CN117512006A - 一种紫斑牡丹花瓣基部色斑形成基因沉默方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种紫斑牡丹花瓣基部色斑形成基因沉默方法。本发明属于植物基因工程技术领域，具体提供了一种紫斑牡丹花瓣基部色斑形成基因沉默方法，在本方案中通过将目的基因构建至TRV2载体，重组载体转化农杆菌后，对包含目的基因的农杆菌扩大培养，离心后将菌体重悬，分别以真空抽滤花瓣盘和花苞注射菌液的方法侵染花瓣色斑或花苞。经过两种方法侵染过的紫斑牡丹花瓣色斑可以观察到明显的表型效果，经HPLC检测可发现花色苷含量的显著下降。对花苞注射菌液后的花瓣材料进行结构基因的实时荧光定量检测实时荧光定量，发现目的基因的表达被有效抑制。本发明为紫斑牡丹花瓣基部色斑形成相关基因的功能研究提供一种效果显著、高效快捷的侵染方法。
Description
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域，具体为一种紫斑牡丹花瓣基部色斑形成基因沉默方法。
背景技术
紫斑牡丹(Paeonia rockii)是我国牡丹野生种之一，因其纯白色花瓣的基部有一个深紫色斑点而得名。作为牡丹野生种中最濒危的种类，紫斑牡丹是牡丹色斑品种的主要遗传来源，但其花瓣基部色斑形成的分子机制仍不清楚。紫斑牡丹从实生苗到开花需要经历3～4年的时间且实生苗性状变异较大。目前通过转基因技术在本源植物上来验证紫斑牡丹基因的功能，存在一定的技术瓶颈，紫斑牡丹再生及遗传转化较为困难，且尚无稳定转化体系。病毒诱导的基因沉默避免了植物转化的需要，方法简单，结果迅速。
病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)是利用植物抗病毒防御机制作为植物反向遗传学工具的技术，将携带植物功能基因cDNA的病毒侵染植物，引起基因沉默和表型变异，通过表型变异进行基因功能分析的方法。
VIGS的作用机制是：病毒侵染植物细胞引起双链RNA的积累，双链RNA在植物体内被Dicer酶降解成小分子干扰RNA(siRNA)，siRNA与RNAase结合形成RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex,RISC)，RISC特异性地攻击同源mRNA导致其降解，进而达到基因沉默的目的。
烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus,TRV)载体是VIGS技术用于植物基因功能研究的优选载体，是从TRV基因组发展的一种VIGS载体，侵染效率和持久性较好，能够介导基因沉默的同时不会带来病毒诱导的症状，因而应用广泛。RNA1和RNA2 cDNA的双元表达载体TRV1和TRV2是植物VIGS常用沉默载体。TRV2用于携带目的基因，TRV1负责辅助病毒载体，增强侵染效率。
目前关于VIGS技术在紫斑牡丹花瓣基部色斑形成过程中相关基因功能验证的报道还未发现。
发明内容
针对上述情况，为弥补上述现有缺陷，本发明提供了一种紫斑牡丹花瓣基部色斑形成基因沉默方法，通过本方案中提供的方法可以高效地使TRV病毒载体浸染发育中的紫斑牡丹花瓣色斑部位，并产生明显表型。
本发明提供如下的技术方案：本发明提出的一种紫斑牡丹花瓣基部色斑形成基因沉默方法，具体包括下述步骤：
1)将TRV1病毒载体、TRV2空载体和携带目的基因的TRV2重组载体分别转化农杆菌，对鉴定后的阳性农杆菌进行扩大培养，离心后用侵染缓冲液重悬，得混合菌液；
2)采用真空抽滤花瓣盘法或者花苞注射菌液法对紫斑牡丹花瓣或花苞进行侵染，并观察表型。
进一步地，步骤2)中采用真空抽滤花瓣盘法进行侵染的具体步骤为：
(1)用打孔器将花瓣色斑部位取下，置于混合菌液中；
(2)用真空泵抽真空至0.7atm，负压处理45min，辅助混合菌液侵染花瓣；
