CN117511877A - 人胆囊癌细胞系及其应用 - Google Patents

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张大东
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谢正华
熊磊
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Shanghai 3D Medicines Co Ltd
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Abstract

本发明公开了人胆囊癌细胞系及其应用。所述人胆囊癌细胞系包括人胆囊癌细胞JXQ‑3D‑1404R1或人胆囊癌细胞JXQ‑3D‑1404R2；所述人胆囊癌细胞JXQ‑3D‑1404R1于2023年4月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C2023105；所述人胆囊癌细胞JXQ‑3D‑1404R2于2023年4月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C2023106。能够大量扩增，且可长期在体外传代培养，对顺铂、吉西他滨等具有不同的敏感性，丰富了人胆囊癌细胞库，为揭示胆囊癌发生发展机制及相应药物开发的临床前研究提供新的试验材料。

Description

人胆囊癌细胞系及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及人胆囊癌细胞系及其应用。
背景技术
胆囊癌(Gallbladder carcinoma，GBC)是胆囊恶性肿瘤中最常见的类型。GBC临床上较为少见。GBC的ICC的恶性程度高，总的5年生存率仅2％～5％，总体中位生存期仅3个月左右，80％的患者生存期不足1年。主要原因包括GBC发病隐匿，早期症状早期无特异性临床表现或只有慢性胆囊炎的症状，早期诊断很有困难，一旦出现上腹部持续性疼痛包块黄疸等病变已到晚期，晚期患者无法进行根治性手术。GBC对常规化疗药物不敏感，合并放疗改善效果有限，在其他肿瘤中已显示明确疗效的靶向治疗和免疫治疗等手段在GBC的效果还有待研究。因此，迫切需要增强对胆囊癌的机制研究及新的治疗方案的探索。
人类肿瘤细胞系是肿瘤生物学研究的重要工具。在合适的条件下，肿瘤细胞系可以呈现来源组织一致的基因性特征，并表现出相似的增殖、迁移、侵袭能力，是目前研究肿瘤的生物学特征、发生机制及药物治疗研究的最常用模型。现有的GBC细胞模型数量并不多，大约有60余株。根据文献和ATCC数据库等资料，按照人群来源分类，已有报道的GBC细胞株包括：(1)日本：FU-GBC-1/-2、G-415、GB-d1/-d2/-h3、GB-d2、GB-h3、KMG-A、KMG-C、NOZ、OCUG-1、PUC-GBC1、PUC-GBC2、TGBC14TKB、TGBC1TKB、TGBC24TKB、TGBC2TKB、TGBC41TKB、TGBC44TKB、TYGBK-1、TYGBK-8；(2)欧美：Mz-ChA-1、Mz-ChA-2、Mz-ChA-3、A-1604和GB-CL-1；(3)韩国：SNU-308；(4)智利：PTHrP-GBK；(5)中国：EH-GB1/-GB2、GBC-SD、JXQ-3D-1279R1/R2/R3/R4/R5/R6/R7/R8/R9、JXQ-3D-1405R1/R2/R3/R4、JXQ-3D-1436R1/R2/R3/R4/R5/R6、JXQ-3D-4160R1/R2/R3、JXQ-3D-4256R1/R2/R3、JXQ-3D-668R1/R2/R3/R4、JXQ-3D-902R1/R2/R3/R4/R5/R6/R7/R8/R9、SGC-996和TJ-GBC2。中国人来源的GBC细胞株约有40余株，但是仅来源于11例病患。一般来说，相同患者来源的细胞株往往具有相似的基因背景与生物学特征。因此，上述细胞株仅代表了极少数的中国胆囊癌患者的特征。由于遗传背景的不同，其他人种来源的细胞株并不能很好的反映中国人种胆囊癌的基因特征及生物学特征，因此需要建立更多不同患者来源的GBC模型细胞。
