CN117511964A - 一种GmERF5基因在抗旱和耐盐胁迫中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种GmERF5基因在抗旱和耐盐胁迫中的应用，属于基因工程技术领域。本发明将GmERF5基因克隆至pCAMBIA3301载体中，得到重组载体；将所得重组载体转化至发根农杆菌，用转化得到的发根农杆菌侵染种子得到转基因复合体植株，实现GmERF5基因的过表达。本发明过表达GmERF5基因可通过提高转基因大豆植株抗氧化酶活性，增强大豆对干旱和盐胁迫的耐受性。本发明的大豆GmERF5为提高大豆抗旱及耐盐性提供了一种新的调控基因资源，可用于抗逆大豆材料的培育和改良，为抗旱及耐盐分子机制奠定理论基础，同时也为大豆抗旱及耐盐分子育种提供理论依据和基因资源。

Description

一种GmERF5基因在抗旱和耐盐胁迫中的应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种GmERF5基因在抗旱和耐盐胁迫中的应用。
背景技术
大豆(Glycine max L.)是一种重要的粮食和经济作物。大豆的根系不发达，且在生长发育过程中需水量较多，是豆类作物中对水分最敏感的植物。因此，大豆在田间经常受到干旱和高盐度等不利环境因素的影响：易发生叶片萎蔫、枯黄、卷曲、植株矮小等现象，进而影响大豆的产量和质量，严重时会导致大豆植株的死亡。病虫害、低温、干旱、土壤盐碱化在内的生物和非生物胁迫对大豆生产造成了严重的威胁。因此，增强逆境防御能力，培育出在农艺性状上具有更好抗逆性的种质资源迫在眉睫。传统的育种方法虽然取得大量成绩，但研究受育种周期长，抗逆机制的复杂和优异种质资源缺乏的限制。将现代分子生物学技术和传统育种方式结合起来，研究植物的抗逆机制，成为广大育种工作者的必然选择。
植物的非生物胁迫应激网络极为复杂，含有大量基因水平的转录调控。植物通过对相关逆境应激基因的转录调控，达到调节生理发育的目的。离子胁迫、病原菌、水分、温度等影响植物信号传导的环境刺激因子，为了避免逆境胁迫的损伤，植物已具备一套自我调节机制来免于受到低温、干旱、高盐等不利的环境压力。AP2/ERF转录因子在参与植物胁迫应答过程中具有重要功能，尤其在干旱和盐胁迫反应中起关键作用。ERF-TFs广泛参与了许多物种的干旱、盐等非生物胁迫响应过程。GmERF3、TSRF1、OsERF48和TaERF3分别被鉴定为大豆、水稻和小麦抗旱性的正调节剂。在水稻中，OsAP37的过度表达对干旱的耐受性增强，并提高了粮食产量。在胁迫条件下，过表达OsEREBP1激活JA和ABA信号通路，从而提高水稻的存活率。小麦中的几种ERF已被鉴定，其调控可能用于改良品种的开发。中国专利CN114540367A(大豆GmPRR3b基因在调控大豆抗旱性中的应用，2022.2.18)发现大豆GmPRR3b基因能够负调控大豆的耐旱性。中国专利CN114085844A(大豆耐盐基因GmERD15B的应用，2020.7.13)表明过表达GmERD15B可能通过增加与已知盐胁迫相关基因(如ABA信号转导、脱水反应和离子转运)的表达水平来增强大豆的耐盐性。
迄今为止，在大豆中只鉴定到少量的数量性状位点(QTL)与大豆干旱和盐胁迫相关，已克隆到的参与大豆干旱和盐胁迫调控基因较少，且其调控网络仍不明确。因此，研究大豆对干旱和盐胁迫的调控基因非常有意义。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种GmERF5基因在抗旱和耐盐胁迫中的应用。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种GmERF5基因在改变植株抗旱性和/或耐盐性中的应用，在植株中过表达GmERF5基因，提高植株的抗旱性和/或耐盐性；在植株中敲低GmERF5基因的表达，降低植株的抗旱性和/或耐盐性。
优选的，所述GmERF5基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
优选的，所述GmERF5基因编码蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
优选的，所述过表达GmERF5基因的方法包括以下步骤：
将GmERF5基因克隆至pCAMBIA3301载体中，得到重组载体；
将所得重组载体转化至发根农杆菌，用转化得到的发根农杆菌侵染种子得到转基因复合体植株，实现GmERF5基因的过表达。
优选的，所述敲低GmERF5基因表达的方法包括以下步骤：
将GmERF5基因克隆至pFGC5941载体中，得到重组载体；
将所得重组载体转化至发根农杆菌，用转化得到的发根农杆菌侵染种子得到转基因复合体植株，实现GmERF5基因敲低表达。
本发明还提供了一种过表达GmERF5基因的重组载体，所述重组载体包括初始表达载体和GmERF5基因。
优选的，所述初始表达载体为pCAMBIA3301载体。
本发明还提供了一种敲低GmERF5基因的表达的重组载体，所述重组载体包括pFGC5941载体和GmERF5基因。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明过表达GmERF5基因可通过提高转基因大豆植株抗氧化酶活性，增强大豆对干旱和盐胁迫的耐受性。本发明的大豆GmERF5为提高大豆抗旱及耐盐性提供了一种新的调控基因资源，可用于抗逆大豆材料的培育和改良，为抗旱及耐盐分子机制奠定理论基础，同时也为大豆抗旱及耐盐分子育种提供理论依据和基因资源。
附图说明
图1是GmERF5在10％PEG6000处理下的相对表达量；
图2是GmERF5在250mM NaCl处理下的相对表达量；
