CN117503662B - 一种双液相发酵溶胞产物的制备工艺及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及护肤品技术领域，进一步的，涉及一种双液相发酵溶胞产物的制备工艺及其应用。包括以下步骤：S1、制备双液相发酵培养基：将植物提取液、油相、乳化剂、水于三角瓶中混合均匀后进行高温灭菌、冷却至室温即得；S2、需氧发酵培养：将发酵菌株接入双液相发酵培养基中在恒温震荡培养器中进行需氧发酵培养，得发酵混合物；S3、微射流均质：将发酵混合物采用微射流提取器（微孔孔径为800µm）进行处理后即得双液相发酵溶胞产物；本发明将双液相发酵技术与植物提取技术结合，加快了菌种发酵速度，提高生产效率；在应用上，使得植物水溶性与油溶性活性成分富集到成品中，加强了成品的功效。
Description
技术领域
本发明涉及护肤品技术领域，进一步的，涉及一种双液相发酵溶胞产物的制备工艺及其应用。
背景技术
双液相发酵体系是指在发酵液中加入一种新的与水相互不溶作为氧载体的液相，从而提高溶氧效果，减少发酵体系中气液传氧阻力，提高传氧效率或解除产物的抑制作用。双液相发酵工艺可以大大提高生产效率，提高微生物转化能效。
目前，双液相在我国多应用于能源、医药和食品领域，氧载体主要有液态烷烃、油酸、甲苯、酯类等；但是由于能源、医药所使用的氧载体例如乙酸乙酯或三氯甲烷在化妆品中应用时都不允许添加，因此双液相工艺在化妆品领域中应用受到了限制。
植物油由于安全、环保，作为氧载体已经应用于生物技术领域，例如中国专利CN201310143845公开了一种双液相系统发酵法降解植物甾醇制备雄烯二酮，发酵培养基水相选用无菌蒸馏水，油相可选用米糠油、葵花油、大豆油和花生油，在发酵转化完成后，通过膜分离方法，得到含有雄烯二酮的溶液，经浓缩、脱色、过滤、浓缩、重结晶和真空干燥等操作可得到纯度在99%以上的雄烯二酮。但是目前采用植物油双液相发酵工艺得到的产物用于化妆品仍未见报道。
发明内容
本发明第一方面提供了一种双液相发酵溶胞产物的制备工艺，包括以下步骤：
S1、制备双液相发酵培养基：将植物提取液、油相、乳化剂、水于三角瓶中混合均匀后进行高温灭菌、冷却至室温即得；
S2、需氧发酵培养：将发酵菌株接入双液相发酵培养基中在恒温震荡培养器中进行需氧发酵培养，得发酵混合物；
S3、微射流均质：将发酵混合物采用微射流提取器（微孔孔径为800µm）进行处理后即得双液相发酵溶胞产物；
所述植物提取液，按重量份计，原料包括：牡丹花20~50份、玫瑰花10~40份、牡丹皮10~40份；
所述植物提取液的制备方法，包括以下步骤：
S1、按重量份，称取牡丹花、玫瑰花和牡丹皮；
S2、将牡丹花、玫瑰花和牡丹皮混合均匀并采用低温微射流提取器进行提取得混合溶液；
S3、将混合溶液依次采用卧式螺旋离心机、高速分离机、反渗透膜进行过滤即得；
所述油相为植物油；所述植物油选自牡丹籽油、菜籽油、玫瑰果油中的任意一种；
所述乳化剂为非离子聚甘油酯类乳化剂、非离子糖基乳化剂、非离子甘油酯类乳化剂中的任意一种；
所述聚甘油酯类乳化剂为聚甘油-3甲基葡糖二硬脂酸酯；
所述非离子糖基乳化剂为鲸蜡硬脂基葡糖苷；
所述非离子甘油酯类乳化剂选自甘油硬脂酸酯SE、甘油硬脂酸酯柠檬酸酯中的任意一种。
优选的，所述植物提取液制备过程中S2采用低温微射流提取器（微孔孔径为800µm）进行提取的条件为：加料速度为12~18L/min、温度为25~30℃、搅拌转速为400~800rpm、搅拌时间为20~40min。
优选的，所述卧式螺旋离心机的转速为3000~5000rpm，时间为20~40min。
优选的，所述高速分离机的转速为9000~11000rpm，时间为20~40min。
优选的，所述反渗透膜的孔径为0.4~0.6nm。
牡丹花和玫瑰花中含有维生素、氨基酸、可溶性糖和生物碱等水溶性成分；牡丹皮中含有苯酚及苷类、单萜及其苷类、三萜类等脂溶性成分；若采用传统的提取工艺，例如煎煮法、超声提取法等，会导致提取液中有效成分提取总含量低以及不同提取成分之间的含量相差较大；为了解决这一问题，本申请采用微孔孔径为800μm的微射流提取器进行提取，并且控制提取条件：温度为25~30℃，转速为400~800rpm，加料速度为12~18L/min，搅拌时间为20~40min；在提高提取液中有效成分总含量的同时也可以均衡不同的有效成分之间的含量，本申请人还发现当其进行后续双液相发酵时，更有利于微生物的生长，得到的发酵溶胞产物具有优异的抗氧化效果；本申请人猜测是因为采用微射流提取器进行提取可以对牡丹花、玫瑰花、牡丹皮进一步破壁，解决了菌种无法快速降解植物一些类似木质纤维素的物质，提高了菌种对植物活性成分吸收转化效率，从而更有利于微生物的生长。