(3)真空抽滤侵染后的花瓣盘放入干净的培养皿中，喷施清水使花瓣盘保持湿润，置于阴凉处48h后观察表型，并保存样品用于HPLC检测花色苷含量变化。
进一步地，所述花瓣色斑为初开期花瓣的色斑部位。
进一步地，步骤2)中采用花苞注射菌液法进行侵染的具体步骤为：
用无菌注射器吸取1mL混合菌液注射插入牡丹花苞，24h后补充注射一次，待注射过菌液的花苞开放后观察表型，进行花色值测定，并采样、提取RNA进行实时荧光定量测定相关基因的表达量变化以及HPLC测定花青苷的含量变化。
进一步地，所述紫斑牡丹花苞接种时的发育阶段处于风铃期，要求在花瓣色斑未形成时注射。
进一步地，所述紫斑牡丹花苞注射插入部位为花苞中部，斜向下插至萼片位置的中间部位。
进一步地，步骤1)中所述的农杆菌为GV3101农杆菌或者EHA105农杆菌，转化农杆菌采用冻融法。
进一步地，步骤1)中所述侵染缓冲液包括以下组分：10mM MgCl2、10mM MES、5mM乙酰丁香酮。
进一步地，步骤1)中，将含有TRV1、TRV2或携带目的基因的TRV2重组载体的阳性农杆菌扩大培养至OD600值为0.8-1.2，离心收集菌体后用侵染缓冲液重悬至OD600为1，并将TRV2空载体和携带目的基因的TRV2重组载体的重悬液分别与TRV1病毒载体重悬液按1:1的比例混合，获得混合菌液。
优选地，农杆菌扩大培养至OD600值为0.8，离心机5000rpm离心15min后将侵染缓冲液重悬至OD600值为1。
采用上述结构本发明取得的有益效果如下：本发明提出的一种紫斑牡丹花瓣基部色斑形成基因沉默方法，具有下述优点：
(1)采用真空抽滤花瓣盘的方法，采样后可在实验室进行，方便观察。
(2)采用花苞注射菌液的方法，利用带针头的注射器将菌液侵染入花苞，无需稳定转化和无菌操作即可验证目的基因在花瓣基部花青苷合成中的作用。
本方案中提供的上述两种方法均可以高效地使TRV病毒载体浸染发育中的紫斑牡丹花瓣基部，并产生明显表型。本发明为病毒诱导基因沉默技术在紫斑牡丹花瓣基部色斑形成过程中花青苷相关基因的功能研究提供了两种快捷高效的验证方法。对研究紫斑牡丹花瓣色斑形成机理提供了新的思路。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为本发明花苞注射菌液法的接种方法图；
图2为本发明花苞注射菌液法的花苞接种时期图；
图3为本发明真空抽滤花瓣盘法沉默目的基因后的色斑表型图；
图4为本发明花苞注射菌液法沉默目的基因后的色斑表型图；
图5为本发明真空抽滤花瓣盘法目的基因沉默后花瓣色斑部位的花青苷含量图；
图6为本发明花苞注射菌液法目的基因沉默后花瓣色斑部位的花色苷含量图；
图7为本发明目的基因沉默后花青苷合成结构基因的表达量变化图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例；基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本实施例具体提出了一种紫斑牡丹花瓣基部色斑形成基因沉默方法，具体包括真空抽滤花瓣盘法或者花苞注射菌液法两种方法。
(一)原料和试剂来源
1)紫斑牡丹植株：紫斑牡丹品种为“月宫烛光”，种植于西北农林科技大学牡丹资源圃。
2)VIGS实验所用沉默载体TRV1和TRV2来自西北农林科技大学牡丹种质资源与遗传育种实验室。
3)农杆菌GV3101或者EHA105购于上海唯地生物技术有限公司。
4)LB培养基配方：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/LNaCl(固体平板加入15g/L琼脂粉)。
5)YEP培养基配方：10g/L胰蛋白胨、10g/L酵母提取物、5g/L NaCl(固体平板加入15g/L琼脂粉)。
(二)接种方法
1.农杆菌的转化及培养
