CN117535183A - 一株防御假单胞菌及其在防治甜瓜细菌性果斑病中的应用 - Google Patents

一株防御假单胞菌及其在防治甜瓜细菌性果斑病中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株防御假单胞菌及其在防治甜瓜细菌性果斑病中的应用。本发明涉及微生物农药技术领域，具体涉及一株防御假单胞菌及其在防治甜瓜细菌性果斑病中的应用。本发明的防御假单胞菌为防御假单胞菌(Pseudomonas protegens)ZF509，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.27638。通过形态学观察、生理生化特性测定及多基因系统发育树构建分析该菌株ZF509进行鉴定，证实其具有广谱抑菌性和对甜瓜离体叶片和活体盆栽的防治效果，为开发可应用于甜瓜细菌性果斑病的生防菌剂提供了菌株资源，在瓜类细菌性果斑病生物防治上有应用潜力。

Description

一株防御假单胞菌及其在防治甜瓜细菌性果斑病中的应用
技术领域
本发明涉及微生物农药技术领域，具体涉及一株防御假单胞菌及其在防治甜瓜细菌性果斑病中的应用。
背景技术
果斑病是甜瓜生产中的常见病害，主要侵染甜瓜叶片和果实，发病后传播迅速，对全球范围造成重大经济损失。甜瓜细菌性果斑病的致病菌为西瓜噬酸菌(Acidovoraxcitrulli)，可侵染多种葫芦科作物。针对瓜类细菌性果斑病的防治，目前缺少商业化抗病品种，该病害的防治手段主要依靠种子消毒和检疫措施。
生物防治是近年来研发的热门领域，生防菌剂作为一种对环境低毒，防治靶标特异性的生物防治技术，近年来广泛应用于作物病害的研究应用。针对瓜类细菌性果斑病生防菌株开发，已有关于芽孢菌株的多篇报道，说明生防菌株应用于瓜类细菌性果斑病的防治具有一定的研究空间和开发潜力。防御假单胞菌株作为一类高效生防细菌，可分泌多种抗菌活性物质，在作物病害的防治研究中已体现出应用价值，对于甜瓜细菌性果斑病的防治，防御假单胞菌表现出一定的开发潜力。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何提高植物抗病能力、抑制或防治植物的侵染性病害。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了一株防御假单胞菌。
本发明提供的防御假单胞菌为防御假单胞菌(Pseudomonas protegens)CGMCCNo.27638，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCCNo.27638。
本发明还提供了一种菌剂，所述菌剂含有上述防御假单胞菌和/或所述防御假单胞菌的代谢物。
上述菌剂可为病原菌抑制剂或病害抑制剂，所述病原菌可为病原真菌或病原细菌。
上文所述病原真菌为立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、西瓜壳二孢(Ascochytacitrullina)、匍柄霉菌(Stemphylium solani)、尖孢刺盘孢(Colletotrichum acutatum)、多主棒孢菌(Corynespora cassiicola)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、茄链格孢(Alternaria solani Sorauer)。
上文所述病原细菌为西瓜噬酸菌(Acidovorax citrulli)、野油菜黄单胞野油菜致病变种(Xanthomonas campestris pv.campestris)、密执安棒杆菌密执安亚种(Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis)、胡萝卜软腐果胶杆菌(Pectobacterium carotovorum)。
上文所述病害为甜瓜果斑病。
本发明还提供了前文所述菌剂的制备方法，包括如下步骤：将前文所述的防御假单胞菌作为活性成分，得到所述菌剂。
上述菌剂的活性成分可为上述防御假单胞菌和/或上述防御假单胞菌的代谢物，上述菌剂的活性成分还可含有其他生物成分或非生物成分，上述菌剂的其他活性成分本领域技术人员可根据对病害的抑制效果确定。
上述菌剂中，除所述活性成分外，还含有载体。所述载体可为农药或肥料领域常用的且在生物学上是惰性的载体。所述载体可为固体载体或液体载体；所述固体载体可为矿物材料、植物材料或高分子化合物；所述矿物材料可为粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一种；所述植物材料可为玉米粉、豆粉和淀粉中的至少一种；所述高分子化合物可为聚乙烯醇和/或聚二醇；所述液体载体可为有机溶剂、植物油、矿物油或水；所述有机溶剂可为癸烷和/或十二烷。
上述菌剂可为多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。
根据需要，上述菌剂中还可添加表面活性剂(如吐温20、吐温80等)、粘合剂、稳定剂(如抗氧化剂)、pH调节剂等。
上文中，所述代谢物可从所述防御假单胞菌的发酵液中获得。所述代谢物可为所述防御假单胞菌的无菌代谢物或所述防御假单胞菌的含菌代谢物。所述防御假单胞菌的无菌代谢物(无菌发酵滤液)具体可按照如下方法制备，在液体培养基中培养所述防御假单胞菌，过滤除去液体培养物(发酵液)中的所述防御假单胞菌即得到所述防御假单胞菌的无菌代谢物。所述防御假单胞菌的含菌代谢物具体可按照如下方法制备，在液体发酵培养基中培养所述防御假单胞菌，收集发酵液，该发酵液即为所述防御假单胞菌的含菌代谢物。