图3是GmERF5和载体pCAMBIA3301双酶切的琼脂糖凝胶电泳结果图；
图4是GmERF5和载体pFGC5941酶切鉴定和测序分析结果图；
图5是GmERF5-OE转基因植株SDS小量法检测结果图；
图6是GmERF5-OE转基因植株western blot检测结果图；
图7是GmERF5-RNAi转基因植株SDS小量法检测结果图；
图8是GmERF5-RNAi转基因植株western blot检测结果图；
图9是GmERF5在GmERF5-OE转基因植株和GmERF5-RNAi转基因植株中的表达量；
图10是GmERF5-OE和GmERF5-RNAi转基因植株在干旱处理下生长状况示意图；
图11是GmERF5-OE和GmERF5-RNAi转基因植株在干旱处理下的气孔形态示意图；
图12是GmERF5-OE和GmERF5-RNAi转基因植株在干旱处理下的气孔横/纵比；
图13是GmERF5-OE和GmERF5-RNAi转基因植株在干旱处理下SOD活性；
图14是GmERF5-OE和GmERF5-RNAi转基因植株在干旱处理下POD活性；
图15是GmERF5-OE和GmERF5-RNAi转基因大豆种子在0、150、250mM NaCl处理下胚根的生长状况示意图；
图16是GmERF5-OE和GmERF5-RNAi转基因大豆种子在0、150、250mM NaCl处理下胚根长度；
图17是GmERF5-OE和GmERF5-RNAi转基因植株在250mM NaCl处理下SOD活性；
图18是GmERF5-OE和GmERF5-RNAi转基因植株在250mM NaCl处理下POD活性；
图19是GmERF5-OE和GmERF5-RNAi转基因植株在干旱及盐胁迫下GmPOD1的表达量。
具体实施方式
本发明提供了一种GmERF5基因在改变植株抗旱性和/或耐盐性中的应用，在植株中过表达GmERF5基因，提高植株的抗旱性和/或耐盐性；在植株中敲低GmERF5基因的表达，降低植株的抗旱性和/或耐盐性。
在本发明中，所述GmERF5基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：ATGCGCCGAGGGAGAGCCACCGCCGCCGTCGTGGATCCGACGGCGGAGCAGGCGAAGGAGACGCGGTTCCGCGGCGTCAGGAAGCGGCCGTGGGGGCGATTCGCGGCGGAGATTCGAGATCCGTGGAAGAAGCAGCGCGTGTGGCTGGGGACGTTCGATTCCGCCGAGGATGCCGCGCGGGCTTACGACAAGGCTGCCCGATCCTTCCGCGGGCCCAAGGCCAAGACCAATTTCCCCTCCTTCCCCGGCCCGACGGACCACCACTCCTCGCAGCAGATTCCGCCGCTCTACCAGGCCCACGGGCTTTCCACCAAGTTCGAGCCCGCCCAGGTGAACCGGCCCACCACCAGCGGCATGAGCAGCACCGTGGAGTCCTTCAGCGGGCCTAGGGTTCCCCCCTCCTCCTCCTCCTCTCGCAAGCCCCTTGTGGTTGTTAACCCTATCATCCCTCTCGACGACGACGACGACGATTGCCACAGCGATTGCGACTCTTCTTCCTCCGTCGTCGACGACCAGGACTGCGTCCTCACCTCCTCCTTCCGGCAACCGCTTCCCTTCGATCTAAACCTCCCGCCGCCCGATGCCGCCTACGACGACGACGACGACGACGTCCCCGCCACCGCGCTGTGCCTCTGA。
在本发明中，所述GmERF5基因编码蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体为：
MRRGRATAAVVDPTAEQAKETRFRGVRKRPWGRFAAEIRDPWKKQRVWLGTFDSAEDAARAYDKAARSFRGPKAKTNFPSFPGPTDHHSSQQIPPLYQAHGLSTKFEPAQVNRPTTSGMSSTVESFSGPRVPPSSSSSRKPLVVVNPIIPLDDDDDDCHSDCDSSSSVVDDQDCVLTSSFRQPLPFDLNLPPPDAAYDDDDDDVPATALCL。
优选的，所述过表达GmERF5基因的方法包括以下步骤：
将GmERF5基因克隆至pCAMBIA3301载体中，得到重组载体；
将所得重组载体转化至发根农杆菌，用转化得到的发根农杆菌侵染种子得到转基因复合体植株，实现GmERF5基因的过表达。
在本发明中，所述转化至发根农杆菌的方法优选为将重组载体质粒加入K599发根农杆菌感受态细胞中，所述重组载体质粒和K599发根农杆菌感受态细胞的体积比优选为1:5-15，进一步优选为1:8-12；所述侵染前将发根农杆菌活化。
优选的，所述敲低GmERF5基因表达的方法包括以下步骤：
将GmERF5基因克隆至pFGC5941载体中，得到重组载体；
将所得重组载体转化至发根农杆菌，用转化得到的发根农杆菌侵染种子得到转基因复合体植株，实现GmERF5基因敲低表达。
在本发明中，所述转化至发根农杆菌的方法优选为将重组载体质粒加入K599发根农杆菌感受态细胞中；所述重组载体质粒和K599发根农杆菌感受态细胞的体积比优选为1:5-15，进一步优选为1:8-12；所述侵染前将发根农杆菌活化。
本发明还提供了一种过表达GmERF5基因的重组载体，所述重组载体包括初始表达载体和GmERF5基因。在本发明中，所述初始表达载体为pCAMBIA3301载体(http://www.biofeng.com/)。所述重组载体的构建方法为将GmERF5基因连接到pMDTM18-T载体后进行转化、鉴定、提取，将提取到的重组质粒进行鉴定后和pCAMBIA3301载体质粒双酶切得到过表达GmERF5基因的重组载体。
