CN117510628A - 一种制备红细胞膜单克隆抗体的快速新型免疫方法 - Google Patents
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Abstract
本发明的目的在于提供一种制备红细胞膜单克隆抗体的快速新型免疫方法，通过将人血细胞稀释液超声破碎后与完全佐剂混匀免疫Balb/c小鼠，7天后尾静脉注射红细胞膜蛋白，5天后取免疫小鼠脾细胞与红细胞膜蛋白体外孵育1‑2天，隔天将SP2/0细胞与小鼠脾细胞在聚乙二醇(PEG)的介导下发生融合。本发明缩短了免疫周期，操作简便，另外可获得高效价的红细胞膜单克隆抗体。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种制备红细胞膜单克隆抗体的快速免疫制备方法。
背景技术
单克隆抗体是由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体。
单克隆抗体技术的基本原理为：小鼠受到外界抗原刺激后可诱发免疫反应，产生相应的抗体，这一职能是由B淋巴细胞来承担的；肿瘤细胞在体外培养的条件下可以无限传代，是“永久”的细胞。把小鼠的骨髓瘤细胞与经免疫过的小鼠的脾细胞在聚乙二醇(PEG)等方式的介导下发生融合，融合后的杂交瘤细胞具有两种亲本细胞的特性，一方面可以分泌特定的抗体,另一方面也具备了肿瘤细胞无限增殖的能力,可在体外培养条件下或移植到体内无限增殖,从而分泌大量单克隆抗体。
传统杂交瘤方式制备单克隆抗体来源稳定、后期易制备、产量高，是免疫检测分析和疾病早期筛查使用最为普遍的抗体。制备良好的小鼠杂交瘤单克隆抗体涉及很多技术环节，包括抗原的设计筛选、动物免疫、细胞融合筛选技术、抗体的纯化方法等，每一个技术环节都缺一不可，本发明主要涉及红细胞膜单克隆抗体的快速免疫制备等技术方面。
传统人红细胞膜单克隆抗体制备的免疫方式为，取人血红细胞抗凝处理之后，再经过PBS漂洗离心，然后与完全佐剂、不完全佐剂乳化混匀，历经3-8周的免疫时间，多次注射小鼠背部皮下或者腹腔。然后取小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合，经过后续操作制备得抗人红细胞膜单克隆抗体。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速、高效的红细胞膜单抗新型研发方法，主要是红细胞膜单克隆抗体制备中的快速免疫方法以及红细胞处理方法，具体通过首次免疫将人血细胞稀释液超声破碎后再与完全佐剂混匀免疫Balb/c小鼠背部皮下，7天后尾静脉注射红细胞膜蛋白为第二次免疫，5天后取免疫小鼠脾细胞与红细胞膜蛋白体外孵育1-2天为末次免疫，隔天将SP2/0细胞与小鼠脾细胞在聚乙二醇(PEG)的介导下发生融合。经过后续常规操作可获得高效价的红细胞膜单克隆抗体。本发明缩短了免疫周期，操作简便。
本发明提供技术方案如下：
本发明改进红细胞膜单抗制备过程中的免疫方法，进行快速、高效的红细胞膜单抗新型研发方法的建立，包括如下步骤：
S1、取人血红细胞抗凝处理后，生理盐水漂洗离心，制备终浓度为1*10^7个/ml的红细胞稀释液；
S2、超声破碎红细胞稀释液，获得红细胞悬液；
S3、选择6-8周龄的雌性Balb/c小鼠，进行分组饲养；
S4、完全佐剂与S2中红细胞悬液按1:1的体积比例充分乳化混匀，以150-300ul/只对小鼠进行皮下多点注射；
S5、初次免疫7天后，低渗溶血法粗提红细胞膜蛋白，制成5mg/ml红细胞膜蛋白溶液；
S6、小鼠尾静脉注射25-50ug红细胞膜蛋白；
S7、二次免疫5天后，处死小鼠，制备脾细胞悬液，并与终浓度为5mg/ml的红细胞膜蛋白孵育1-2天；
S8、隔天将脾细胞与SP2/0细胞按照5:1-10:1的比例充分混匀，在聚乙二醇(PEG)的介导下发生融合；