优选的，所述植物油选自牡丹籽油或菜籽油中的任意一种。
优选的，所述植物油为牡丹籽油。
理论来说，油相作为一种氧载体，采用溶氧量较高的油相，会有利于双液相发酵体系中微生物生长，但是本请人在探究过程中意外发现，油相为矿油或植物来源合成油时，得到的发酵混合物经稀释过后在平板涂布时几乎没有发现菌种，除此之外本申请人还发现油相的选择还会影响发酵混合物的乳化效果；当油相为矿油时发酵混合物没有乳化作用。而当油相为植物油时，尤其是当植物油选自牡丹籽油、菜籽油、玫瑰果油中的任意一种时，制备得到的发酵混合物中的微生物不仅生长状态良好，而且发酵混合物具有良好的乳化效果，制备得到的发酵溶胞产物具有优异的抗氧化剂性。本申请人猜测一方面是因为矿油和植物来源合成油所存在的物理毒性会对营养物质的传递造成阻碍，导致细胞的生长受到影响；另一方面当油相为植物油，植物油为牡丹籽油、菜籽油、玫瑰果油中的任意一种时，在有利于微生物生长的同时还有利于油-水两液相之间的传质，有利于发酵混合物的乳化。
理论来说，乳化剂可以增加植物油的乳化程度，从而提高传氧速率，有利于微生物的生长，但是本申请人在实验探究过程中发现，并不是所有类型的乳化剂都有利于微生物的生长，同时，本申请人还发现，乳化剂的选择也会影响发酵混合物的乳化效果。当乳化剂为非离子聚甘油酯类乳化剂、非离子糖基乳化剂、非离子甘油酯类乳化剂中的任意一种；所述聚甘油酯类乳化剂为聚甘油-3甲基葡糖二硬脂酸酯；所述非离子糖基乳化剂为鲸蜡硬脂基葡糖苷；所述非离子甘油酯类乳化剂选自甘油硬脂酸酯SE、甘油硬脂酸酯柠檬酸酯中的任意一种时，可以在保证微生物生长的同时有利于发酵混合物的乳化效果。
优选的，所述植物提取液、油相、乳化剂、水的重量比为（40~80）:（5~25）：（4~16）：（11~33）。
优选的，所述植物提取液、油相、乳化剂、水的重量比为（70~80）:（5~10）：（4~8）：（11~12）。
在实验探究过程中，本申请人进一步发现，通过控制植物提取液、油相、乳化剂、水的重量比为（40~80）:（5~25）：（4~16）：（11~33），尤其是当植物提取液、油相、乳化剂、水的重量比为（70~80）:（5~10）：（4~8）：（11~12）时，既有利于微生物的生长，而且制备得到的发酵混合物具有良好的乳化效果，除此之外，得到的发酵溶胞产物在较低的浓度（0.5%）下具有优异的抗氧化性。
优选的，所述高温灭菌温度为100~121℃，时间为10~20min。
优选的，所述高温灭菌温度为110℃，时间为25min。
优选的，所述发酵菌株为清酒酵母或半乳糖酵母样菌。
优选的，所述发酵菌株为清酒酵母。
本申请人在探究过程中发现，当发酵菌株为清酒酵母时，清酒酵母在本申请体系中生长较为迅速，生长周期较短，更利于生长效率的提高。
优选的，所述发酵菌株的接入量以双液相发酵培养基的体积比计为2~20%。
优选的，所述发酵菌株的接入量以双液相发酵培养基的体积比计为8~15%。
优选的，所述发酵菌株的接入量以双液相发酵培养基的体积比计为10%。
优选的，所述需氧发酵培养的条件为：转速100~140rpm、温度为25~30℃、时间为48~72h。
优选的，所述需氧发酵培养的条件为：转速120rpm、温度为28℃、时间为72h。
优选的，所述微射流处理过程中处理的条件为：加料速度为10~15L/min、搅拌转速600~1000rpm、搅拌时间为20~60min。
本发明第二方面提供了一种双液相发酵溶胞产物的应用，将制备得到的双液相发酵溶胞产物用于制备护肤品。
优选的，所述护肤品包括但不限于面霜、乳液、精华液。
优选的，所述双液相发酵溶胞产物在护肤品中的添加量为1~5wt%。
优选的，所述双液相发酵溶胞产物在护肤品中的添加量为3wt%。
有益效果：
1、本申请采用微孔孔径为800μm的微射流提取器进行提取，并且控制提取条件：温度为25~30℃，转速为400~800rpm，加料速度为12~18L/min，搅拌时间为20~40min；在提高提取液中有效成分总含量的同时也可以均衡不同的有效成分之间含量的同时本申请人还发现当其进行后续双液相发酵时，更有利于微生物的生长，得到的发酵溶胞产物具有优异的抗氧化效果。