本发明还提供了一种敲低GmERF5基因的表达的重组载体，所述重组载体包括pFGC5941载体(http://www.biofeng.com/)和GmERF5基因。在本发明中，所述重组载体的构建方法为以GmERF5的序列为模板进行同源比对，找到其在大豆中的同源基因，设计特异性引物将GmERF5与其同源基因不同源的部分进行PCR扩增，将扩增后的片段分别正反连接到植物表达载体pFGC5941，创造一个转录区域的发夹结构。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
干旱及盐胁迫下GmERF5基因的表达情况：
1.试验材料的培养与处理
选取饱满、无病斑的大豆栽培品种“东农50”种于混有蛭石的腐植土圆钵中，置于25℃，16h光照/8h黑暗的光温培养箱进行培养，待大豆幼苗生长至V3期，参照Li等的方法(LiW，Wang T，ZhangY，LiY.Overexpression ofsoybeanmiR172c conferstolerance towater deficit and salt stress，but increases ABA sensitivity in transgenicArabidopsis thaliana[J].Journal of ExperimentalBotany，2016，67(1)：175-194)用10％PEG6000和250mM NaCl处理大豆幼苗，在不同时间点后取大豆幼苗的三出复叶速冻于液氮中后放入-80℃冰箱保存，用作RNA的提取。
2.Trizol Reagent法提取大豆总RNA及cDNA的合成
(1)RNA提取
1)将适量试验所需的大豆叶片放入冷冻研磨仪(杭州遂曾生物技术有限公司)配备的研磨管中，加入1mLTrizol试剂后放入冷冻研磨仪中研磨1min。
2)加入氯仿，震荡15sec，在冰上放置3min，4℃，12000rpm，离心10min。
3)取500μL上层溶液，与500μL异丙醇充分混合，冰浴10min后，4℃，12000rpm，离心10min。
4)将上清丢弃，用去除RNase的75％乙醇轻轻吹起EP管底部RNA沉淀，4℃，7500rpm离心5min。重复一次。
5)将上清去除，待RNA沉淀干燥后加入20-40μL DEPC水，待沉淀完全溶解后放入-80℃保存，用作cDNA的合成。
(2)cDNA的合成
1)取4μLRNA于硅化的PCR管中，置于65℃变性5min。
2)依次加入2μL4×DN Master Mix和2μL水，置于37℃反应5min。
3)加入2μL 5×RT Master MixⅡ，37℃、15min，50℃、5min，98℃、5min，-20℃保存cDNA。
3.实时定量PCR(Quantitative real-time PCR，qRT-PCR)检测
(1)qRT-PCR引物的设计
1)根据GmERF5的CDS序列设计荧光定量引物：
F(SEQ ID NO.3)：TGAGCAGCACCGTGGAGTC
R(SEQ ID NO.4)：GCGGCGGGAGGTTTAGAT
2)根据内参基因GmEF1β的CDS序列设计荧光定量引物：
F(SEQ ID NO.5)：CCACTGCTGAAGAAGATGATGATG
R(SEQ ID NO.6)：AAGGACAGAAGACTTGCCACTC
(2)qRT-PCR具体步骤
试验用TOYOBOSYBR GREEN(QPS-201)试剂盒。反应体系如下：
ddH2O：5.6μL
Primer F：1.2μL
Primer R：1.2μL
2×SYBR Green：10μL
cDNA：2μL
总体积：20μL
扩增程序为：95℃3min；95℃30sec，60℃30sec，30个循环。结果用2-△△Ct法进行定量计算。△△Ct＝处理前(CtGmERF5－CtGmEF1β)－处理后(CtGmERF5－CtGmEF1β)。
结果如图1和图2所示：
在10％PEG6000处理后9-72h的时候GmERF5的相对表达量均显著高于0h(*P<0.05)，在12-36h的相对表达量达到极显著(**P<0.01)，且在12h达到最高值(是对照组的7.26倍)(图1)。上述结果表明GmERF5的表达受干旱胁迫诱导。
在250mM NaCl处理后的6-72h的时候GmERF5的相对表达量均极显著高于0h(*P<0.05)，在6-36h的表达量达到极显著(**P<0.01)，且在12h达到最高值(是对照组的9.87倍)(图2)。上述结果表明GmERF5的表达受盐胁迫诱导。
实施例2
植物表达载体的连接与转化：
1.植物过表达载体pCAMBIA3301-GmERF5的构建
(1)引物设计
构建过表达重组载体pCAMBIA3301-GmERF5，以大豆栽培品种“东农50”的cDNA为模板，设计特异性引物，进行RT-PCR扩增以获取GmERF5全长片段，将其连接到pMDTM18-T载体上，将经过测序鉴定无误的重组质粒及pCAMBIA3301质粒进行酶切，酶切位点为Nco1，Pml1，将酶切后包含GmERF5片段的产物与pCAMBIA3301进行连接，即获得pCAMBIA3301-GmERF5重组载体。
引物序列如下：
F(SEQ ID NO.7)：GCCATGGAGATGCGCCGAGGGAGAG
R(SEQ ID NO.8)：GCACGTGGAGGCACAGCGCGGTGGC
(2)T载体的连接反应
将目的片段连接至pMDTM18-T载体上，连接反应体系如下：
SolutionI：4μL
pMDTM18-T：1μL
胶回收产物：5μL
总体积：10μL
充分混匀后，16℃反应4h。
(3)连接产物的转化