S9、培养10天后，对融合细胞进行阳性筛选。
本发明筛选阳性率达到80-90％，而常规免疫操作融合仅达到40-50％。进一步的，根据S1中的操作步骤，取人血红细胞抗凝处理后，生理盐水漂洗离心3次，制备终浓度为1*10^7个/ml的红细胞稀释液。
进一步的，根据S2中的操作步骤，超声破碎红细胞稀释液，超声功率200W，超声4S，间隔8S，超声99次。
进一步的，根据S4中的操作步骤，完全佐剂与上述红细胞悬液按1:1的体积比例充分乳化混匀，以150-300ul/只对小鼠进行皮下多点注射。进一步的，根据S5中的操作步骤，初次免疫7天后，低渗溶血法粗提红细胞膜蛋白，制成5mg/ml红细胞膜蛋白溶液。
进一步的，根据S6中的操作步骤，小鼠尾静脉注射25-50ug红细胞膜蛋白。
进一步的，根据S7中的操作步骤，二次免疫5天后，处死小鼠，制备脾细胞悬液，并与终浓度为5mg/ml的红细胞膜蛋白孵育1-2天。进一步的，根据S8中的操作步骤，隔天将脾细胞与SP2/0细胞按照5:1-10:1的比例充分混匀，在聚乙二醇(PEG)的介导下发生融合。进一步的，根据S9中的操作步骤，培养10天后，用ELISA间接法对融合细胞进行阳性筛选。
本发明与传统方法的区别在于人血细胞的处理方式以及免疫部位不同；现有技术例如《抗人红细胞膜抗非凝集型单克隆抗体的研制及特性鉴定》中制备红细胞膜抗原中也对红细胞膜进行了超声处理，但是其是超声乳化细胞膜，是一种乳化方式，我们是直接超声细胞，然后用这个破碎液和佐剂用注射器上下吹打的方式进行乳化，常规免疫一般每次免疫都是背部、皮下，或者腹腔。我们每次免疫都换处理和免疫方法，先超声处理，后尾静脉注射红细胞膜蛋白，最后孵育。
有益效果：
(1)本发明中，通过超声破碎红细胞免疫小鼠，尾静脉注射红细胞膜蛋白，并与脾细胞悬液混合孵育培养，快速、高效制备红细胞膜单克隆抗体。
(2)本发明中，红细胞膜蛋白直接注入尾静脉，通过血液循环可以让抗原快速到达脾脏，更有利于B细胞快速分泌高特异性抗体。
(3)本发明中，红细胞膜蛋白与脾细胞直接孵育，可以让抗原直接刺激脾脏，更有利于B细胞分泌高特异性抗体。
(4)本发明中，免疫时间由常规3-8周缩短至15天左右，免疫过程中单只小鼠免疫细胞使用量由常规4*10^6-8*10^6个减少至2*10^6，提高血清抗体效价，降低实验成本。
附图说明
图1为红细胞膜单抗新型研发方法的流程图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行完整清晰的描述。
完全佐剂购买自sigma公司。
本发明提供的技术方案：参照图1，红细胞膜单抗新型研发方法的建立，包括以下步骤：
步骤一、取人血红细胞抗凝处理后，生理盐水漂洗离心3次，制备终浓度为1*10^7个/ml的红细胞稀释液；
步骤二、超声破碎红细胞稀释液，获得红细胞悬液，超声功率为200W，超声4S，间隔8S，超声99次。
步骤三、选择6-8周龄的雌性Balb/c小鼠，进行分组饲养；
步骤四、完全佐剂与上述红细胞悬液按1:1的体积比例充分乳化混匀，以150-300ul/只对小鼠进行皮下多点注射；
步骤五、初次免疫7天后，低渗溶血法粗提红细胞膜蛋白，制成5mg/ml红细胞膜蛋白溶液；
步骤六、小鼠尾静脉注射25-50ug红细胞膜蛋白；
步骤七、二次免疫5天后，处死小鼠，制备脾细胞悬液，并与终浓度为5mg/ml的红细胞膜蛋白孵育1-2天；
步骤八、隔天将脾细胞与SP2/0细胞按照5:1-10:1的比例充分混匀，在聚乙二醇(PEG)的介导下发生融合；
步骤九、培养10天后，用ELISA间接法对融合细胞进行阳性筛选。
该免疫方法是通过将人血细胞稀释液超声破碎后与完全佐剂混匀免疫Balb/c小鼠，7天后尾静脉注射红细胞膜蛋白，5天后取免疫小鼠脾细胞与红细胞膜蛋白体外孵育1-2天，隔天将SP2/0细胞与小鼠脾细胞在聚乙二醇(PEG)的介导下发生融合，在经过后续的检测和筛选等。可以根据不同的细胞表面抗原种类注射不同的细胞数量，已达到最佳免疫效果。