2、本申请当油相为植物油时，尤其是当植物油选自牡丹籽油或菜籽油中的任意一种时，制备得到的发酵混合物中的微生物不仅生长状态良好，而且发酵混合物乳化效果好，制备得到的发酵溶胞产物具有优异的抗氧化剂性。
3、本申请当乳化剂为非离子聚甘油酯类乳化剂或非离子糖基乳化剂；尤其是当聚甘油酯类乳化剂为聚甘油-3甲基葡糖二硬脂酸酯；非离子糖基乳化剂为鲸蜡硬脂基葡糖苷时，可以在保证微生物生长的同时有利于发酵混合物的乳化效果。
4、本申请控制植物提取液、油相、乳化剂、水的重量比为（40~80）:（5~25）：（4~16）：（11~33），尤其是当植物提取液、油相、乳化剂、水的重量比为（70~80）:（5~10）：（4~8）：（11~12）时，既有利于微生物的生长，而且制备得到的发酵混合物乳化效果好，除此之外，得到的发酵溶胞产物在较低的浓度（0.5%）下具有优异的抗氧化性。
5、本申请制备得到的双液相发酵溶胞产物在护肤品中的添加量为3wt%时，既可以达到优异的舒缓、抗炎效果以及控油和收敛毛孔的功效。
6、本申请相比于化妆品市场上常用的传统发酵技术，将双液相发酵技术与植物提取技术结合，在生产上加快了菌种发酵速度，提高生产效率；在应用上，使得植物水溶性与油溶性活性成分富集到成品中，加强了成品的功效。
附图说明
图1为实施例1添加乳化剂的双液相培养基菌种的生长情况（发酵液稀释1011倍）；
图中：左图为锥形瓶内发酵液的发酵状态；右图为平板涂布菌种生长情况。
图2为对比例3不添加乳化剂的双液相培养基菌种的生长情况（发酵液稀释1011倍）；
图中：左图为锥形瓶内发酵液的发酵状态；右图为平板涂布菌种生长情况。
图3为采用不同油相发酵终止时锥形瓶内发酵液的发酵状态；
图中：左图为矿物油、中间图为角鲨烷、右图为牡丹籽油。
图4为采用不同油相发酵24h后平板涂布菌种生长情况（发酵液稀释1010倍）；
图中：左图为牡丹籽油、中间图为矿油、右图为角鲨烷。
图5为采用不同油相发酵终止时平板涂布菌种生长情况（发酵液稀释1012倍）；
图中：左图为牡丹籽油、中间图为矿油、右图为角鲨烷。
图6为采用不同乳化剂发酵终止时锥形瓶内发酵液的发酵状态；
图中：左图为PEG-100硬脂酸酯、中间图为山嵛醇聚醚-25、右图为鲸蜡硬脂基葡糖苷。
图7为采用不同乳化剂发酵终止时锥形瓶内发酵液的发酵状态；
图中：左图为甘油硬脂酸酯柠檬酸酯、中间图为甘油硬脂酸酯SE、右图为鲸蜡硬脂醇聚醚-6。
图8为采用聚甘油-3甲基葡糖二硬脂酸酯发酵终止时锥形瓶内发酵液的发酵状态；
图9为采用不同乳化剂发酵终止时平板涂布菌种生长情况（发酵液稀释1011倍）；
图中：左图为PEG-100硬脂酸酯、中间图为山嵛醇聚醚-25、右图为鲸蜡硬脂基葡糖苷。
图10为采用不同乳化剂发酵终止时平板涂布菌种生长情况（发酵液稀释1011倍）；
图中：左图为甘油硬脂酸酯柠檬酸酯、中间图为甘油硬脂酸酯SE、右图为鲸蜡硬脂醇聚醚-6。
图11为采用聚甘油-3甲基葡糖二硬脂酸酯发酵终止时平板涂布菌种生长情况（发酵液稀释1011倍）。
图12为1号志愿者使用应用例2的精华VISIA红区图像；
图中：左图为0天、中间图为7天、右图为14天。
图13为2号志愿者使用应用例2的精华VISIA红区图像；
图中：左图为0天、中间图为7天、右图为14天。
图14为3号志愿者使用应用例2的精华VISIA紫质区图像；
图中：左图为0天、右图为7天。
具体实施方式
实施例1
实施例1提供了一种双液相发酵溶胞产物的制备工艺，包括以下步骤：
S1、制备双液相发酵培养基：将植物提取液、油相、乳化剂、水于三角瓶中混合均匀后进行高温灭菌、冷却至室温即得；
S2、需氧发酵培养：将发酵菌株接入双液相发酵培养基中在恒温震荡培养器中进行需氧发酵培养，得发酵混合物；
S3、微射流均质：将发酵混合物采用微射流提取器（微孔孔径为800µm）进行处理后即得双液相发酵溶胞产物；
所述植物提取液，按重量份计，原料包括：牡丹花50份、玫瑰花20份、牡丹皮30份；
所述植物提取液的制备方法，包括以下步骤：
S1、按重量份，称取牡丹花、玫瑰花和牡丹皮；
S2、将牡丹花、玫瑰花和牡丹皮混合均匀并采用低温微射流提取器（微孔孔径为800µm）进行提取得混合溶液；
S3、将混合溶液依次采用卧式螺旋离心机、高速分离机、反渗透膜进行过滤即得；
所述油相为植物油；所述植物油为牡丹籽油（牡丹籽压榨提取油）；
所述乳化剂为非离子聚甘油酯类乳化剂；所述聚甘油酯类乳化剂为聚甘油-3甲基葡糖二硬脂酸酯；
所述植物提取液制备过程中S2采用低温微射流提取器进行提取的条件为：加料速度为15L/min、温度为25℃、搅拌转速为600rpm、搅拌时间为30min。