本发明还提供了一种生物有机肥，所述生物有机肥含有前文所述防御假单胞菌或所述防御假单胞菌的代谢物的菌剂。
本发明还提供了前文所述的防御假单胞菌在制备下述任一的产品中的应用：
1)用于防治植物病害的菌剂，所述病害为甜瓜果斑病；
2)病原菌抑制剂，所述病原菌为病原真菌或病原细菌。
上述菌剂可为病原菌抑制剂或病害抑制剂，所述病原菌可为病原真菌或病原细菌。
上述应用中，所述病原真菌为立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、西瓜壳二孢(Ascochyta citrullina)、匍柄霉菌(Stemphyliumsolani)、尖孢刺盘孢(Colletotrichumacutatum)、多主棒孢菌(Corynespora cassiicola)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、茄链格孢(Alternaria solani Sorauer)。
上述应用中，所述病原细菌为西瓜噬酸菌(Acidovorax citrulli)、野油菜黄单胞野油菜致病变种(Xanthomonas campestris pv.campestris)、密执安棒杆菌密执安亚种(Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis)、胡萝卜软腐果胶杆菌(Pectobacteriumcarotovorum)。
本发明还提供了培养前文所述防御假单胞菌的方法，包括将所述防御假单胞菌在用于培养防御假单胞菌的培养基中培养的步骤。
本发明还提供了前文所述防御假单胞菌或所述的菌剂在栽培甜瓜中的应用。
本发明还提供了栽培甜瓜的方法，包括
1)向甜瓜叶片喷施前文所述防御假单胞菌或所述的菌剂；
2)向栽培甜瓜幼苗喷施前文所述防御假单胞菌或所述的菌剂。
本发明还提供了前文所述的防御假单胞菌在防治甜瓜果斑病和/或提高甜瓜产量中的应用。
本文中，所述防治甜瓜果斑病具体可为防治甜瓜离体叶片果斑病或/和盆栽甜瓜果斑病。
本研究从黑龙江哈尔滨马铃薯根际土壤中分离得到一株防御假单胞菌ZF509，通过形态学观察、生理生化特性测定及多基因系统发育树构建分析对该菌株进行鉴定，同时测定了该菌株的抑菌谱，证实其具有广谱抑菌性，评价了该菌株发酵液对西甜瓜离体叶片和活体盆栽的防治效果，为开发可应用于甜瓜细菌性果斑病的生防菌剂提供了菌株资源，在瓜类细菌性果斑病生物防治上有应用潜力，其实际应用还需进行大田验证。
附图说明
图1为菌株ZF509对甜瓜细菌性果斑病菌的抑制作用。其中A.ZF509菌株在带菌平板上，中间为菌株ZF509(标尺：10mm)。B.ZF509菌株在未接种甜瓜细菌性果斑病菌液的平板上(标尺：10mm)。
图2为菌株ZF509的菌落形态和超微结构观察。其中A-B.菌株ZF509在KB培养基上培养2天、5天。(标尺：10mm)。C.革兰氏染色观察。D-F.扫描电镜观察(标尺分别为10、2.0和1.0μm)。
图3为基于多基因构建的ZF509菌株系统发育树。
图4为菌株ZF509 48h耐药性。其中A.菌株ZF509对卡那霉素48h耐药性测试结果；B.菌株ZF509对硫酸庆大霉素48h耐药性测试结果；C.菌株ZF509对氯霉素48h耐药性测试结果；D.菌株ZF509对氨苄青霉素48h耐药性测试结果；E.菌株ZF509对四环素48h耐药性测试结果；F.菌株ZF509对盐酸壮观霉素48h耐药性测试结果；G.菌株ZF509对利福平48h耐药性测试结果；H.菌株ZF509对链霉素48h耐药性测试结果；I.菌株ZF509对红霉素48h耐药性测试结果。
图5为菌株ZF509酶活特性、生物膜和氢氰酸合成能力测定。其中A.菌株ZF509蛋白酶合成测定(标尺：10mm)；B.菌株ZF509磷酸酯酶合成测定(标尺：10mm)；C.菌株ZF509纤维素酶合成测定(标尺：10mm)；D.菌株ZF509嗜铁素合成测定(标尺：10mm)；E.菌株ZF509生物膜合成测定；F.菌株ZF509 HCN合成测定。
图6为菌株ZF509抑菌物质电泳图。
图7为菌株ZF509生长曲线示意图。
图8为ZF509菌株对4种病原细菌生长的抑制作用。其中A.野油菜黄单胞野油菜致病变种(Xanthomonas campestris pv.campestris)；B.密执安棒杆菌密执安亚种(Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis)；C.胡萝卜软腐果胶杆菌(Pectobacteriumcarotovorum)；D.西瓜噬酸菌(Acidovorax citrulli)。(标尺：10mm)。
图9为ZF509菌株挥发性物质对7种病原真菌的抑制作用。其中A.立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)；B.西瓜壳二孢(Ascochyta citrullina)；C.尖孢刺盘孢(Colletotrichumacutatum)；D.多主棒孢菌(Corynespora cassiicola)；E.尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)；F.匍柄霉菌(Stemphylium solani)；G.茄链格孢(Alternariasolani Sorauer)。(标尺：10mm)。