传统免疫方式：
传统方法制备红细胞膜单抗：取人血红细胞抗凝处理之后，再经过PBS漂洗离心，然后完全佐剂与红细胞稀释液按体积比乳化混匀进行初免。后续为不完全佐剂与红细胞稀释液按体积比乳化混匀进行再此免疫，免疫部位多为背部、腹腔皮下多点。免疫周期为3-8周。再经后续步骤制备抗红细胞膜单抗。与本方法进行对比，得到数据如表1所示：
表1：实验数据表
由上述实验数据可以看出，该红细胞膜单抗新型研发方法的建立，在实施时，具有免疫时间短、免疫方法简单、提高筛选阳性效率，提高抗体效价。
为了对本方法进行更好的说明
以下列实施例中单克隆抗体制备的免疫过程为例：
实施例1
以CA19-9单克隆抗体制备的免疫过程为例：
1)超声破碎COLO 205细胞(外购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)，获得COLO 205细胞悬液。超声功率为200W，超声4S，间隔8S，超声99次。
2)准备免疫所需6-8周龄的雌性Balb/c小鼠。
3)完全佐剂与上述COLO 205细胞悬液按1:1的体积比例充分乳化混匀，以150ul/只对小鼠进行皮下多点注射；
4)初次免疫7天后，小鼠尾静脉注射COLO 205细胞膜表面蛋白CA19-9抗原25ug；
5)二次免疫5天后，处死小鼠，制备脾细胞悬液，并与终浓度为5mg/ml的CA19-9蛋白孵育1天；
6)隔天将脾细胞与SP2/0细胞按照5:1的比例充分混匀，在聚乙二醇(PEG)的介导下发生融合；
7)用ELISA间接法对融合细胞进行阳性筛选；
融合阳性率达到90％，所得抗体效价>1:25600，以上明显优于上述传统免疫方式制制备CA19-9单克隆抗体所得的抗体效价1:12800。
实施例2
以Cyfra21-1单克隆抗体制备的免疫过程为例：
(1)超声破碎SW620细胞(外购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)，获得该细胞悬液。超声功率为200W，超声4S，间隔8S，超声99次。
(2)准备免疫所需6-8周龄的雌性Balb/c小鼠。
(3)完全佐剂与上述SW620细胞悬液按1:1的体积比例充分乳化混匀，以150ul/只对小鼠进行皮下多点注射；
(4)初次免疫7天后，小鼠尾静脉注射SW620细胞表面蛋白Cyfra21-1蛋白抗原25ug。
(5)二次免疫5天后，处死小鼠，制备脾细胞悬液，并与终浓度为5mg/ml的Cyfra21-1蛋白抗原孵育1天。
(6)隔天将脾细胞与SP2/0细胞按照5:1的比例充分混匀，在聚乙二醇(PEG)的介导下发生融合。
用ELISA间接法对融合细胞进行阳性筛选。
(7)融合阳性率达到85％，所得抗体效价>1:25600，以上明显优于上述传统免疫方法制备Cyfra21-1单克隆抗体所得效价1:12800。
实施例3
以AFP单克隆抗体制备的免疫过程为例：
(1)超声破碎Huh-7细胞(外购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)，获得该细胞悬液。超声功率为200W，超声4S，间隔8S，超声99次。
(2)准备免疫所需6-8周龄的雌性Balb/c小鼠。
(3)完全佐剂与上述Huh-7细胞悬液按1:1的体积比例充分乳化混匀，以150-300ul/只对小鼠进行皮下多点注射；
(4)初次免疫7天后，小鼠尾静脉注射AFP抗原25ug。
(5)二次免疫5天后，处死小鼠，制备脾细胞悬液，并与终浓度为5mg/ml的AFP抗原孵育1天。
(6)隔天将脾细胞与SP2/0细胞按照5:1的比例充分混匀，在聚乙二醇(PEG)的介导下发生融合。