此外，由于肿瘤异质性的存在，明显的共同基因突变特征。根据CCLE数据库和Cellosaurus数据库数据库已收录的细胞株信息来看，GBC细胞株之间携带的致病突变不一，细胞生长速度等也有明显的差异，在药物敏感性特征方面也有不同。因此，建立新的GBC细胞系，可有利于丰富GBC肿瘤细胞库，为GBC机制研究和药物靶点开发提供更多的研究材料。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供人胆囊癌细胞系及其应用，为揭示中国人群的胆囊癌发生发展机制及相应药物开发的临床前研究提供新的试验材料。
为达上述目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供人胆囊癌细胞系，所述人胆囊癌细胞系包括人胆囊癌细胞JXQ-3D-1404R1或人胆囊癌细胞JXQ-3D-1404R2；所述人胆囊癌细胞JXQ-3D-1404R1于2023年4月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C2023105；所述人胆囊癌细胞JXQ-3D-1404R2于2023年4月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C2023106。
本发明中，挖掘制备两例新型人胆囊癌细胞系，其生物遗传性状稳定，代数明确，能够大量扩增，且可长期在体外传代培养，对顺铂、5-氟尿嘧啶、吉西他滨等具有不同的敏感性，为胆囊癌病因学、转移机制、耐药机制、药物筛选等用途提供新的实验模型。
优选地，所述人胆囊癌细胞系还包括人胆囊癌细胞JXQ-3D-1404R1的子代细胞系或人胆囊癌细胞JXQ-3D-1404R2的子代细胞系。
第二方面，本发明提供第一方面所述的人胆囊癌细胞系在制备胆囊癌发病机制研究的细胞模型中的应用。
第三方面，本发明提供一种细胞模型，所述细胞模型含有第一方面所述的人胆囊癌细胞系。
第四方面，本发明提供第一方面所述的人胆囊癌细胞系在制备胆囊癌动物模型中的应用。
第五方面，本发明提供一种构建胆囊癌动物模型的方法，所述方法包括：
利用第一方面所述的人胆囊癌细胞系感染免疫缺陷动物，进行成瘤。
优选地，所述免疫缺陷动物包括免疫缺陷裸小鼠、免疫缺陷大鼠或人源化小鼠等。
第六方面，本发明提供第一方面所述的人胆囊癌细胞系在制备筛选治疗胆囊癌药物的模型中的应用。
第七方面，本发明提供第一方面所述的人胆囊癌细胞系在筛选预防或治疗胆囊癌的药物中的应用。
优选地，所述筛选包括基于候选药物使用前和使用后对所述人胆囊癌细胞系的影响，从而确定候选药物是否可以用于预防或治疗胆囊癌。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明建立的两种人胆囊癌细胞JXQ-3D-1404R1和JXQ-3D-1404R2性状稳定，可稳定多次传代，经STR鉴定为新的单一细胞株，均有较强的增殖活性，能大量扩增和体外传代培养，具有克隆形成能力，且具有不同的药物敏感性，丰富胆囊癌特别是中国人群来源的胆囊癌细胞资源库，能够作为有效的体外研究细胞模型，为胆囊癌病因学、转移机制、耐药机制、药物筛选等用途提供新的实验模型。
附图说明
图1为JXQ-3D-1404R1细胞形态学观察图；
图2为JXQ-3D-1404R2细胞形态学观察图；
图3为JXQ-3D-1404R1细胞增殖曲线图；
图4为JXQ-3D-1404R2细胞增殖曲线图；
图5A为JXQ-3D-1404R1细胞划痕24小时结果图；
图5B为JXQ-3D-1404R1细胞划痕48小时结果图；
图6A为JXQ-3D-1404R2细胞划痕24小时结果图；
图6B为JXQ-3D-1404R2细胞划痕48小时结果图；
图7为JXQ-3D-1404R1细胞克隆形成结果图；
图8为JXQ-3D-1404R2细胞克隆形成结果图；
图9为JXQ-3D-1404R1细胞顺铂药物敏感性测试结果图；
图10为XQ-3D-1404R2细胞顺铂药物敏感性测试结果图；