图10为ZF509对甜瓜果斑病离体叶片的防治效果。其中A.瓜类细菌性果斑病病发病情况；B.菌株ZF509；C.化学药剂噻霉酮。
图11为ZF509对甜瓜果斑病活体盆栽的预防效果。其中A-D.接种三天后育苗情况；E-H.接种五天后育苗情况；A、E.健康对照；B、F.瓜类细菌性果斑病病发病情况；C、G.菌株ZF509；D、H.化学药剂噻霉酮。
图12为ZF509对甜瓜果斑病活体盆栽的治疗效果。其中A-D.接种三天后育苗情况；E-H.接种五天后育苗情况；A,E.健康对照；B,F.瓜类细菌性果斑病病发病情况；C,G.菌株ZF509；D,H.化学药剂噻霉酮。
图13为ZF509对西瓜果斑病活体盆栽的治疗效果。其中A-D.接种三天后育苗情况；E-H.接种五天后育苗情况；A,E.健康对照；B,F.瓜类细菌性果斑病病发病情况；C,G.菌株ZF509；D,H.化学药剂噻霉酮。
保藏说明
菌种名称：防御假单胞菌
拉丁名：Pseudomonas protegens
菌株编号：ZF509
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2023年6月15日
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.27638。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例中的定量实验，如无特别说明，均设置三次重复实验。
下述实施例中甜瓜(Cucumis melo L.)羊角蜜(品种登记编号：GPD甜瓜(2017)110042)，公众可以从中蔬种业科技(北京)有限公司获得。
下述实施例中的供试致病菌株(4种病原细菌)均由中国农业科学院蔬菜花卉研究所菜病综防组保存。4种病原细菌包括：西瓜噬酸菌(Acidovorax citrulli)、野油菜黄单胞野油菜致病变种(Xanthomonas campestris pv.campestris)、密执安棒杆菌密执安亚种(Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis)、胡萝卜软腐果胶杆菌(Pectobacterium carotovorum)。7种病原真菌包括：立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、西瓜壳二孢(Ascochyta citrullina)、匍柄霉菌(Stemphylium solani)、尖孢刺盘孢(Colletotrichum acutatum)、多主棒孢菌(Corynespora cassiicola)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)和茄链格孢(Alternaria solani Sorauer)。
下述实施例中的巴西果胶杆菌(Pectobacterium brasiliense)已记载于：赵子璇,曾先锋,覃诗扬等.贝莱斯芽孢杆菌ZF438菌株的鉴定及其发酵上清液对辣椒炭疽病的抑菌作用[J].农业生物技术学报,2023,31(10):2163-2175.公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的西瓜噬酸菌(Acidovorax citrulli)、匍柄霉菌(Stemphyliumsolani)已记载于：黄艺烁，谢学文，石延霞等多粘类芽孢杆菌ZF197对白菜茎基腐病防治效果[J].园艺学报,2020,47(06):1059-1071.DOI:10.16420/j.iss n.0513-353x.2019-0915.公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的野油菜黄单胞野油菜致病变种(Xanthomonas campestrispv.campestris)、密执安棒杆菌番茄溃疡致病型(Clavibacter michiganensissubsp.michiganensis)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、尖孢刺盘孢(Colletotrichumacutatum)、多主棒孢菌(Corynespora cassiicola)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、茄链格孢(Alternaria solani Sorauer)已记载于：赵昱榕,李磊,谢学文等.贝莱斯芽孢杆菌ZF2对多主棒孢病菌防治效果[J].中国生物防治学报,2019,35(02):217-225.DOI:10.16409/j.cnki.2095-039x.2019.02.018.公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的西瓜壳二孢菌(Ascochyta citrullina)已记载于：赵彦杰,李宝聚,石延霞等.瓜类蔓枯病的发生与防治[J].中国蔬菜,2008(02):56-57+70.DOI:10.19928/j.cnki.1000-6346.2008.02.023.