(7)用ELISA间接法对融合细胞进行阳性筛选。
(8)融合阳性率达到90％，所得抗体效价>1:25600，以上明显优于上述传统免疫方法制备AFP单克隆抗体所得1:10000。
尽管已对上述实施案例进行了详细的描述，对于本领域的技术而言，可以在不脱离本发明的原理的情况下可以对本实施案例进行适当的修改和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限。
Claims (10)
1.一种制备红细胞膜单克隆抗体的快速免疫方法，其特征在于：初免时超声破碎人血红细胞，与完全佐剂混匀免疫小鼠；
第二次免疫时尾静脉注射提取的人血细胞膜蛋白；
最后一次免疫时取人血细胞膜蛋白与脾细胞共同孵育。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括下列步骤：
(1)取人血红细胞抗凝处理后，生理盐水漂洗离心3次，制备红细胞稀释液；
(2)超声破碎红细胞稀释液，获得红细胞悬液；
(3)选择6-8周龄的雌性Balb/c小鼠，进行分组饲养；
(4)完全佐剂与步骤(2)的红细胞悬液充分乳化混匀，对小鼠进行皮下多点注射；
(5)初次免疫7天后，低渗溶血法粗提红细胞膜蛋白，制成红细胞膜蛋白溶液；
(6)小鼠尾静脉注射25-50ug红细胞膜蛋白；
(7)二次免疫5天后，处死小鼠，制备脾细胞悬液，并与终浓度为5mg/ml的红细胞膜蛋白孵育1-2天；
(8)将脾细胞与SP2/0细胞充分混匀，在聚乙二醇的介导下发生融合；
(9)培养10天后，对融合细胞进行阳性筛选。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(1)中制备成终浓度为1*10^7个/ml的红细胞稀释液。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中超声条件为超声功率200W，超声4S，间隔8S，超声99次。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(4)中完全佐剂与红细胞悬液按1:1的体积比例混匀。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(4)中以150-300ul/只对小鼠进行皮下多点注射。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(5)中制成5mg/ml红细胞膜蛋白溶液。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(6)中免疫注射部位为尾静脉，且注射剂量为25-50ug。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(8)中脾细胞与SP2/0细胞按照5:1-10:1的细胞数量比例混匀。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(9)中用ELISA间接法对融合细胞进行阳性筛选。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1920571A (zh) * | 2005-08-23 | 2007-02-28 | 河南省生物工程技术研究中心 | 畜禽疫病、药物残留自身红细胞凝集快速检测法 |
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2023
- 2023-11-15 CN CN202311525781.1A patent/CN117510628A/zh active Pending
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