1)将大肠杆菌E.coli DH5α感受态置于冰上解冻。
2)将步骤(2)所得产物加入大肠杆菌E.coli DH5α感受态，冰浴30min。
3)冰浴后迅速转移至42℃条件下热激42sec，再迅速转移，冰浴3min。
4)加入700μL LB液体，放置在摇床中，37℃、220rpm振荡培养60min。
5)取200μL悬浮菌液均匀的涂布在筛选平板上，37℃倒置培养过夜。
(4)转化克隆的菌液PCR鉴定
1)挑取饱满的单斑用液体筛选培养基培养，37℃、220rpm振荡4-6h。
2)利用Mix酶进行菌液PCR鉴定，其PCR体系如下：
2×Taq Master Mix酶：12.5μL
菌液：1μL
引物F(10μM)：1μL
引物R(10μM)：1μL
ddH2O：9.5μL
总体积：25μL
3)在PCR仪上进行扩增，98℃3min；98℃30sec，60℃30sec，72℃60sec，循环30次；72℃7min；4℃保存。
4)用电泳检测PCR扩增产物，挑选鉴定为阳性的菌液，用作质粒的提取。
(5)重组质粒的提取
1)取2mL菌液，12000rpm离心1min。
2)加入250μL的SⅠ液体重悬菌体沉淀。
3)加入250μL的SⅡ液体，翻转摇匀数次。
4)继续加入350μL的SⅢ液体，上下摇匀后，12000rpm离心10min。
5)吸取800μL上清液体至吸附柱中，12000rpm离心1min，去除管底部的废液。
6)加入500μL的WⅠ溶液，12000rpm离心1min，去除管底部的废液。
7)加入700μL的WⅡ溶液，12000rpm离心1min，去除管底部的废液。重复一次。
8)将制备管放回EP管，空离心1min。
9)将制备管放到一个新的EP管中，加30μL Elution Buffer，12000rpm离心1min，-20℃保存。
(6)重组质粒的双酶切鉴定
双酶切的体系如下：
重组质粒：16μL
10×Buffer：2μL
内切酶Ⅰ：1μL
内切酶Ⅱ：1μL
总体积：20μL
37℃，反应30min，进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。
(7)测序
将双酶切能够正确切开质粒进行测序鉴定。将测序正确的相应菌液与30％甘油按1：1比例混合以保存菌种。
(8)载体的构建
1)分别把已经测序无误重组质粒和pCAMBIA3301质粒进行双酶切，体系及反应条件参照步骤(6)。
2)参照OMEGA胶回收试剂盒说明书的方法回收目的片段以及酶切后的载体片段。
3)目的基因的DNA片段与载体片段的连接，其体系具体如下：
目的基因DNA片段：2μL
载体的DNA片段：2μL
10×T4 DNALigase Buffer：1μL
T4 DNALigase：0.5μL
ddH2O：4.5μL
总体积：10μL
反应条件：22℃，120min。
4)以E.coli DH5α感受态将连接产物转化大肠杆菌，方法参照步骤(3)。
5)PCR检测，方法参照步骤(4)。
6)经检测所获阳性重组质粒进行双酶切鉴定，方法参照步骤(6)。
2.植物敲低表达载体pFGC5941-GmERF5的构建
(1)引物设计
F(SEQ ID NO.9)：CCGCTCGAGGAGCCCGCCCAGGTGAAC
R(SEQ ID NO.10)：CATGCCATGGGAGGAGGTGAGGACGCAG
F(SEQ ID NO.11)：GCTCTAGAGAGCCCGCCCAGGTGAAC
R(SEQ ID NO.12)：CGGGATCCGAGGAGGTGAGGACGCAG
(2)植物敲低表达载体pFGC5941-GmERF5的构建
将植物过表达载体pCAMBIA3301-GmERF5的构建过程中获得的pMDTM18-T-GmERF5质粒PCR扩增以获得加入与载体一致的酶切位点的目的片段，测序无误后分别正反连接到载体pFGC5941上。
3.CaCl2法制备农杆菌感受态细胞
(1)挑取LBA4404单菌落至10mLYEP培养基(含25mg/LRif)，恒温摇床28℃、220rpm条件下培养过夜。
(2)在超净工作台内用移液枪吸取扩繁菌液800μL，二次接种活化至OD600约为0.6。
(3)取适量菌液于EP管中冰浴30min，然后4000×g低温离心5min，倒掉EP管中的废液。
(4)将灭菌后的0.05M CaCl2溶液提前低温预冷，用移液枪吸取适量CaCl2溶液反复吸打沉淀，将EP管置于冰上25min，4000×g低温离心5min，倒掉EP管中的废液。
(5)在超净工作台内吸取适量CaCl2溶液反复吸打菌体沉淀，然后将感受态分装，-80℃保存。
4.冻融法转化农杆菌
(1)用移液枪吸取重组质粒3μL，转移至100μLLBA4404感受态细胞中，轻柔混匀。
(2)将混合体系置于冰上5min，液氮5min，37℃水浴孵育5min，然后立刻转移冰浴3min。
(3)在超净工作台内用移液枪取YEP培养基800μL，恒温摇床28℃、150rpm条件下复苏4h。
(4)室温条件下5，000×g离心2min，用适量上清重悬菌体，取复苏菌液200μL在筛选平板培养基上涂布均匀，28℃倒置培养3d。
5.农杆菌转化子的鉴定
挑取单菌落于YEP液体培养基(Rif，Kan)中，提取质粒，进行酶切鉴定。
结果如图3和图4所示：
利用Nco1和Pml1限制性内切酶将pMDTM18-T-GmERF5未突变质粒和pCAMBIA3301的空载体质粒进行双酶切，经过琼脂糖凝胶电泳，胶回收得到10.3kb左右大小的载体片段和600bp左右大小的基因片段。根据T4-DNA连接酶的步骤连接，转化大肠杆菌E.coli DH5α，获得重组质粒pCAMBIA3301-GmERF5的单克隆菌液。重组质粒转入农杆菌LBA4404，通过双酶切检测证明GmERF5已成功连接在植物表达载体上(图3)。