所述卧式螺旋离心机的转速为4000rpm，时间为30min。
所述高速分离机的转速为10000rpm，时间为30min。
所述反渗透膜的孔径为0.5nm。
所述植物提取液、油相、乳化剂、水的重量比为70:10:8:12。
所述高温灭菌温度为110℃，时间为25min。
所述发酵菌株为清酒酵母。
所述发酵菌株的接入量以双液相发酵培养基的体积比计为10%。
所述需氧发酵培养的条件为：转速120rpm、温度为28℃、时间为72h。
所述微射流处理过程中处理的条件为：加料速度为15L/min、搅拌转速1000rpm、搅拌时间为30min。
实施例2
实施例2提供了一种双液相发酵溶胞产物的制备工艺，包括以下步骤：
S1、制备双液相发酵培养基：将植物提取液、油相、乳化剂、水于三角瓶中混合均匀后进行高温灭菌、冷却至室温即得；
S2、需氧发酵培养：将发酵菌株接入双液相发酵培养基中在恒温震荡培养器中进行需氧发酵培养，得发酵混合物；
S3、微射流均质：将发酵混合物采用微射流提取器（微孔孔径为800µm）进行处理后即得双液相发酵溶胞产物；
所述植物提取液，按重量份计，原料包括：牡丹花50份、玫瑰花10份、牡丹皮40份；
所述植物提取液的制备方法，包括以下步骤：
S1、按重量份，称取牡丹花、玫瑰花和牡丹皮；
S2、将牡丹花、玫瑰花和牡丹皮混合均匀并采用低温微射流提取器（微孔孔径为800µm）进行提取得混合溶液；
S3、将混合溶液依次采用卧式螺旋离心机、高速分离机、反渗透膜进行过滤即得；
所述油相为植物油；所述植物油为菜籽油（菜籽压榨提取油）；
所述乳化剂为非离子糖基乳化剂；所述非离子糖基乳化剂为鲸蜡硬脂基葡糖苷；
所述微射流提取器的微孔孔径为800µm。
所述植物提取液制备过程中S2采用低温微射流提取器进行提取的条件为：加料速度为15L/min、温度为25℃、搅拌转速为600rpm、搅拌时间为30min。
所述卧式螺旋离心机的转速为4000rpm，时间为30min。
所述高速分离机的转速为10000rpm，时间为30min。
所述反渗透膜的孔径为0.5nm。
所述植物提取液、油相、乳化剂、水的重量比为80:5:4:11。
所述高温灭菌温度为100℃，时间为25min。
所述发酵菌株为半乳糖酵母样菌。
所述发酵菌株的接入量以双液相发酵培养基的体积比计为5%。
所述需氧发酵培养的条件为：转速120rpm、温度为28℃、时间为48h。
所述微射流处理过程中处理的条件为：加料速度为15L/min、搅拌转速1000rpm、搅拌时间为40min。
实施例3
实施例3提供了一种双液相发酵溶胞产物的制备工艺，包括以下步骤：
S1、制备双液相发酵培养基：将植物提取液、油相、乳化剂、水于三角瓶中混合均匀后进行高温灭菌、冷却至室温即得；
S2、需氧发酵培养：将发酵菌株接入双液相发酵培养基中在恒温震荡培养器中进行需氧发酵培养，得发酵混合物；
S3、微射流均质：将发酵混合物采用微射流提取器（微孔孔径为800µm）进行处理后即得双液相发酵溶胞产物；
所述植物提取液，按重量份计，原料包括：牡丹花20份、玫瑰花40份、牡丹皮40份；
所述植物提取液的制备方法，包括以下步骤：
S1、按重量份，称取牡丹花、玫瑰花和牡丹皮；
S2、将牡丹花、玫瑰花和牡丹皮混合均匀并采用低温微射流提取器进行提取得混合溶液；
S3、将混合溶液依次采用卧式螺旋离心机、高速分离机、反渗透膜进行过滤即得；
所述油相为植物油；所述植物油为玫瑰果油（玫瑰果压榨提取油）；
所述乳化剂为非离子聚甘油酯类乳化剂；所述聚甘油酯类乳化剂为聚甘油-3甲基葡糖二硬脂酸酯；
所述植物提取液制备过程中S2采用低温微射流提取器（微孔孔径为800µm）进行提取的条件为：加料速度为15L/min、温度为25℃、搅拌转速为600rpm、搅拌时间为30min。
所述卧式螺旋离心机的转速为4000rpm，时间为25min。
所述高速分离机的转速为10000rpm，时间为25min。
所述反渗透膜的孔径为0.5nm。
所述植物提取液、油相、乳化剂、水的重量比为40:15:12:33。
所述高温灭菌温度为120℃，时间为15min。
所述发酵菌株为清酒酵母。
所述发酵菌株的接入量以双液相发酵培养基的体积比计为2%。
所述需氧发酵培养的条件为：转速120rpm、温度为28℃、时间为48h。
所述微射流处理过程中处理的条件为：加料速度为15L/min、搅拌转速1000rpm、搅拌时间为30min。
实施例4