公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的Pseudomonas protegens pf5由俄勒冈州立大学植物与植物病理学系提供，已记载于：Henkels MD,Kidarsa TA,Shaffer BT,et al.Pseudomonasprotegens Pf-5causes discoloration and pitting of mushroom caps due to theproduction of antifungal metabolites.Molecular Plant-microbe Interactions:MPMI.2014Jul；27(7):733-746.DOI:10.1094/mpmi-10-13-0311-r.PMID:24742073.公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的KB(King’s B，金氏B)液体培养基配制方法如下：蛋白胨(Peptone)20.0g，K2HPO4 1.5g，MgSO4·7H2O 1.5g，甘油(Glycerine)10mL，蒸馏水1000mL；KB固体培养基：在KB液体培养基中加入琼脂13g。
NB(Nutrient Broth，营养肉汤)液体培养基配制方法如下：蛋白胨(Peptone)10g，牛肉粉(Beef extract)3g，NaCl 5g，琼脂20g，蒸馏水1000mL；NA(Nutrient Agar)固体培养基：在NB液体培养基中加入琼脂13g。
WA(Water Agar,水琼脂)培养基配制方法如下：琼脂4.5g、蒸馏水1000mL，分装于5mL玻璃试管。
PDA(Potato dextrose agar,马铃薯葡萄糖琼脂)培养基配制方法如下：马铃薯200.0g，葡萄糖(Glucose)20.0g，琼脂13.0g，蒸馏水1000mL。
蛋白酶选择性培养基配制方法如下：胰蛋白胨(Tryptone)5g，酵母提取物(YeastExtract)3g，葡萄糖(Glucose)1g，琼脂15g，蒸馏水定容至1000mL。菌后加入100mL脱脂牛奶。
无机磷(PVK)固体培养基配制方法如下：酵母提取物(Yeast Extract)0.5g，葡萄糖(Glucose)10g，Ca3(PO4)2 5g，(NH4)2SO4 0.5g，KCl 0.2g，MgCl2 0.1g(北京百灵威，GBW(E)084284)，MnSO4 0.1mg，FeSO4 0.1mg，琼脂15g，蒸馏水定容至1000mL。
纤维素酶检测用培养基配制方法如下：MgSO4·7H2O 0.25g，K2HPO4 0.50g，羧甲基纤维素Carboxymethylcellulose sodium CMC 1.88g(索莱宝，C8621)，刚果红，琼脂15.0g(上海源叶，B67416)，蒸馏水定容至1000mL。
嗜铁素检测用培养基配制方法如下：铬天青S指示剂0.02％121mg(阿拉丁，C299259)，FeCl3·6H2O 0.0135g和10mmol/L HCl 50mL混匀后，加入十六烷基三甲基溴化铵Hexadecyltrimethylammonium bromide HDTMA 99％145.8mg(上海源叶，S15001)，蒸馏水定容至100mL，灭菌后和900mL溶液a混匀。溶液a：葡萄糖(Glucose)9g，蛋白胨(Peptone)4.5g，牛肉膏(Beef Extrac)2.7g，NaCl 4.5g，琼脂15g。
检测生物膜合成所需药剂：无水乙醇(中国国药集团，100092008)，结晶紫(Sigma，C0775)0.01g，蒸馏水10mL。
HCN检测用敏感试纸条所需药剂：4,4′-四甲基二氨基二苯甲烷Methane Base98％(上海源叶，S32035)25mg、乙基乙酰乙酸铜(II)Copper(II)Ethylacetoacetate 97％(上海源叶，T21050)25mg、三氯甲烷(中国国药集团，HW049401)10mL。
抗生素：氨苄青霉素Ampicillin[Amp]100mg/mL(索莱宝，A8180)、卡那霉素Kanamycine[Kan]50mg/mL(索莱宝，K8020)、氯霉素Chloramphenicol[Cm]25mg/mL(索莱宝，C8050)、硫酸链霉素Streptomycin sulfate[Str]50mg/mL(酷来搏，CS10481)、四环素Tetracyyline[Tet]10mg/mL(麦克林，T829835)、硫酸庆大霉素Gentamicin sulfate[Gm]50mg/mL(酷来搏，CG5551)、利福平Rifampicin[Rif]50mg/mL(酷来搏，CR9551)、盐酸壮观霉素Spectinomycin sulfate[Spec]50mg/mL(Sigma，G1914)、红霉素Erythromycin[Em]50mg/mL(酷来搏，CE5091)。
实施例1、防御假单胞菌(Pseudomonas protegens)菌株ZF509的分离鉴定
1.菌株分离、纯化
采集黑龙江哈尔滨土壤，分组编号，每组称取10g各加入90mL灭菌水中，于28℃恒温摇床内振荡培养30min；将混匀后的土壤悬浊液进行梯度稀释，选择稀释倍数为104、105、106、107的土壤悬浊液在KB平板上涂布，于28℃恒温培养箱培养36h。待平板上长出单菌落，使用灭菌牙签挑取不同形态的单一菌落在KB固体平板上划线纯化，于28℃恒温培养箱培养，待长出形态一致的单一菌落后，于4℃冰箱保存备用。
2、拮抗菌株针对西瓜噬酸菌的筛选
采用混菌法测定上述分离得到的菌株对西瓜噬酸菌的抑制率，使用微量移液枪吸取摇培后西瓜噬酸菌(Acidovorax citrulli)悬液4mL，加入经高温融化，温度在50℃的200mL灭菌KB固体培养基中，混合摇匀后倒入无菌培养皿内，室温冷凝成平板。在平板中央及四周贴上打孔器做出的统一大小灭菌后的滤纸片，使用微量移液枪在滤纸片上滴入5μL摇培后的土样中分离菌株悬浮液，于28℃恒温培养箱培养48h，每个处理重复3次。使用十字交叉法测量靶标菌的对照菌落直径和处理菌落直径，计算抑菌率获得拮抗菌株。