设计特异引物经PCR扩增目的片段后分别正反连接到植物表达载体pFGC5941，创造一个转录区域的发夹结构。然后，将酶切鉴定和测序分析正确的重组质粒pFGC5941-ERF5转入农杆菌LBA4404。经双酶切检测证明正反两个目的片段分别连接到了植物表达载体pFGC5941上(图4)。
实施例3
大豆遗传转化
1.培养基成分
(1)萌发培养基(GM)
组成成分：1.0mg/L 6-BA+0.8％琼脂+2％蔗糖+B5盐，pH 5.8。
(2)共培养基(CCM)
液体培养基组成成分：3％蔗糖+B5盐+3.9g/L MES+0.1mg/L GA3+1.67mg/L6-BA+200μMAS，pH 5.4。
固体培养基组成成分：3％蔗糖+B5盐+3.9g/LMES+200μMAS+0.1mg/L GA3+1.67mg/L6-BA+0.8％琼脂+0.158g/LNa2S2O3+0.154g/LDTT+1.0g/LL-Cys，pH 5.4。
(3)恢复培养基(SIM)
组成成分：0.8％琼脂+3％蔗糖+B5盐+植物激素(500mg/L Cef、1.67mg/L 6-BA、0.59g/L MES)，pH 5.6。
(4)伸长培养基(SEM)
组成成分：3％蔗糖+B5盐+0.8％琼脂+植物激素(100mg/L L-Pyr+50mg/L L-Asp+0.59g/L MES+250mg/L Cef+0.5mg/L GA3+0.1mg/L IAA+1.0mg/LZR)，pH 5.6。
(5)生根培养基(RM)
组成成分：0.8％琼脂+2％蔗糖+1mg/L IBA+0.59g/LMES+B5盐，pH 5.6。
2.农杆菌子叶节转化法及大豆植株再生
(1)选取质量良好的“东农50”大豆种子，通风橱内利用氯气灭菌法灭菌16h。
(2)在萌发培养基中将无菌的种子种下，组培室25℃培养5d。
(3)将萌发的无菌大豆幼苗，切除下胚轴，将大豆沿中线纵向剖开，去除顶芽、腋芽，在子叶节处轻轻地划3刀。
(4)菌液摇至OD600＝0.5，12000rpm离心，加入侵染液体重悬，并将划好的子叶节外植体，置入其中，28℃，120rpm，30min条件下震荡。
(5)将所侵染的子叶节外植体吸干菌液，近轴面置于CCM固体培养基上，摆放整齐，在组培室内避光暗培养3d。
(6)子叶节置入无菌水中清洗3次，用灭过的滤纸吸去液体，将其插入恢复固体培养基上，组培室内培养15d。
(7)将长至1-2cm的抗性芽，切下插入伸长培养基，组培室内15d。
(8)待伸长苗发育健壮，将其插入生根培养基中直立培养20d。
(9)当伸长苗长出适量根，将其移除放置于掺有蛭石的腐植土中，然后，在温室内培育大豆转化植株。
实施例4
GmERF5转基因大豆的检测及鉴定：
1.PCR检测GmERF5转基因大豆植株
(1)大豆基因组DNA的提取(SDS小量法)
1)取0.1g叶片于液氮中快速研磨，加入400μL提取液(500mM NaCl；50mM EDTA，PH＝8.0；10mMβ-巯基乙醇；100mM Tris-HCl，PH＝8.0)，充分混匀。
2)加入80μL 10％SDS，混匀。
3)65℃水浴10min，颠倒混匀，重复3次。
4)加入5M的KAC 100μL，涡旋6sec，放置在碎冰上冰浴30min。
5)涡旋20sec，加入等体积的氯仿/异戊醇(24：1)，12000rpm离心15min。
6)取500μL上层溶液，加入500μL氯仿/异戊醇(24：1)，颠倒混匀萃取DNA，12000rpm离心10min。
7)取500μL上层溶液，加入500μL的异丙醇，颠倒5-6次，置于-20℃中静止30min。
8)12000rpm离心5min，弃去上清液体，加入70％酒精吹打2次，静止吹干，加去离子水20-50μL，回溶，-20℃保存。
2.转基因植株的RT-PCR检测
(1)引物设计
在温室培养转化植株至V2期，通过SDS小量法提取叶片DNA，利用RT-PCR检测转化植株是否具有外源基因bar，引物序列为：
F(SEQ ID NO.13)：ATATCCGAGCGCCTCGTGCAT
R(SEQ ID NO.14)：GGTCTGCACCATCGTCAACCACT
(2)对bar基因进行PCR检测。
(3)用琼脂糖凝胶电泳检测其PCR扩增产物。
2.Western Blot检测过表达GmERF5转基因大豆植株
将经bar引物检测为阳性的GmERF5过表达转基因大豆植株，用Anti-myc抗体进行western blot检测GmERF5-myc融合蛋白。取0.2g bar引物检测的阳性植株叶片在超低温条件下充分研磨，其中加入适量的蛋白质缓冲液(l00 mM HEPES，pH＝7.5；5mM EDTA；5％甘油；l0 mM DTT；1mM PMSF；10μg/mL蛋白酶抑制剂)，待其充分溶解后，4℃、13000rpm、离心20min，取上清，加入适量5×蛋白上样缓冲液，混匀后进行蛋白变性(沸水水浴10min)。
(1)主要溶液配制：
1)电泳液缓冲液：25mM Tris，0.25M甘氨酸，0.1％SDS；
2)转移缓冲液：25mM Tris，0.25M甘氨酸，0.1％SDS，20％甲醇；
3)TBS缓冲液：100mM Tris-HCl PH＝7.5，150mM NaCl；
4)TBST缓冲液：含0.05％Tween20的TBS缓冲液；
5)封闭液：含5％脱脂奶粉的TBST缓冲液。
(2)SDS-PAGE电泳
取20μL变性后的蛋白样品在浓缩胶进行电泳(60V)，溴酚蓝指示剂转至分离胶后将电泳电压调至120V，溴酚蓝指示剂迁移至分离胶底部时停止电泳。
(3)转膜
1)准备与胶大小相同PVDF膜，将PVDF膜放入甲醇中浸泡3-5min。
2)将两块海绵垫、两张3mm滤纸、玻璃棒、转膜用的夹子侵入转膜液中。