实施例4提供了一种双液相发酵溶胞产物的制备工艺，包括以下步骤：
S1、制备双液相发酵培养基：将植物提取液、油相、乳化剂、水于三角瓶中混合均匀后进行高温灭菌、冷却至室温即得；
S2、需氧发酵培养：将发酵菌株接入双液相发酵培养基中在恒温震荡培养器中进行需氧发酵培养，得发酵混合物；
S3、微射流均质：将发酵混合物采用微射流提取器（微孔孔径为800µm）进行处理后即得双液相发酵溶胞产物；
所述植物提取液，按重量份计，原料包括：牡丹花50份、玫瑰花40份、牡丹皮10份；
所述植物提取液的制备方法，包括以下步骤：
S1、按重量份，称取牡丹花、玫瑰花和牡丹皮；
S2、将牡丹花、玫瑰花和牡丹皮混合均匀并采用低温微射流提取器（微孔孔径为800µm）进行提取得混合溶液；
S3、将混合溶液依次采用卧式螺旋离心机、高速分离机、反渗透膜进行过滤即得；
所述油相为植物油；所述植物油为牡丹籽油（牡丹籽压榨提取油）；
所述乳化剂为甘油硬脂酸酯柠檬酸酯；
所述植物提取液制备过程中S2采用低温微射流提取器进行提取的条件为：加料速度为15L/min、温度为25℃、搅拌转速为600rpm、搅拌时间为30min。
所述卧式螺旋离心机的转速为4000rpm，时间为40min。
所述高速分离机的转速为10000rpm，时间为40min。
所述反渗透膜的孔径为0.5nm。
所述植物提取液、油相、乳化剂、水的重量比为40:25:16:19。
所述高温灭菌温度为110℃，时间为25min。
所述发酵菌株为清酒酵母。
所述发酵菌株的接入量以双液相发酵培养基的体积比计为10%。
所述需氧发酵培养的条件为：转速120rpm、温度为28℃、时间为72h。
所述微射流处理过程中处理的条件为：加料速度为15L/min、搅拌转速1000rpm、搅拌时间为20min。
实施例5
实施例5提供了一种双液相发酵溶胞产物的制备工艺，包括以下步骤：
S1、制备双液相发酵培养基：将植物提取液、油相、乳化剂、水于三角瓶中混合均匀后进行高温灭菌、冷却至室温即得；
S2、需氧发酵培养：将发酵菌株接入双液相发酵培养基中在恒温震荡培养器中进行需氧发酵培养，得发酵混合物；
S3、微射流均质：将发酵混合物采用微射流提取器（微孔孔径为800µm）进行处理后即得双液相发酵溶胞产物；
所述植物提取液，按重量份计，原料包括：牡丹花50份、玫瑰花20份、牡丹皮30份；
所述植物提取液的制备方法，包括以下步骤：
S1、按重量份，称取牡丹花、玫瑰花和牡丹皮；
S2、将牡丹花、玫瑰花和牡丹皮混合均匀并采用低温微射流提取器（微孔孔径为800µm）进行提取得混合溶液；
S3、将混合溶液依次采用卧式螺旋离心机、高速分离机、反渗透膜进行过滤即得；
所述油相为植物油；所述植物油为玫瑰果油（玫瑰果压榨提取油）；
所述乳化剂为甘油硬脂酸酯SE；
所述植物提取液制备过程中S2采用低温微射流提取器进行提取的条件为：加料速度为15L/min、温度为25℃、搅拌转速为600rpm、搅拌时间为30min。
所述卧式螺旋离心机的转速为4000rpm，时间为20min。
所述高速分离机的转速为10000rpm，时间为20min。
所述反渗透膜的孔径为0.5nm。
所述植物提取液、油相、乳化剂、水的重量比为60:10:8:22。
所述高温灭菌温度为110℃，时间为25min。
所述发酵菌株为半乳糖酵母样菌。
所述发酵菌株的接入量以双液相发酵培养基的体积比计为20%。
所述需氧发酵培养的条件为：转速120rpm、温度为28℃、时间为24h。
所述微射流处理过程中处理的条件为：加料速度为15L/min、搅拌转速1000rpm、搅拌时间为40min。
对比例1
对比例1提供了一种发酵溶胞产物的制备工艺，其具体实施方式同实施例1，不同点在于，将油相和乳化剂均替换为植物提取液，即发酵培养基中：植物提取液与水的质量比为88:12。
对比例2
对比例2提供了一种植物提取液，其具体实施方式同实施例1，不同点在于，该植物提取液不进行发酵处理。
对比例3
对比例3提供了一种双液相发酵溶胞产物的制备工艺，其具体实施方式同实施例1，不同点在于，将乳化剂替换为植物提取液，即双液相发酵培养基中：植物提取液、油相与水的质量比为78:10:12。
对比例4
对比例4提供了一种双液相发酵溶胞产物的制备工艺，其具体实施方式同实施例1，不同点在于，所述油相为矿物油。
对比例5
对比例5提供了一种双液相发酵溶胞产物的制备工艺，其具体实施方式同实施例1，不同点在于，所述油相为角鲨烷。
对比例6
对比例6提供了一种双液相发酵溶胞产物的制备工艺，其具体实施方式同实施例1，不同点在于，所述乳化剂为PEG-100硬脂酸酯。