抑菌率(％)＝[(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落直径]×100％
结果如图1所示：利用混菌法获得1株对甜瓜细菌性果斑病具有较好抑制效果的拮抗细菌，对其编号为ZF509，再次使用平板对峙法测定菌株ZF509对甜瓜细菌性果斑病菌的抑制率，平板中央为菌株ZF509，平板培养基中混入甜瓜细菌性果斑病菌液(图1中A)，测定菌株509抑菌率为71.41％，以培养基中未接入甜瓜细菌性果斑病菌液的平板作为对照(图1中B)。
2、菌株ZF509的理化性质研究及分子生物学鉴定
1)形态学观察
对菌株ZF509进行形态学特征观察，即观察菌落大小、颜色、形状，菌落边缘形态和菌落表面是否具有光泽、菌落隆起或平坦、菌落质地光滑或粗糙等。采用平板划线法，挑取活化好的单菌落形态在KB固体平板培养基上进行划线，于28℃恒温培养箱内培养48h后取出观察，参考《常见细菌系统鉴定书册》(东秀珠等,2001)和《伯杰氏细菌鉴定手册》(Buchanan et al.,1984)的方法。
2)Biolog测定
挑取菌株ZF509单菌落接种至KB培养基试管斜面上，于28℃恒温培养箱中培养48h。由中国农业微生物菌种保藏中心使用BIOLOG GENⅢ试剂盒(按照试剂盒说明书操作)对菌株ZF509进行唯一碳源利用的测定。
结果如图2所示：菌株ZF509在KB平板上培养48h，菌落微微隆起呈圆形或近圆形，浅白色，边缘平整，表面湿润(图2中A)，培养5天，菌落变橙(图2中B)。革兰氏染色为阴性(图2中C)，扫描电镜下观察，菌落呈杆状，长度在1.5μm左右(图2中D-F)。生理生化鉴定结果显示，菌株ZF509明胶液化试验呈阴性，耐盐浓度在1-4g/mL(NaCl)，适宜偏酸性环境(表1)。
表1、菌株ZF509的生理生化特性鉴定
注：+：阳性反应或能生长；-：阴性反应或不能生长；W：弱阳性反应或可以生长
3)多基因扩增及序列分析
采用细菌基因组DNA提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司)提取菌株ZF509的基因组DNA，选择可用于鉴定假单胞菌种属的保守基因(表2)16S rDNA、DNA回旋酶亚基B(DNA gyrase subunit B，gyrB)、RNA聚合酶β亚基(RNA polymerase subunitβ,rpoB)和RNA聚合酶sigma-70因子(RNA polymerase sigma-70factor，rpoD)对菌株ZF509进行PCR扩增。
扩增体系为50μL，包括前引物1μL，后引物1μL，模板DNA 1μL；T-Taq Mix 25μL；ddH2O 22μL。PCR扩增程序设置为：95℃预变性3min；95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸45s，共29个循环；72℃延伸10min，PCR产物由北京博迈德生物技术有限公司完成测序。
通过NCBI网站下载其余对照菌株的上述三种基因，以软件MEGA 7.0、SequenceMatrix和Seaview 4按照16S rDNA、gyrB、rpoB的基因序列顺序比对后进行串联，采用最大似然法(自举数为1000)构建系统进化树，确定ZF509分类地位。
表2、引物信息
菌株ZF509具有核苷酸序列是序列表中序列1的16S rDNA，具有核苷酸序列是序列表中序列2的gyrB基因、具有核苷酸序列是序列表中序列3的rpoB基因和具有核苷酸序列是序列表中序列4的rpoD基因。基于菌株ZF509的16S rDNA、gyrB和rpoB基因序列，构建ZF509多基因系统进化树。结果如图3所示，菌株ZF509与防御假单胞菌模式菌株聚在一个分支。结合形态观察、生理生化特性检测和系统进化树构建，鉴定菌株ZF509属于防御假单胞菌(Pseudomonas protegens)。
3、ZF509菌株的保藏
防御假单胞菌ZF509已于2023年6月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.27638。以下简称防御假单胞菌CGMCC No.27638或者菌株ZF509。
4、防御假单胞ZF509对抗生素的耐受水平测定
接种了ZF509菌液的八种含抗生素培养基24h和48h摇瓶培养情况见图4。结果如表3所示，48h之内，菌株ZF509对四环素、利福平、氨苄青霉素、盐酸壮观霉素、链霉素和红霉素表现出较强抗性，耐受水平在50μg/mL-500μg/mL，对氯霉素的耐受水平在50μg/mL-300μg/mL，对卡那霉素和硫酸庆大霉素没有抗性。
表3、菌株ZF509 24h耐药性
+：抗性或能生长；-：无抗性或不能生长；W：弱抗性或可以生长
5、菌株ZF509酶活检测、生物膜合成测定和氢氰酸HCN合成测定
将活化后的ZF509菌株接种在蛋白酶选择性培养基、无机磷选择性培养基、纤维素酶检测用培养基和嗜铁素检测用培养基的中心位置上，每个处理重复3次，28℃培养24h后观察接种处是否产生透明的消解圈。结果如图5所示，菌株ZF509具有产生蛋白酶和溶解无机磷的能力(图5中A和B)，不产生纤维素酶和嗜铁素(图5中C和D)。