3)装配转移三明治：在夹子黑的一面上依次放海绵垫、滤纸、胶、PVDF膜、滤纸、海绵垫，每层放好后用轻轻用玻璃棒擀去气泡，将夹子合上锁紧。
4)电极方向对应正确地将锁紧的夹子放入转移槽中，80V冰浴转移1.5h。
(4)蛋白免疫反应
1)将PVDF膜移至封闭液中，室温下摇动封闭1h。
2)将PVDF膜移至含有一抗(Anti-myc，abcam；ab9108，稀释5000倍)的TBST溶液中，室温孵育1h。
3)用10mL的TBST清洗PVDF膜，室温摇动10min，重复一次，然后用TBS清洗PVDF膜，室温摇动10min。
4)将PVDF膜移至含有二抗(辣椒根过氧化酶HRP，Merck Millipore)的TBST溶液中，室温孵育1h。
5)用10mL的TBST清洗PVDF膜，室温摇动10min，重复一次，然后用TBS清洗PVDF膜，室温摇动10min。
6)用滤纸将膜上的液体吸干。
(5)化学发光
1)将ECL的A液和B液分别取500μL混合后加到膜上，使膜充分润湿。
2)将膜放到化学发光成像系统(天能5500)中进行分析。
3.Southern Blot检测干扰GmERF5转基因大豆植株
参照地高辛标记检测试剂盒(DIG High Prime DNA Labeling andDetectionStarter Kit)进行操作。
(1)DIG探针标记(随机引物法)
1)以含有bar基因的PCAMBIA3301质粒为模板，通过PCR扩增出bar基因，并进行胶回收，加无菌水定容至16μL。
2)沸水水浴10min后，冰浴10min，加入4μL 1号液，混匀，标记反应条件：37℃，20h；终止反应条件：65℃，10min。
3)-20℃保存备用。
(2)植物基因组DNA的制备
基因组DNA的提取方法参照1。
(3)基因组DNA的酶切及纯化
酶切体系：
10×Tango Buffer：20μL
HindIII：10μL
DNA150：μL
RNase free H2O：20μL
混匀后，37℃温育16h。
参照OMGEADNA纯化试剂盒说明书进行基因组DNA纯化。
(4)凝胶处理
1)将酶切后的基因组DNA和质粒用1％琼脂糖凝胶进行电泳，25V，过夜。
2)当DNA跑到大概凝胶三分之二的位置时，将凝胶取出，切去凝胶多余部分后放置至饭盒中。
3)加入200mL变性液(没过凝胶)，室温摇动30min，更换新的200mL变性液，再室温摇动30min。
4)去除变性液，用无菌超纯水冲洗一次。
5)加入200mL中和液(没过凝胶)，室温摇动30min，更换新的200mL中和液，再室温摇动30min。
(5)印记
1)取一个瓷盘，加入大约1L的20×SSC溶液。
2)将一块玻璃板放置在瓷盘上，裁取一张能够两端浸没在溶液中大小的3mm滤纸，将它铺在玻璃板上，使滤纸充分吸收液体，去除滤纸与玻璃板间的气泡。
3)将中和处理后地凝胶取出，放在玻璃板上的3mm滤纸上，去除滤纸与胶之间的气泡。
4)裁剪一块大小与凝胶大小一致的尼龙膜和两块与凝胶大小一致的3mm滤纸，将在20×SSC溶液浸泡的尼龙膜覆盖在凝胶上，然后再取一张经过2×SSC溶液预处理的3mm滤纸，平铺在尼龙膜上，除去气泡。
5)将同等大小的吸水纸覆盖在3mm滤纸上，在吸水纸上放置重物，使之紧密接触，利用虹吸法使DNA向上迁移，且及时更换新的吸水纸，保持16-20h。
6)将转移后的尼龙膜，DNA印记面向上，1200J，紫外交联3min。
(6)预杂交与杂交
1)将紫外交联后的尼龙膜，放到杂交瓶中，印记方在内，加入适量的7号液，7号液提前预热至42℃，去除气泡，然后于42℃的杂交炉中预杂交2h，杂交炉转速为20rpm。
2)向杂交瓶中加入新的含有10μL探针的7号液，放入杂交炉，杂交20h。
(7)洗膜与显影
1)将杂交膜从杂交瓶中取出，置于瓷盘中，加入100mL洗膜液Ⅰ，室温摇动10min，更换新的洗膜液Ⅰ再洗涤10min，去除洗膜液Ⅰ。
2)加入100mL洗膜液Ⅱ，65℃摇动洗涤15min，去除洗膜液Ⅱ，再重复1次。
3)加入100mL新配置的1×Blocking solution溶液中，摇床摇60min，去除1×Blocking solution。
4)加入10mLAntibody solution溶液中，振荡摇30min，去除Antibody solution。
5)加入100mLWashing buffer溶液，室温摇动15min，去除Washing buffer，再重复1次。
6)加入20mLDetection buffer溶液中，室温下静置2-5min，去除Detectionbuffer。
7)将尼龙膜吸干，放到杂交袋里，加入1mL底物液(5号液)，室温避光静置10min，37℃温浴10min。
8)在暗室中，经过显影，定影后得到杂交结果。
(8)主要溶液成分
变性液：1.5M NaCl、0.5M NaOH。
中和液(PH＝8.0)：0.5M Tris-HCl、1.5M NaCl。
20×SSC(PH＝7.0)：3M NaCl、0.3M柠檬酸钠。
Maleic acidbuffer(PH＝7.5)：0.15MNaCl、0.1M Maleic acid。
Detectionbuffer(PH＝9.5)：0.1M Tris-HCl、0.1M NaCl。
洗膜液Ⅰ：50ml 20×SSC(PH＝7.0)，5mL 10％SDS，定容至500mL。
洗膜液Ⅱ：12.5ml 20×SSC(PH＝7.0)，5mL 10％SDS，定容至500mL。
1×Blocking solution：20mL 6号液和180mLMaleic acidbuffer(PH＝7.5)混匀。
Washingbuffer：含3％Tween 20的Maleic acidbuffer(PH＝7.5)。
结果如图5-9所示：