图11为JXQ-3D-1404R1细胞5-FU药物敏感性测试结果图；
图12为JXQ-3D-1404R2细胞5-FU药物敏感性测试结果图；
图13为JXQ-3D-1404R1细胞吉西他滨药物敏感性测试结果图；
图14为JXQ-3D-1404R2细胞吉西他滨药物敏感性测试结果图。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道购买获得的常规产品。
本发明具体实施例中，人胆囊癌细胞JXQ-3D-1404R1于2023年4月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C2023105；地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号，武汉大学，邮编430072。
人胆囊癌细胞JXQ-3D-1404R2于2023年4月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C2023106；地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号，武汉大学，邮编430072。
实施例1
本实施例建立人胆囊癌细胞系。
两株细胞株均来源于一名79岁中国汉族女性胆囊腺癌患者。通过手术获得新鲜组织，用预冷无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤来自患者的新鲜胆囊癌组织，去除多余的血液和结缔组织。然后将组织切成1mm3的组织块，并用预冷无菌PBS洗涤3次。将组织块置于10cm2培养皿中，并在DMEM/F12完全生长培养基中孵育，该培养基由90％DMEM/F12(GibcoTM，C11330500BT)和10％胎牛血清(FBS)(Gibco；赛默飞世尔科技公司，美国)，并含有1％非必需氨基酸(GibcoTM，11140076)和1％青霉素(100U/mL)/链霉素(100μg/mL)(Gibco，15140-122；赛默飞世尔科技公司)。当细胞密度达到约30％时，除去上清液和组织块，并通过0.25％胰蛋白酶-EDTA(GibcoTM，25200072；赛默飞世尔科技公司)消化并转移到24孔板中继续培养5-6代，获得纯化肿瘤细胞，命名为人胆囊癌细胞JXQ-3D-1404R1和人胆囊癌细胞JXQ-3D-1404R2，然后进行扩增培养，培养使用DMEM/F-12完全培养液。培养液中含10％胎牛血清(Gibco,12657-029)、100U/mL青霉素G(Gibco,15140-122)、100μg/mL链霉素(Gibco,15140-122)和1％非必须氨基酸(Gibco,11140050)。细胞培养于37℃、5％CO2培养箱中。
实施例2
本实施例分析细胞系的生物学特性及应用测试。
(1)细胞形态
在倒置显微镜下观察人胆囊癌细胞JXQ-3D-1404R1和人胆囊癌细胞JXQ-3D-1404R2细胞的形态，两株细胞均贴壁生长，分散均匀，大小较一致，形态呈多边形(图1，图2)，表明两种细胞经多次传代后细胞形态稳定，具备传代稳定性。
(2)STR鉴定：
用胰酶消化细胞，用DNA抽提试剂盒提取细胞基因组DNA，采用20位点的STR扩增方案扩增，在ABI3730XL遗传分析仪上对STR位点和性别基因Amelogenin进行检测。检测的位点包括：D5S818、D13S317、D7S820、D16S539、VWA、TH01、AMEL、TPOX、CSF1PO、D12S391、FGA、D2S1338、D21S11、D18S51、D8S1179、D3S1358、D6S1043、PENTAE、D19S433和PENTAD。人胆囊癌细胞JXQ-3D-1404R1和人胆囊癌细胞JXQ-3D-1404R2的STR分析结果如表1所示。
表1
注：Alle(1/2)代表该检测位点所在的染色体。X即性染色体X，两个位点都是X代表女性来源。