将摇培好的菌株ZF509次日稀释菌液至OD600＝0.5后，吸取30μL菌液转接到盛有3mL KB培养基的无菌管中(1:100)，于28℃静置培养24h后，倒出试管中的菌液，使用去离子水冲洗一次，加入4mL 0.1％(w/v)的结晶紫室温染色15min。再用去离子水冲洗试管2次，观察管壁是否有紫色圆环出现。结果如图5中E所示，菌株ZF509具有产生生物膜的能力。
将滤纸条浸泡在含有25mg 4,4′-四甲基二氨基二苯甲烷和25mg乙基乙酰乙酸铜(II)的10mL氯仿中，制成检测HCN的敏感试纸条，悬空密封在已接种ZF509菌株的KB固体培养基上，每个处理重复3次，28℃培养24h后观察试纸条是否变蓝。结果如图5中F所示，菌株ZF509可以产生氢氰酸。
6、菌株ZF509抑菌物质测定
通过特异性引物扩增产物(引物序列信息见表4)和抗菌物质合成序列比对，参照阳性对照菌株P.protegens pf5已知含有的抗菌物质，结果如图6所示，确定了ZF509菌株含有2,4-DAPG、硝吡咯菌素、藤黄绿脓菌素和2-羟基吩嗪四类抑菌物质。
表4、抗生素基因及引物序列信息
7、菌株ZF509生长曲线测定
挑取纯化后的ZF509单菌落转入3mL KB培养基中摇培12h作为种子液，将种子液稀释至OD600＝0.5后，转接到盛有50mL KB(+kan)培养基的无菌250mL三角瓶中，置于28℃摇床，200rpm摇培，设计3个重复。转接后间隔4h取样一次，每次取100μL菌液，溶于900μL无菌水中作为一级稀释梯度(取样节点见表5)。选择104-107倍稀释范围内的菌液进行平板涂布并计数，结果如图7所示，菌株ZF509在12-20h处于对数生长阶段，20h以后趋于稳定，活菌浓度在1×109CFU/mL范围内，28h后菌株活性开始下降。
表5、ZF509生长曲线取样节点
实施例2、菌株ZF509的抑菌谱检测
1、细菌抑菌谱
采用双层培养法测定防御假单胞菌ZF509对病原细菌的抑制效果。将待测菌株ZF509在KB液体培养基中摇培至菌液浓度为1×108CFU/mL，使用10μL量程移液枪吸取5μL待测菌液点在KB培养基(玻璃皿)中央，于28℃下培养48h；将培养皿倒置，使用胶头滴管吸取5mL氯仿沿玻璃皿缝隙滴加，在通风橱内熏蒸至少9h。空白对照组的设置：在KB培养基中央点入5μL KB培养基作为对照。根据病原菌种类设置处理组，每组三个重复。
使用玻璃试管，每管分装5mL WA培养基并灭菌，在50℃恒温水浴锅中保温。提前在KB培养基中摇培待测病原菌液24h，使用200μL量程移液枪，每支玻璃试管加入150-200μL待测病原菌菌液，倒入待筛选菌层上层静置；于28℃培养48h后观察抑菌圈。使用十字交叉法测量靶标菌的对照菌落直径和处理菌落直径，计算抑菌率获得拮抗菌株。
抑菌率(％)＝[(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落直径]×100％
结果如图8中A-D和表6显示，ZF509可以有效抑制西瓜噬酸菌(Acidovoraxcitrulli)、野油菜黄单胞野油菜致病变种(Xanthomonas campestris pv.campestris)、密执安棒杆菌密执安亚种(Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis)、胡萝卜软腐果胶杆菌(Pectobacterium carotovorum)，抑菌直径均大于45mm。
表6、ZF509菌株对4种病原细菌的抑制作用
2、防御假单胞菌ZF509挥发性物质抑菌活性测定
将从-80℃拿出的冻存ZF509菌液于4℃冰箱融化后，取500μL菌液加入装有5mL液体KB培养基的试管中活化，于恒温振荡器28℃，150rpm摇培12h。将活化好的菌液进行平板划线后，于生化培养箱28℃培养24h。挑取长出的单菌落再次划线进行纯化。挑取单菌落在KB液体培养基中摇培48h，获得防御假单胞菌ZF509菌剂，浓度为1.0×108CFU/mL。
在二分皿两侧分别倒入PDA和KB固体培养基，晾干后备用。使用灭菌牙签挑取生防菌株ZF509单菌落于KB固体培养基一侧划线，28℃培养箱内培养24h。每个靶标处理组三个重复。已接种生防菌液ZF509并培养24h的二分皿，在PDA侧距中间隔板2.25cm处，加入5.0mm病原真菌菌饼，置于28℃培养箱中倒置培养。观察到空白对照病原真菌生长至平板边缘处进行调查，十字交叉法测定病原菌生长直径并计算抑制率。
抑菌率(％)＝[(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落直径]×100％
空白对照组的设置：KB培养基不接种ZF509。
结果如图9中A-G和表7所示，ZF509挥发性物质对立枯丝核菌、西瓜壳二孢菌、匍柄霉菌和茄链格孢具有明显的抑制作用，抑菌率在55％以上；对尖孢刺盘孢和多主棒孢菌具有一定抑制作用，抑菌率分别为45.3％和36.4％；对尖孢镰刀菌有轻微抑制作用，抑菌率仅为22.5％。
表7、ZF509菌株挥发性物质对7种病原真菌的抑制作用
实施例3、防御假单胞菌ZF509对甜瓜和西瓜的果斑病防效测定
1、防御假单胞菌ZF509菌剂制备
将从-80℃拿出的冻存ZF509菌液于4℃冰箱融化后，取50μL菌液加入装有5mL液体KB培养基的试管中活化，于恒温振荡器28℃，150rpm摇培12h。将活化好的菌液进行平板划线后，于生化培养箱28℃培养24h。挑取长出的单菌落再次划线进行纯化。挑取单菌落在KB液体培养基中摇培48h，获得防御假单胞菌ZF509菌剂，浓度为1.0×108CFU/mL。
2、防御假单胞菌ZF509对甜瓜离体叶片的果斑病防效测定