1.1)使用液氮冻融法将TRV2、TRV1质粒及目的基因构建的TRV2重组载体质粒分别转化到农杆菌GV3101感受态细胞中，具体方法为：吸取10-1000ng质粒加入100μL感受态中，缓慢吸打混匀后依次在冰上，液氮，37℃水浴和冰上各处理5min，向管中加入700μL无抗YEP液体培养基，28℃180rpm振荡2～3h；6000rpm离心1min，在超净工作台中除去600μL上清液，将剩下的100μL菌液吸打混匀，涂布于有抗YEP固体培养基(50μg/mL Kan+50μg/mL Gen+20μg/mL Rif)上，倒置于28℃恒温培养箱2-3d至出现单一菌落。从平板上挑取单菌落于200μLYEP液体培养基(含50μg/mL Rif+50μg/mL Gen+50μg/mL Kan)中，振荡5h(28℃，250rpm)。以菌液做模板，经PCR检测后的阳性菌落保存备用。
1.2)将包含TRV2、TRV1质粒和含有目的基因的TRV2重组载体质粒的GV3101农杆菌扩大培养，分别接种于5mL YEP液体培养基(含50μg/mL Kan+50μg/mL Rif+50μg/mL Gen)中，于28℃振荡培养至菌液浑浊，再将该菌液分别转移至25mL YEP液体培养基(含50μg/mLKan+50μg/mL Rif+50μg/mL Gen)中，于28℃振荡培养至OD600值为1。
1.3)将摇混的菌液置于5000rpm转速下离心15min，弃上清后，用侵染缓冲液(0.475g10mM MgCl2+0.975g 10mM MES+0.49g 5mM乙酰丁香酮，补充ddH2O至500mL)将菌体重悬，使每种菌液的OD600值为1。
1.4)将TRV2载体的重悬菌液和目的基因的TRV2重组载体重悬菌液分别与TRV1载体重悬菌液按1:1的体积比混合，混合菌液在90rpm的摇床混合1h后，置于28℃恒温培养箱，黑暗下静置2-3h，所得混合菌液即可用于侵染。
2.侵染
方法一：真空抽滤花瓣盘法
取初开期的紫斑牡丹品种“月宫烛光”花瓣，用打孔器将花瓣基部的色斑部位打成大小一致的花瓣盘，将花瓣盘置于混合菌液中，抽真空至0.7atm，负压处理45min，缓慢放气；用ddH2O漂洗抽滤后的花瓣盘以除去多余菌液；将花瓣盘放置于培养皿中，喷施ddH2O使表面保持湿润。
方法二：花苞注射菌液法
如图1和图2，用无菌注射器吸取1mL混合菌液注射入风铃期的紫斑牡丹品种“月宫烛光”花苞(此时色斑还未出现)，注射器的针头插入部位为花苞中部，斜向下插至萼片位置的中间部位；24h后补充注射一次。
3.检测
方法一：真空抽滤花瓣盘法
将侵染后的花瓣盘在室温下置于阴暗处培养48h；观察空白组，空载组和沉默组花瓣盘的表型并拍照记录，完成后将花瓣盘置于液氮速冻，通过HPLC检测不同处理组的花青苷含量变化。
方法二：花苞注射菌液法
待空白组，空载组和沉默组的花朵开放后观察表型并拍照记录，将花瓣分为色斑和非色斑部分，提取不同部位的RNA并反转录成cDNA，通过实时荧光定量检测相关基因的变化，同时也通过HPLC检测不同处理组的花青苷含量变化。
4.结果与分析
(1)表型分析
采用真空抽滤花瓣盘的方法瞬时沉默目的基因后，花瓣盘的表型结果如图3所示：与TRV2空载组或空白组(CK)相比，基因沉默组的花瓣色斑出现不规则的斑驳状色素脱落，局部有完全变白的现象，具有肉眼可见的明显效果。
采用花苞注射菌液法对目的基因进行瞬时沉默，待花朵完全开放后观察花朵和花瓣表型。结果如图4所示：与TRV2空载组或空白组相比，基因沉默组花瓣色斑部位的花色素明显减淡甚至完全变白。此外，花朵整体轮廓变小，花瓣数减少，子房、柱头和雄蕊消失。
(2)花青苷含量分析
对真空抽滤后的花瓣盘和花苞注射菌液后的花瓣材料进行花青苷含量测定。在紫斑牡丹品种“月宫烛光”花瓣非色斑部分未检测出花青苷，色斑部分主要测出四种花色苷，分别是Cy3G、Cy3G5G、Pn3G和Pn3G5G，测定结果表明如图5和图6。