在德国微生物菌种保藏中心DSMZ数据库(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen)和美国典型培养物保藏中心(ATCC)数据库，进行STR序列检索，未发现相同的STR检测结果。在数据库中未找到与上述两株细胞匹配的位点，表明上述两株细胞系为新细胞系；未发现多等位点，表明上述两株细胞系为单一细胞，无其他细胞污染。
(3)细胞增殖
准备需要计数的细胞，采用0.1％胰酶消化细胞并制备细胞悬液，取20μL细胞悬液到1.5mL离心管中，加入20μL台盼蓝(Life,T10282)吹打混匀，吸取20μL混匀液缓慢地注入细胞计数板(Countstar,12000550)中，使用自动细胞计数仪(Countstar,IC 1000)进行活细胞计数，每个计数孔选取3个视野计数。
汇总第24、48、72小时细胞的计数结果，以测定的时间为横坐标，测出的活细胞值为纵坐标，将3天的测量值绘制增殖曲线。根据倍增时间计算公式：倍增时间＝Log2/曲线斜率，得到JXQ-3D-1404R1细胞的群体倍增时间为19.54小时(图3)；JXQ-3D-1404R2细胞的群体倍增时间为17.5小时(图4)。
(4)细胞划痕
先用Marker笔在6孔细胞培养板背后(用直尺比着)均匀地画横线，大约每隔0.5～1cm一道，每孔穿过5条线。6孔细胞培养板中每孔加入2mL完全培养液，然后根据细胞计数的结果计算每孔加入约5×105个细胞所需的细胞悬液体积，接种到6孔板中，显微镜下观察细胞的接种密度，待细胞摇晃均匀后放入培养箱中过夜培养。第二天显微镜下观察细胞的密度，待细胞汇合度达到90％及以上时，用200μL的无菌枪头垂直着横线划痕，枪头要垂直，不要倾斜，力度保持一致中间不要停顿。弃去培养液，贴壁缓慢加入2mL PBS清洗细胞，弃去PBS，重复共清洗2次，以便去除划下的细胞，每孔加入2mL新鲜无血清培养液。
使用荧光倒置显微镜(Olympus,U-RFL-T)在4×物镜倍数下，选取3个划痕视野拍照保存，记录此时间点为0h。在培养箱中继续培养细胞，分别于24h和48h，找到0h时间点所在的划痕视野拍照保存。
JXQ-3D-1404R1细胞划痕24h后，观察视野内有极少量细胞发生迁移(图5A)；48h后，划痕变窄(图5B)。
JXQ-3D-1404R2细胞划痕24h后，观察视野内有极少量细胞发生迁移(图6A)；48h后，划痕变窄(图6B)。
上述结果表明JXQ-3D-1404R1和JXQ-3D-1404R2细胞具有一定的爬行能力。
(5)克隆形成
6孔细胞培养板中每孔加入2mL完全培养液，根据细胞计数的结果计算每孔分别加入500、1000、2000、3000、4000和5000个细胞所需的细胞悬液体积，接种到6孔板中摇晃混匀，显微镜下观察细胞是否均匀后放置于培养箱中培养。第二天观察细胞的贴壁状态，换液后继续培养10天(d)左右，根据细胞克隆的大小、分散情况、克隆之间有无连接到一起确定细胞克隆形成的最佳接种数量为2000个/孔。消化细胞后细胞计数，计算每孔加入2000个细胞所需的细胞悬液体积，接种到6孔板中，显微镜下观察是否晃均匀后放置于培养箱中培养。
第二天显微镜下观察细胞的贴壁状态，换液后继续培养10d左右，终止培养；弃去6孔板中的培养液，每孔加入1mL PBS洗一次；弃去PBS，每孔加入500μL甲醇25℃固定10min；弃去甲醇，每孔加入1mLPBS洗一次；弃去PBS，每孔加入500μL 0.1％结晶紫(Solarbio,C8470)溶液25℃固定10min；弃去结晶紫溶液，每孔加入1mL ddH2O洗3次；弃去ddH2O，空气干燥。使用相机拍摄细胞培养孔的整体效果，使用荧光倒置显微镜计数细胞集落形成的数量。
JXQ-3D-1404R1细胞的平板克隆形成实验，结果如图7所示，结果表明JXQ-3D-1404R1细胞具有体外成瘤能力。JXQ-3D-1404R2细胞的平板克隆形成实验，结果如图8所示，结果表明JXQ-3D-1404R2细胞具有体外成瘤能力，满足肿瘤细胞特性。
(6)药物敏感性测试
12孔细胞培养板中每孔加入1mL完全培养液，然后根据细胞计数的结果计算每孔加入约5×104个细胞所需的细胞悬液体积，共需接种2块板24个孔。显微镜下观察细胞是否摇晃均匀后放入培养箱中过夜培养。