利用SDS小量法提取T3代GmERF5过表达转基因植株的DNA，以其为模板通过RT-PCR检测外源基因bar，获得bar基因阳性植株(图5)。利用western blot进一步进行检测，经western blot检测得到3株GmERF5-OE转基因植株(图6)。
利用SDS小量法提取T3代GmERF5-RNAi转基因植株的DNA，以其为模板通过RT-PCR检测外源基因bar，获得bar基因阳性植株(图7)。利用Southern blot进一步进行检测，已检测得到3株GmERF5-RNAi转基因植株(图8)。
qRT-PCR分析证实，GmERF5在T3 GmERF5-OE转基因大豆植株中的表达量显著高于野生型植株，在T3 GmERF5-RNAi转基因大豆植株中表达量显著低于野生型植株(图9)。
实施例5
GmERF5转基因大豆植株的抗旱性分析：
1.试验材料的处理
将GmERF5-OE、GmERF5-RNAi转基因大豆T3代种子和“东农50”(WT)种植于蛭石：土为1：1的土壤中，置于光温培养箱完全保水灌溉生长21d(光周期14h，温度25℃、相对湿度为60％)。对21d龄GmERF5-OE和GmERF5-RNAi转基因大豆和野生型大豆幼苗停灌8d，诱导干旱胁迫。观察转基因株系的耐旱表型，并拍照。然后，对枯萎植株进行复水恢复生长，记录转基因大豆在2d后的抗旱表型。
2.气孔孔径的测量
采集大豆植株的第二三叶叶片，立即用透明胶带将叶片的下表皮粘贴起来，放在显微镜下观察气孔的形态。使用ViewPoint软件测量图像中的气孔孔径。
3.超氧化物歧化酶活性的测定
参照Ukeda的WST-8法，并采用苏州科铭生物技术公司的超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒测定毛状根的SOD活性。
将0.1g样品放在1.5mL EP管中，加入1mL粗酶提取液，放置在冷冻研磨仪中研磨成匀浆后，14000rpm，4℃，离心10min，取上清置于新的1.5mL EP管中，作为待测样本。按照试剂盒说明书将100μL试剂三与4.9mL的蒸馏水混合，记做A1液；取50mL试剂一与250μL试剂二混合，记做A2液；将100μL试剂四溶解于5mL的水中，记做A3液。在1mL比色皿中依次加入50μL待测样本(对照组加50μL蒸馏水)(V样)、50μLA1液、800μLA2液和100μLA3液，即反应体系总体积为1mL，混匀静置30min后，用分光光度计分别测定对照管和测定管在450nm处的吸光值，记做A对照和A测定。
参照BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天)说明书测定样本的蛋白浓度(Cpr)。配制0.5mg/mL的蛋白标准液，设置5个20μL体系的标定样，蛋白浓度分别为0、0.05、0.2、0.4和0.5mg/mL，同时将适量待测样本也稀释到20μL。向上述装有标准蛋白液和待测样本的样品管中加入200μLBCA工作液混匀，置于37℃反应25min。取出样品管，用超微量分析仪测定各样品管内反应液在540-595nm波长的吸光值。以蛋白标准液浓度(mg/mL)为横坐标，吸光值为纵坐标，计算出蛋白标准曲线，利用待测样本的吸光值计算其对应的蛋白浓度记做Cpr(mg/mL)。
按照以下公式对样本中SOD的活性进行计算：
抑制百分率(P)＝[(A对照－A测定)/A对照]×100％
SOD活性(U/mgprot)＝[P/(1－P)×V反总]/(V样×Cpr)
4.过氧化物酶活性的测定
参照Kochba等的方法，采用苏州科铭生物技术公司的过氧化物酶(POD)试剂盒测定毛状根的POD活性。
将0.1g样品放在1.5mL EP管中，用1mL粗酶提取液低温研磨成匀浆后，14000rpm，4℃，离心10min，取上清溶液作为待测样本。分别取试剂盒中的试剂一26mL、试剂二15μL和试剂三10μL于50mL离心管中，混匀后作为工作液。按照试剂盒说明书向1mL比色皿中依次加入50μL待测样本(V样)和950μL工作液混匀(V反总)，用分光光度计分别测定470nm下反应1min时的吸光值A1和反应2min时的吸光值A2，即反应的时间为1min。
参照BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天)说明书测定样本的蛋白浓度(Cpr)。
按照以下公式对样本中POD的活性进行计算：
POD(U/mgprot)＝[(A2-A1)×V反总/(V样×Cpr)]÷0.01/T
实验结果：如图10-14所示。
正常浇水状态下(WW)，WT、GmERF5-OE和GmERF5-RNAi转基因植株长势一致，无明显差异；干旱处理4d后(D1)，GmERF5-OE转基因植株的对生叶片轻度萎蔫，三出复叶无变化；WT植株的对生叶片中重度萎蔫，三出复叶轻度萎蔫；GmERF5-RNAi转基因植株的对生真叶重度萎蔫，三出复叶中度萎蔫，处理8d(D2)后，GmERF5-OE植株叶片中重度萎蔫；WT植株叶片对生真叶重度萎蔫，生长点中度萎缩，GmERF5-RNAi转基因植株叶片全部萎蔫，且茎尖生长点重度萎缩。复水2d(RW)后，GmERF5-RNAi转基因植株和野生型植株生长点坏死，未恢复生长，而GmERF5-OE植株叶片生长点良好，植株恢复生长(图10)。通过以上结果证明过表达GmERF5能够提高大豆植株的抗旱性。
为了进一步探究GmERF5的抗旱机制，观察了WW、D1、D2以及RW组的GmERF5-OE、GmERF5-RNAi转基因植株以及WT植株的气孔状态。如图11和图12所示：在中度干旱D1及重度干旱D2处理下，GmERF5-OE转基因植株的气孔关闭程度显著高于WT植株，而GmERF5-RNAi转基因植株的气孔关闭程度显著低于WT植株。以上结果表明：干旱胁迫下GmERF5能够通过降低气孔孔径来减少水分损失，从而减轻叶片萎蔫，保持较高的相对含水量。