对比例7
对比例7提供了一种双液相发酵溶胞产物的制备工艺，其具体实施方式同实施例1，不同点在于，所述乳化剂为鲸蜡硬脂醇聚醚-6。
应用例1
应用例1提供了一种面霜，将实施例1制备得到的发酵溶胞产物应用于面霜中，配方见下表：
| 原料序号 | 商品名 | 标准中文名称 | 添加量%（质量百分比） |
| 1 | 水 | 水 | 65.870 |
| 2 | 甘油 | 甘油 | 0.5 |
| 3 | 赤藓糖醇 | 赤藓醇 | 3 |
| 4 | 透明质酸钠（120万分子量） | 透明质酸钠 | 0.05 |
| 5 | 尿囊素 | 尿囊素 | 0.1 |
| 6 | Dissolvine Na2 | EDTA 二钠 | 0.05 |
| 7 | TC-CARBOMER 340 | 卡波姆 | 0.1 |
| 8 | Aristoflex AVC | 丙烯酰二甲基牛磺酸铵/VP 共聚物 | 0.1 |
| 9 | EverMap ™ 160K | 鲸蜡醇磷酸酯钾 | 0.4 |
| 10 | Tago Care 450 | POLYGLYCERYL-3 METHYLGLUCOSE DISTEARATE聚甘油-3 甲基葡糖二硬脂酸酯 | 0.14 |
| 11 | 鲸蜡硬脂醇 | 鲸蜡硬脂醇 | 1.5 |
| 12 | SHEA BUTTERREFINED | 牛油果树（BUTYROSPERMUM PARKII）果脂 | 3.5 |
| 13 | Cetiol ININ | 异壬酸异壬酯 | 5 |
| 14 | DC345 Fluid | 环五聚二甲基硅氧烷、环戊硅氧烷 | 3.5 |
| 23 | BT-1143B | 聚二甲基硅氧烷、聚二甲基硅氧烷醇 | 1 |
| 15 | GTEH-SD | 甘油三（乙基己酸）酯 | 0.5 |
| 16 | COMPRITOL 888 CGATO | 甘油山梨酸酯 | 1.5 |
| 17 | SETHIMULSECUSHION 磷垫乳化剂 | 鲸蜡硬脂醇；甘油硬脂酸酯；硬脂酸；氢化卵磷脂；聚甘油-3甲基葡糖二硬脂酸酯 | 1.9 |
| 18 | BT-9102 | 乙烯基聚二甲基硅氧烷/聚甲基硅氧烷倍半硅氧烷交联聚合物 | 1 |
| 19 | DES | 琥珀酸二乙氧基乙酯 | 0.2 |
| 20 | Myritol 318 RC | 辛酸/癸酸甘油三酯 | 0.4 |
| 21 | 油溶樱花提取物J | 樱花（PRUNUS SPECIOSA）花提取物 | 1.06 |
| 22 | SIMULGEL INS 100 | 丙烯酸羟乙酯/丙烯酰二甲基牛磺酸钠共聚物、水、异十六烷、聚山梨醇酯-60、山梨坦异硬脂酸酯 | 1.2 |
| 23 | 精氨酸 | 精氨酸 | 0.1 |
| 24 | 1,3-BG(CosmeticQuality) | 丁二醇 | 3 |
| 25 | 馨鲜酮 | 对羟基苯乙酮 | 0.7 |
| 26 | 实施例1发酵溶胞产物 | 实施例1发酵溶胞产物 | 3 |
| 27 | BESTCARE 500 | 1,2-己二醇 | 0.6 |
| 28 | FH9000241 风铃草 | （日用）香精 | 0.015 |
| 29 | FH20290900 菊花2 | （日用）香精 | 0.015 |
所述面霜的制备方法为：
a.准确称量1-9项加入到乳化锅中，加热至85℃，搅拌30min至完全溶解；b.将10-20项加入到油相锅中加热至80-85℃，搅拌15min至完全溶解，溶解后加入21项，搅拌完全，将油相锅中料体抽入乳化锅中搅拌；
c.恒温将22项加入乳化锅中，开启均质，直至料体乳化完全，搅拌并保温10min；
d.降温至60℃加入23项，搅拌完全；
e.将24、25项加热至80℃溶解完全，备用；
f.待温度降至50℃加入剩余原料，检验完毕出料。
应用例2
应用例2提供了一种精华液，将实施例1制备得到的发酵溶胞产物应用于精华液中，配方见下表：
| 原料序号 | 商品名 | 标准中文名称 | 添加量% |
| 1 | 水 | 水 | 80.770 |
| 2 | 丙二醇 | 丙二醇 | 3 |
| 3 | SEPIMAX ZEN | 聚丙烯酸酯交联聚合物-6 | 0.3 |
| 4 | 赤藓糖醇 | 赤藓醇 | 3 |
| 5 | 透明质酸钠（120万分子量） | 透明质酸钠 | 0.05 |