无论是真空抽滤法还是花苞注射法，与空白组和TRV2空载组相比，基因沉默组的每种花青苷含量都显著下降，花苞注射法基因沉默组的花色苷下降程度比真空抽滤法的更加明显。
(3)基因表达分析
由于真空抽滤的花瓣盘离体太久，难以提取RNA，因此以花苞注射后开放的花朵为试验材料，分别提取花瓣色斑和非色斑部位的RNA并反转录成cDNA进行实时荧光定量，结果显示如图7；与空白组和TRV2空载组相比，基因沉默组目的基因的表达在花瓣色斑处被抑制，其下游的结构基因PrF3’H、PrDFR和PrANS在花瓣色斑处也均不表达。
综上所示，本发明公开的两种接种方法，各有优点。均可以方便快捷地将TRV病毒载体接种到紫斑牡丹花瓣中，并且可以获得显著的效果。本发明为病毒诱导基因沉默技术在紫斑牡丹花瓣色斑形成过程中花青苷合成相关基因的功能研究提供了两种快捷高效的侵染方法。对研究紫斑牡丹色斑形成相关基因提供了新的思路。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (10)
1.一种紫斑牡丹花瓣基部色斑形成基因沉默方法，其特征在于，具体包括下述步骤：
1)将TRV1病毒载体、TRV2空载体和携带目的基因的TRV2重组载体分别转化农杆菌，对鉴定后的阳性农杆菌进行扩大培养，离心后用侵染缓冲液重悬，得混合菌液；
2)采用真空抽滤花瓣盘法或者花苞注射菌液法对紫斑牡丹花瓣进行侵染，并观察表型。
2.根据权利要求1所述的一种紫斑牡丹花瓣基部色斑形成基因沉默方法，其特征在于，步骤2)中采用真空抽滤花瓣盘法进行侵染的具体步骤为：
(1)用打孔器将花瓣色斑部位取下，置于混合菌液中；
(2)用真空泵抽真空至0.7atm，负压处理45min，辅助混合菌液侵染花瓣；
(3)真空抽滤侵染后的花瓣盘放入干净的培养皿中，喷施清水使花瓣盘保持湿润，置于阴凉处48h后观察表型，并保存样品用于HPLC检测花色苷含量变化。
3.根据权利要求2所述的一种紫斑牡丹花瓣基部色斑形成基因沉默方法，其特征在于，所述花瓣色斑为初开期花瓣的色斑部位。
4.根据权利要求1所述的一种紫斑牡丹花瓣基部色斑形成基因沉默方法，其特征在于，步骤2)中采用花苞注射菌液法进行侵染的具体步骤为：
用无菌注射器吸取1mL混合菌液注射插入紫斑牡丹花苞，24h后补充注射一次，待注射过菌液的花苞开放后观察表型，进行花色值测定，并采样、提取RNA进行实时荧光定量测定相关基因的表达量变化以及HPLC测定花色苷的含量变化。
5.根据权利要求4所述的一种紫斑牡丹花瓣基部色斑形成基因沉默方法，其特征在于，所述紫斑牡丹花苞接种时的发育阶段处于风铃期，要求在花瓣色斑未形成时注射。
6.根据权利要求5所述的一种紫斑牡丹花瓣基部色斑形成基因沉默方法，其特征在于，所述紫斑牡丹花苞注射插入部位为花苞中部，斜向下插至萼片位置的中间部位。
7.根据权利要求1所述的一种紫斑牡丹花瓣基部色斑形成基因沉默方法，其特征在于，步骤1)中所述的农杆菌为GV3101农杆菌或者EHA105农杆菌，转化农杆菌采用冻融法。
8.根据权利要求1所述的一种紫斑牡丹花瓣基部色斑形成基因沉默方法，其特征在于，步骤1)中所述侵染缓冲液包括以下组分：10mM MgCl2、10mM MES、5mM乙酰丁香酮。
9.根据权利要求1所述的一种紫斑牡丹花瓣基部色斑形成基因沉默方法，其特征在于，步骤1)中，将含有TRV1、TRV2或携带目的基因的TRV2重组载体的阳性农杆菌扩大培养至OD600值为0.8-1.2，离心收集菌体后用侵染缓冲液重悬至OD600为1，并将TRV2空载体和携带目的基因的TRV2重组载体的重悬液分别与TRV1病毒载体重悬液按1:1的比例混合，获得混合菌液。
10.根据权利要求9所述的一种紫斑牡丹花瓣基部色斑形成基因沉默方法，其特征在于，农杆菌扩大培养至OD600值为0.8，离心机5000rpm离心15min后将侵染缓冲液重悬至OD600值为1。
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