如图13所示：WW组的GmERF5-OE、WT和GmERF5-RNAi转基因植株中SOD的活性无显著差异；D1以及D2组的GmERF5-OE转基因植株的SOD活性显著高于WT(*P<0.05)，GmERF5-RNAi转基因植株的SOD活性显著低于WT(*P<0.05)；RW组的GmERF5-OE、WT和GmERF5-RNAi转基因植株中SOD的活性无显著差异。以上结果说明干旱胁迫下过表达GmERF5可以通过提高大豆植株中SOD酶的活性来增强大豆的耐干旱能力。
如图14所示：WW组的GmERF5-OE、WT和GmERF5-RNAi转基因植株中POD的活性无显著差异；D1以及D2组的GmERF5-OE转基因植株的POD活性显著高于WT植株(**P<0.01)，GmERF5-RNAi转基因植株的POD活性显著低于WT植株(*P<0.05)；RW组的GmERF5-OE、WT和GmERF5-RNAi转基因植株中SOD的活性无显著差异。以上结果表明干旱胁迫下过表达GmERF5可以通过提高大豆植株中SOD酶和POD酶的活性来增强大豆的耐干旱能力。
实施例6
GmERF5转基因大豆植株的耐盐性分析：
1、将WT，GmERF5-OE和GmERF5-RNAi转基因大豆种子种植于蛭石中，分别用含0mMNaCl，150mM NaCl，250mM NaCl和350mM NaCl的水浇灌，置于光温培养箱生长3d(光周期14h，温度25℃、相对湿度为60％)，观察其萌发和根长。
2、为进一步测定转基因植株中的相关生理指标，将WT、GmERF5-OE和GmERF5-RNAi转基因大豆植株种植于蛭石：土为1：1的土壤中，置于光温培养箱完全保水灌溉生长21d(光周期14h，温度25℃、相对湿度为60％)，分别对21d龄WT、GmERF5-OE和GmERF5-RNAi转基因大豆幼苗用0mM NaCl和250mM NaCl的水浇灌，24h后分别取样测定其抗氧化酶SOD和POD的活性。
结果如图15和16所示：0mM NaCl处理下GmERF5-OE、GmERF5-RNAi以及WT的萌发状态无明显差异；150mM NaCl和250mM NaCl处理下GmERF5-OE转基因大豆种子的胚根长度极显著长于WT的胚根长度(**P<0.01)；而350mM NaCl处理下，只有GmERF5-OE转基因大豆种子轻微地萌发。以上结果表明：过表达GmERF5能够提高转基因大豆种子的耐盐性。
对21d龄的转基因大豆植株和WT植株利用250mMNaCl处理浇灌，并测定其SOD、POD的活性。如图17和18所示：NaCl处理后，GmERF5-OE转基因植株的SOD活性极显著高于WT植株(**P<0.01)，GmERF5-RNAi转基因植株的SOD活性显著低于WT植株(*P<0.05)；GmERF5-OE转基因植株的POD活性极显著高于WT植株(**P<0.01)，GmERF5-RNAi转基因植株的POD活性显著低于WT植株(*P<0.05)以上结果表明过表达GmERF5可以提升抗氧化酶活性进而提高GmERF5-OE转基因大豆植株的耐盐性。
实施例7
干旱及盐胁迫下GmERF5转基因大豆植株中GmPOD1表达量分析：
具体操作参照实施例1、5和6。
实验结果：如图19所示。
由图19所示，GmERF5-OE转基因大豆植株在干旱和250mM NaCl处理后，GmPOD1的表达量极显著高于WT和GmERF5-RNAi(**P<0.01)，综上所述，过表达GmERF5可以提高GmPOD1的表达量增强POD活性来提高大豆的抗旱性及耐盐性。
由以上实施例可知，本发明过表达GmERF5基因通过提高转基因大豆植株抗氧化酶活性，增强大豆对干旱和盐胁迫的耐受性，为提高大豆抗旱及耐盐性提供了一种新的调控基因资源。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种GmERF5基因在改变植株抗旱性和/或耐盐性中的应用，在植株中过表达GmERF5基因，提高植株的抗旱性和/或耐盐性；在植株中敲低GmERF5基因的表达，降低植株的抗旱性和/或耐盐性。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述GmERF5基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述GmERF5基因编码蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述过表达GmERF5基因的方法包括以下步骤：
将GmERF5基因克隆至pCAMBIA3301载体中，得到重组载体；
将所得重组载体转化至发根农杆菌，用转化得到的发根农杆菌侵染种子得到转基因复合体植株，实现GmERF5基因的过表达。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述敲低GmERF5基因表达的方法包括以下步骤：
将GmERF5基因克隆至pFGC5941载体中，得到重组载体；
将所得重组载体转化至发根农杆菌，用转化得到的发根农杆菌侵染种子得到转基因复合体植株，实现GmERF5基因敲低表达。
6.一种过表达GmERF5基因的重组载体，其特征在于，所述重组载体包括初始表达载体和GmERF5基因。
7.根据权利要求6所述的GmERF5基因的重组载体，其特征在于，所述初始表达载体为pCAMBIA3301载体。
8.一种敲低GmERF5基因的表达的重组载体，其特征在于，所述重组载体包括pFGC5941载体和GmERF5基因。
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