| 6 | PHOSPHOLIPON80H | 氢化卵磷脂 | 1 |
| 7 | Cetiol ININ | 异壬酸异壬酯 | 3.5 |
| 8 | Myritol 318 RC | 辛酸/癸酸甘油三酯 | 0.5 |
| 9 | 鲸蜡硬脂醇 | 鲸蜡硬脂醇 | 0.16 |
| 10 | VITAMIN VEACETATE | 生育酚乙酸酯 | 0.25 |
| 11 | Tago Care 450 | POLYGLYCERYL-3 METHYLGLUCOSE DISTEARATE聚甘油-3 甲基葡糖二硬脂酸酯 | 0.14 |
| 12 | 1,3-BG(CosmeticQuality) | 丁二醇 | 3 |
| 13 | 馨鲜酮 | 对羟基苯乙酮 | 0.7 |
| 14 | 实施例1发酵溶胞产物 | 实施例1发酵溶胞产物 | 3 |
| 15 | BESTCARE 500 | 1,2-己二醇 | 0.6 |
| 16 | FH9000241 风铃草 | （日用）香精 | 0.015 |
| 17 | FH20290900 菊花2 | （日用）香精 | 0.015 |
所述精华液的制备方法为：
a.准确称量1-5项加入乳化锅中加热至80-85℃，搅拌30min至完全溶解；
b.将5-11项加入油相锅中加热至80-85℃，搅拌15min至完全溶解，将油相锅中料体抽入乳化锅中搅拌，开启均质，至料体乳化完全，搅拌并保温10min；
c.将12、13项加热至80℃至溶解完全，备用；
d.待温度降至50℃后加入剩余原料，搅拌完全，检验完毕出料。
性能测试：
一、双液相发酵溶胞产物的性能测试：将实施例1、实施例2得到的双液相发酵溶胞产物，对比例1得到的发酵溶胞产物和对比例2的植物提取液进行以下测试
1、体外抗氧化试验-DPPH自由基清除率测试
（1）试剂配制
精密称取DPPH粉末0.0100g，置于250mL容量瓶中，用95%乙醇水溶液溶解定容至250mL，得浓度为0.1mmol/L的DPPH试剂；
（2）测定方法
在10mL试管中依次加入4.0mL配好的DPPH溶液和1.0 mL 95wt%乙醇水溶液，混合摇匀，避光反应30min，稳定后，以95wt%乙醇水溶液为参比，在 517nm处测吸光值，记为A0；
在10mL试管中依次加入4.0mL配好的DPPH溶液和1.0mL待测试样溶液，混合摇匀，避光反应30min，稳定后，以95%乙醇为参比，在517nm 处测吸光值，记为Ar；
在10mL试管中依次加入4.0mL 95%乙醇溶液和1.0mL待测试样溶液，混合摇匀，避光反应30min，稳定后，以 95wt%乙醇水溶液为参比，在517nm处测吸光值，记为As；
每个实施例和对比例的双液相发酵溶胞产物及滤液分别配制成质量浓度为0.5%、1.0%、3.0%、5.0%的水溶液进行测试，为测试样品。
结果如表1所示：
表1
2、体外抗氧化试验-羟自由基清除率
（1）试剂配制
硫酸亚铁溶液：称取0.417g七水硫酸亚铁溶于水中，定容至100mL，现配现用。
0.3%过氧化氢溶液：量取1mL市售30%过氧化氢溶于水中，定容至100mL，现配现用。
Na2HPO4·柠檬酸缓冲液：称取3.516g磷酸氢二钠溶于水中，定容至100mL ；称取2.101g一水合柠檬酸溶于水中，定容至100mL ；8.82mL Na2HPO4与11.18mL 柠檬酸混合，调节pH至4.5。
甲基紫溶液：称取0.0021g甲基紫溶于水中，定容至100mL。
（2）测定方法
总反应体系为5mL
精密称取甲基紫溶液1mL、缓冲液1mL、样品溶液1mL、硫酸亚铁溶液1mL，最后加入H2O21mL，混匀，记为AS；
精密称取甲基紫溶液1mL、缓冲液1mL、蒸馏水1mL、硫酸亚铁溶液1mL，最后加入H2O21mL，混匀，记为A；
精密称取甲基紫溶液1mL、缓冲液1mL、蒸馏水3mL，混匀，记为A0；
混匀后在室温放置 5min 后，在分光光度计上以582nm 吸收波长配 1cm 比色皿测定各体系吸光度变化值 ΔA 并计算清除率 CR%。
计算公式：
AS：加入样品溶液反应后的吸光度
A：不加样品所测的吸光度
A0：显色剂的吸光度
附表：各试管试剂添加情况和添加顺序
结果如表2所示：
表2
3、体外抗氧化试验-ABTS自由基清除率
（1）试剂配置：
PBS溶液：称取8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4（3.63g Na2HPO4·12H2O）和0.24g KH2PO4，调pH=7.2并定溶至1000mL。