选择两叶一心高度相同的健康甜瓜幼苗，使用无菌棉布浸水后裹住幼苗根部，于灭菌玻璃皿内保湿培养。将甘油管内保存的西瓜噬酸菌在KB平板上活化，使用灭菌牙签或接种环挑取长出的单菌落，接种在装有3mL液体KB培养基的摇菌管中，放入28℃培养箱振荡培养24h。全部过程在无菌操作台内操作。将西瓜噬酸菌菌悬液摇培浓度至1×108CFU/mL，使用无菌枪头在叶面滴加，确保每片叶片正反两面有菌液附着。接种24h后在叶片正反面喷施本实施例中步骤1获得的的ZF509菌剂，对照表8分级标准调查防效。病情分级参考文献为：李乐书.防治瓜类细菌性果斑病生物种衣剂的研制[D].南京农业大学,2017；费诺亚,陈华民,杨玉文等.瓜类细菌性果斑病国外研究新进展[J].中国瓜菜,2022,35(07):1-5.对照组(CK)为：接种24h在叶片正反面喷施清水，观察发病情况作为对照。
表8、果斑病分级标准
病情指数＝100×∑(各级病叶数×相对级数的代表值)/(总叶数×最高级数的代表值)
防治效果(％)＝[(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数]×100％
结果如图10中A-C和表9所示，只接种西瓜噬酸菌的病原菌对照组发病严重，叶片正面深褐色病斑凹陷，周围具有黄色晕圈，叶片背面水渍状病斑；ZF509处理组叶片发病明显较轻，叶片正面具有零星淡黄色小病斑，叶片整体颜色保持绿色；噻霉酮处理组叶片发病较轻，叶片具有较少的淡黄色小病斑，叶片整体颜色保持绿色。对病叶病斑面积占比进行病情指数分析，防御假单胞菌株ZF509防效为74.1％，对照药剂噻霉酮防效为82.8％，两者防效接近。
表9、ZF509对甜瓜细菌性果斑病的防治效果
处理 病情指数 防治效果/％
ZF509 16.7 74.1
噻霉酮 10.9 82.8
CK 63.3 ——
3、防御假单胞菌ZF509对盆栽甜瓜的果斑病防效测定
选取饱满的甜瓜种子，50℃水浴浸种10min，再把种子由灭菌纱布包裹放入保湿盒内，置于28℃恒温箱中催芽，当胚根长出0.3cm-0.5cm时准备播种，尽量选择出根一致的催芽后种子播种在72皿穴盘内，保证出苗整齐，选择两叶一心甜瓜苗(第一片真叶刚刚展开时)进行接种。
接种分为预防和治疗两种接种方式：1)治疗处理组：先将西瓜噬酸菌悬液(菌悬液浓度为1.0×108CFU/mL)喷施在叶面上，确保每片叶片正反两面有菌液附着，间隔36h后喷施本实施例中步骤1获得的ZF509菌剂(菌悬液浓度1.0×108CFU/mL)和对照药剂噻霉酮(有效成分含量1.6％稀释600倍液；2)预防处理组：先在甜瓜幼苗上喷施同等浓度的生防菌液ZF509和对照药剂噻霉酮，间隔36h后喷施病原菌液西瓜噬酸菌。均使用喷雾接种，平均每株苗接种5mL西瓜噬酸菌悬液和防治药剂。观察接种西瓜噬酸菌悬液3天、5天的发病情况，根据病叶上病斑面积计算病情指数，对ZF509的活体防效进行评价。
病情指数＝100×∑(各级病株数×相对级数的代表值)/(总株数×最高级数的代表值)
防治效果(％)＝[(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数]×100％
1)防御假单胞菌ZF509对盆栽甜瓜果斑病的预防效果
预防处理组:先喷施同等浓度的生防菌液ZF509和对照药剂噻霉酮，间隔36h后喷施病原菌液。
结果如图11中A-H和表10所示，只接种西瓜噬酸菌的病原菌对照组发病严重，存在明显较大水渍状病斑，叶片出现多个均匀分布的淡黄色斑点，发病严重该区域病斑连接成片成深褐色，叶边缘褪绿泛黄；经过菌株ZF509处理的甜瓜叶片叶面叶面没有较大水渍状病斑，叶片正面具有零星淡黄色小病斑，叶片基本维持保持绿色；噻霉酮处理组叶片发病较轻，叶片具有较少的淡黄色小病斑和水渍状病斑，叶片整体颜色保持绿色。接种病菌后第三天，菌株ZF509对甜瓜细菌性果斑病的预防效果为83.0％，噻霉酮的预防效果为87.1％，接种后第五天，菌株ZF509的预防效果为75.3％，噻霉酮的预防效果为69.3％。结果表明，菌株ZF509的防效较稳定，随着时间延长没有大幅度下降，而化学药剂噻霉酮的防效较不稳定，随着时间延长有所下降。
表10、ZF509对甜瓜细菌性果斑病的预防效果
2)防御假单胞菌ZF509对盆栽甜瓜果斑病的治疗效果
治疗处理:先接种病原菌液，间隔36h后喷施生防菌液ZF509和对照药剂噻霉酮。
结果如图12中A-H和表11所示，只接种西瓜噬酸菌的病原菌对照组发病严重，存在明显较大水渍状病斑，叶片出现多个均匀分布的淡黄色斑点，发病严重该区域病斑连接成片成深褐色；经过菌株ZF509处理的甜瓜叶片叶面叶面没有较大水渍状病斑，叶片正面具有淡黄色小病斑分布，叶片基本维持保持绿色；噻霉酮处理组叶片发病较轻，叶片具有较少的淡黄色小病斑和水渍状病斑，叶片整体颜色保持绿色。整体观察，治疗处理组的发病情况比预防处理的发病情况严重。接种病菌后第三天，菌株ZF509对甜瓜细菌性果斑病的治疗效果为50.4％，噻霉酮的治疗效果为48.6％，接种后第五天，菌株ZF509的治疗效果为43.4％，噻霉酮的治疗效果为40.1％。结果表明，菌株ZF509的防效较稳定，优于对照药剂噻霉酮。随着时间延长，菌株ZF509和噻霉酮的治疗防效均有下降。
表11、ZF509对甜瓜细菌性果斑病的治疗效果
4、防御假单胞菌ZF509对盆栽西瓜的果斑病防效测定
选取饱满的西瓜种子，50℃水浴浸种10min，再把种子由灭菌纱布包裹放入保湿盒内，置于28℃恒温箱中催芽，当胚根长出0.3cm-0.5cm时准备播种，尽量选择出根一致的催芽后种子播种在72皿穴盘内，保证出苗整齐，选择两叶一心西瓜苗(第一片真叶刚刚展开时)进行接种。
