μM、20μM、4μM、0.8μM、0.16μM和0μM(对照)；5-氟脲嘧啶的浓度梯度为400μM、80μM、16μM、3.2μM、0.64μM和0μM(对照；卡培他滨的浓度梯度为100μM、20μM、4μM、0.8μM、0.16μM和0μM(对照)；吉西他滨的浓度梯度为100μM、20μM、4μM、0.8μM、0.16μM和0μM(对照)。使用完全培养液将施用于细胞的2种化合物分别梯度稀释至上述的终浓度。
弃去培养液，每孔吸取1mL含有药物的完全培养液分别加入对应的孔位中并做好标记。将12孔板放入培养箱中继续培养72h，消化细胞计数测定细胞活力。
JXQ-3D-727细胞对顺铂和5-Fu两种化合物的IC50分别为1.064μM(图5)和3.026μM(图6)。细胞对于吉西他滨高度敏感性结果如图7所示，结果表明0.16μM的吉西他滨处理细胞后细胞平均存活率只有7.8％，IC50属于较低的范围，即相对敏感。对卡培他滨耐药性结果如图8所示，结果表明100μM的卡培他滨处理细胞后细胞平均存活率与未加药物处理的对照组一致，对卡培他滨敏感性低，即相对耐药。
由上述结果可知，本发明人胆管癌细胞JXQ-3D-727来源于一名42岁中国汉族女性肝内胆管癌伴癌栓患者，在增殖活性方面，人胆管癌细胞JXQ-3D-727倍增时间是19.7小时，细胞倍增时间较短具有较强的增殖活性，其次，本专利对药物的IC50值越低，代表细胞对药物更敏感，反之，IC50越高，代表细胞对药物敏感性越低，Genomics ofDrug Sensitivityin Cancer数据库对760株细胞系、859株细胞系和907株细胞系分别测试顺铂、吉西他滨和5-FU的敏感性特征，得到人类来源细胞株对顺铂的平均IC50＝25.4μM、对吉西他滨的平均IC50＝0.0956μM，对5-FU的平均IC50＝34.8μM，其中胆道癌细胞系ETK-1对顺铂的IC50＝33.5μM，胆管癌HUCCT1对顺铂的IC50＝107.5μM，对吉西他滨的IC50＝0.0228μM，对5-FU的IC50＝5.571μM；而本发明人胆管癌细胞JXQ-3D-727对5-FU的IC50＝3.026μM；对顺铂IC50＝1.064μM，对吉西他滨的IC50<0.16μM，对卡培他滨的IC50>100μM。表明本发明人胆管癌细胞JXQ-3D-727对比已知的细胞株对顺铂，5-FU和吉西他滨的IC50属于较低的范围，即相对敏感，而对卡培他滨敏感性低，即相对耐药。
综上所述，本发明建立了新型人肝内胆管癌细胞系JXQ-3D-727，该细胞系性状稳定，可稳定多次传代，经STR鉴定为新的单一细胞株，有较强的增殖活性，能大量扩增和体外传代培养，具有迁移和克隆形成能力，能够丰富肝内胆管癌特别是中国人种肝内胆管癌的细胞资源库，可以作为有效的体外研究细胞模型，为肝内胆管癌病因学、转移机制、耐药机制、药物筛选等用途提供新的实验模型。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.人肝内胆管癌细胞系，其特征在于，所述人肝内胆管癌细胞系包括人肝内胆管癌细胞JXQ-3D-727；所述人肝内胆管癌细胞JXQ-3D-727于2023年4月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C2023107。
2.根据权利要求1所述的人肝内胆管癌细胞系，其特征在于，所述人肝内胆管癌细胞系还包括人肝内胆管癌细胞JXQ-3D-727的子代细胞系。
3.权利要求1或2所述的人肝内胆管癌细胞系在制备肝内胆管癌发病机制研究的细胞模型中的应用。
4.一种细胞模型，其特征在于，所述细胞模型含有权利要求1或2所述的人肝内胆管癌细胞系。
5.权利要求1或2所述的人肝内胆管癌细胞系在制备肝内胆管癌动物模型中的应用。
6.一种构建肝内胆管癌动物模型的方法，其特征在于，所述方法包括：
利用权利要求1或2所述的人肝内胆管癌细胞系感染免疫缺陷动物，进行成瘤。
7.根据权利要求6所述的构建肝内胆管癌动物模型的方法，其特征在于，所述免疫缺陷动物包括免疫缺陷裸小鼠、免疫缺陷大鼠或人源化小鼠。
8.权利要求1或2所述的人肝内胆管癌细胞系在制备用于筛选治疗肝内胆管癌药物的模型中的应用。
9.权利要求1或2所述的人肝内胆管癌细胞系在筛选预防或治疗肝内胆管癌的药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述筛选包括基于候选药物使用前和使用后对所述人肝内胆管癌细胞系的影响，从而确定候选药物是否可以用于预防或治疗肝内胆管癌。
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