第二天显微镜下观察细胞的贴壁状态。该试验使用4种化合物顺铂、5-氟脲嘧啶(5-Fu)和吉西他滨，每种化合物均设置6个终浓度梯度，每个浓度设置2个复孔，其中顺铂的浓度梯度为100μM、20μM、4μM、0.8μM、0.16μM和0μM(对照)；5-氟脲嘧啶的浓度梯度为400μM、80μM、16μM、3.2μM、0.64μM和0μM(对照)；吉西他滨的浓度梯度为100μM、20μM、4μM、0.8μM、0.16μM和0μM(对照)。使用完全培养液将施用于细胞的2种化合物分别梯度稀释至上述的终浓度。
弃去培养液，每孔吸取1mL含有药物的完全培养液分别加入对应的孔位中并做好标记。将12孔板放入培养箱中继续培养72h，消化细胞计数测定细胞活力。
JXQ-3D-1404R1细胞对顺铂的IC50为60.6μM(图9)，JXQ-3D-1404R2细胞IC50为141.4μM(图10)。JXQ-3D-1404R1细胞对5-Fu的IC50为148.4μM(图11)，JXQ-3D-1404R2细胞IC50为69.3μM(图12)。
JXQ-3D-1404R1细胞对吉西他滨的IC50为194.5μM(图13)，耐药系数高，无需后天筛选更适合作为胆囊癌耐药机制研究的细胞模型；JXQ-3D-1404R2细胞IC50为0.7468μM(图14)，对吉西他滨敏感；本发明两株细胞对吉西他滨敏感性不同，可根据需要单独选择研究，也可合并进行敏感性机制研究。此外，JXQ-3D-1404R1细胞对吉西他滨耐药倍增时间是19.54h，细胞倍增时间较短具有较强的增殖活性，且细胞株还对其他化疗药物如5-FU和顺铂具有不同的敏感性，对细胞株爬行能力和克隆形成能力进行评估可以作为有效的体外研究细胞模型，为胆囊癌病因学、转移机制、耐药机制、药物筛选等用途提供新的实验模型。
综上所述，本发明提供了两种人胆囊癌细胞JXQ-3D-1404R1、JXD-3D-1404R2及其应用，人胆囊癌细胞系能够大量扩增，且可长期在体外传代培养，对顺铂、5-氟尿嘧啶、吉西他滨具有不同的敏感性，丰富了人胆囊癌细胞库，为揭示中国人群的胆囊癌发生发展机制及相应药物开发的临床前研究提供新的试验材料。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.人胆囊癌细胞系，其特征在于，所述人胆囊癌细胞系包括人胆囊癌细胞JXQ-3D-1404R1或人胆囊癌细胞JXQ-3D-1404R2；
所述人胆囊癌细胞JXQ-3D-1404R1于2023年4月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C2023105；
所述人胆囊癌细胞JXQ-3D-1404R2于2023年4月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C2023106。
2.根据权利要求1所述的人胆囊癌细胞系，其特征在于，所述人胆囊癌细胞系还包括人胆囊癌细胞JXQ-3D-1404R1的子代细胞系或人胆囊癌细胞JXQ-3D-1404R2的子代细胞系。
3.权利要求1或2所述的人胆囊癌细胞系在制备胆囊癌发病机制研究的细胞模型中的应用。
4.一种细胞模型，其特征在于，所述细胞模型含有权利要求1或2所述的人胆囊癌细胞系。
5.权利要求1或2所述的人胆囊癌细胞系在制备胆囊癌动物模型中的应用。
6.一种构建胆囊癌动物模型的方法，其特征在于，所述方法包括：
利用权利要求1或2所述的人胆囊癌细胞系感染免疫缺陷动物，进行成瘤。
7.根据权利要求6所述的构建胆囊癌动物模型的方法，其特征在于，所述免疫缺陷动物包括免疫缺陷裸小鼠、免疫缺陷大鼠或人源化小鼠。
8.权利要求1或2所述的人胆囊癌细胞系在制备筛选治疗胆囊癌药物的模型中的应用。
9.权利要求1或2所述的人胆囊癌细胞系在筛选预防或治疗胆囊癌的药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述筛选包括基于候选药物使用前和使用后对所述人胆囊癌细胞系的影响，从而确定候选药物是否可以用于预防或治疗胆囊癌。
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