接种为预防+治疗的方式：先在西瓜幼苗上喷施本实施例中步骤1获得的ZF509菌剂(浓度为1.0×108CFU/mL)和对照药剂噻霉酮(有效成分含量1.6％稀释600倍液，间隔72h后喷施浓度为1.0×108CFU/mL西瓜噬酸菌菌悬液，确保每片叶片正反两面有菌液附着，间隔72h后喷施相同浓度的ZF509菌剂和对照药剂噻霉酮。观察接种西瓜噬酸菌悬液5天、7天的发病情况，根据病叶上病斑面积计算病情指数，对ZF509的活体防效进行评价。
病情指数＝100×∑(各级病株数×相对级数的代表值)/(总株数×最高级数的代表值)
防治效果(％)＝[(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数]×100％
结果如图13中A-H和表12所示，只接种西瓜噬酸菌的病原菌对照组发病严重，存在明显较大水渍状“V”形病斑，发病严重该区域病斑连接成片成深褐色，叶边缘褪绿泛黄，植株出现萎蔫症状；经过菌株ZF509处理的甜瓜叶片叶面叶面没有较大水渍状病斑，叶片正面具有零星淡黄色小病斑，叶片基本维持保持绿色；噻霉酮处理组叶片发病轻于病原菌对照，但重于ZF509处理组，叶片具有连片病斑和水渍状病斑，植株略有萎蔫，叶片小于健康对照。接种病菌后第五天，菌株ZF509对西瓜细菌性果斑病的预防效果为83.0％，噻霉酮的预防效果为87.1％，接种后第七天，菌株ZF509的预防效果为75.3％，噻霉酮的预防效果为69.3％。结果表明，菌株ZF509的防效较稳定，随着时间延长没有大幅度下降，优于化学药剂噻霉酮。
表12、ZF509对西瓜细菌性果斑病的防治效果
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。

Claims (9)

1.防御假单胞菌，其特征在于：所述防御假单胞菌为防御假单胞菌(Pseudomonasprotegens)CGMCC No.27638，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.27638。
2.一种菌剂，其特征在于：所述菌剂含有权利要求1所述的防御假单胞菌和/或所述防御假单胞菌的代谢物；
所述菌剂为病原菌抑制剂或病害抑制剂，所述病原菌为病原真菌或病原细菌；
所述病原真菌为立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、西瓜壳二孢(Ascochytacitrullina)、匍柄霉菌(Stemphylium solani)、尖孢刺盘孢(Colletotrichum acutatum)、多主棒孢菌(Corynespora cassiicola)、尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)和茄链格孢(Alternaria solani Sorauer)；
所述病原细菌为西瓜噬酸菌(Acidovorax citrulli)、野油菜黄单胞野油菜致病变种(Xanthomonas campestris pv.campestris)、密执安棒杆菌密执安亚种(Clavibactermichiganensis subsp.michiganensis)和胡萝卜软腐果胶杆菌(Pectobacteriumcarotovorum)；
所述病害为甜瓜果斑病。
3.权利要求2所述菌剂的制备方法，包括如下步骤：将权利要求1所述的防御假单胞菌作为活性成分，得到所述菌剂。
4.生物有机肥，其特征在于：所述生物有机肥含有权利要求1所述防御假单胞菌或权利要求2所述的菌剂。
5.权利要求1所述的防御假单胞菌在制备下述1)-3)中任一的产品中的应用：
1)用于防治植物病害的菌剂，所述病害为甜瓜果斑病；
2)病原菌抑制剂，所述病原菌为病原真菌或病原细菌；
所述病原真菌为立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、西瓜壳二孢(Ascochytacitrullina)、匍柄霉菌(Stemphyliumsolani)、尖孢刺盘孢(Colletotrichum acutatum)、多主棒孢菌(Corynespora cassiicola)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)和茄链格孢(Alternaria solani Sorauer)；
所述病原细菌为西瓜噬酸菌(Acidovorax citrulli)、野油菜黄单胞野油菜致病变种(Xanthomonas campestris pv.campestris)、密执安棒杆菌密执安亚种(Clavibactermichiganensis subsp.michiganensis)和胡萝卜软腐果胶杆菌(Pectobacteriumcarotovorum)。
6.培养权利要求1所述防御假单胞菌的方法，包括将所述防御假单胞菌在用于培养防御假单胞菌的培养基中培养的步骤。
7.权利要求1所述防御假单胞菌或权利要求2所述的菌剂在栽培甜瓜中的应用。
8.栽培甜瓜的方法，包括如下：
1)向栽培甜瓜叶片喷施权利要求1所述防御假单胞菌或权利要求2所述的菌剂；
2)向栽培甜瓜幼苗喷施权利要求1所述防御假单胞菌或权利要求2所述的菌剂。
9.权利要求1所述的防御假单胞菌在防治甜瓜果斑病和/或提高甜瓜产量中的应用。
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