ABTS+：配制2.45mmol/L 过硫酸钾，用过硫酸钾溶解ABTS，配成7mmol/L ABTS储备液，在室温、避光条件下静置12h。
2.45mmol/L 过硫酸钾：配制100mL，取0.0662g过硫酸钾使用水定容至100mL。
7mmol/L ABTS储备液：取0.0384g ABTS，使用2.45mmol/L 过硫酸钾溶解，定容10mL，溶液呈墨绿色。
ABTS+：测定液：将ABTS+储备液以磷酸盐缓冲液(pH=7.2)稀释，使其吸光度在734nm波长处达到0.700±0.020。
每个实施例和对比例的双液相发酵溶胞产物及滤液分别配置成质量浓度为0.5%的水溶液进行测试。
（2）测定方法：
取4mL的ABTS+工作液→1mL样品→混合10s→25℃避光静置6min→在734nm处测定吸光值。以4mLPBS+1mL样品作为参比，记A样品；
取4mL的ABTS+工作液→1mLPBS→混合10s→25℃避光静置6min→在734nm处测定吸光值。以PBS作为参比，记A0。
结果如表3所示：
表3
二、应用例2的性能测试：（VISIA皮肤检测）
筛选14名志愿者，年龄范围在24-35岁，使用产品前使用VISIA检测红区、紫质和毛孔分值，且拍摄前需清洁面部。使用方法：不使用其他产品，每晚使用2-3ml精华涂抹全脸。精华使用7d和14d后再次检测红区、紫质和毛孔分值，结果见图12~图14以及表4~表5。
图12为1号志愿者使用应用例2的精华VISIA红区图像；
图中：左图为0天、中间图为7天、右图为14天；
红区分值数值越大，所代表炎症越严重。
图13为2号志愿者使用应用例2的精华VISIA红区图像；
图中：左图为0天、中间图为7天、右图为14天；
红区分值数值越大，所代表炎症越严重。
根据VISIA图像测试所示，1号志愿者使用应用例2配置成的精华液7d后，红区分值下降17.5%，14d后下降26.5%；2号志愿者使用应用例2配制而成的精华液7d后，红区分值下降5.5%，14d后下降15.5%。以此说明，使用应用例2所配置出来的精华液具有正向的舒缓及抗炎功效。
图14为3号志愿者使用应用例2的精华VISIA紫质区图像；
图中：左图为0天、右图为7天。
根据VISIA图像测试所示，3号志愿者使用应用例2配置成的复方精华液7d后，毛孔分值下降5.2%，紫区分值下降4.8%。以此说明，使用应用例2所配置出来的精华液具有正向的控油及收敛毛孔功效。
表4
表5
Claims (5)
1.一种双液相发酵溶胞产物的制备工艺，其特征在于，包括以下步骤：
S1、制备双液相发酵培养基：将植物提取液、油相、乳化剂、水于三角瓶中混合均匀后进行高温灭菌、冷却至室温即得；
S2、需氧发酵培养：将发酵菌株接入双液相发酵培养基中在恒温震荡培养器中进行需氧发酵培养，得发酵混合物；
S3、微射流处理：将发酵混合物采用微射流提取器进行处理后即得双液相发酵溶胞产物；
所述植物提取液，按重量份计，原料包括：牡丹花20~50份、玫瑰花10~40份、牡丹皮10~40份；
所述植物提取液的制备方法，包括以下步骤：
S1、按重量份，称取牡丹花、玫瑰花和牡丹皮；
S2、将牡丹花、玫瑰花和牡丹皮混合均匀并采用低温微射流提取器进行提取得混合溶液；
S3、将混合溶液依次采用卧式螺旋离心机、高速分离机、反渗透膜进行过滤即得；
所述油相为植物油；所述植物油选自牡丹籽油、菜籽油、玫瑰果油中的任意一种；
所述乳化剂为非离子聚甘油酯类乳化剂、非离子糖基乳化剂、非离子甘油酯类乳化剂中的任意一种；
所述聚甘油酯类乳化剂为聚甘油-3甲基葡糖二硬脂酸酯；
所述非离子糖基乳化剂为鲸蜡硬脂基葡糖苷；
所述非离子甘油酯类乳化剂选自甘油硬脂酸酯SE、甘油硬脂酸酯柠檬酸酯中的任意一种；
所述植物提取液、油相、乳化剂、水的重量比为（40~80）:（5~25）：（4~16）：（11~33）；
所述植物提取液制备过程中S2采用低温微射流提取器进行提取的条件为：加料速度为12~18L/min、温度为25~30℃、搅拌转速为400~800rpm、搅拌时间为20~40min；
所述发酵菌株为清酒酵母或半乳糖酵母样菌；
所述发酵菌株的接入量以双液相发酵培养基的体积比计为2~20%；
所述需氧发酵培养的条件为：转速100~140rpm、温度为25~30℃、时间为48~72h。
2.根据权利要求1所述的双液相发酵溶胞产物的制备工艺，其特征在于，所述发酵菌株的接入量以双液相发酵培养基的体积比计为8~15%。
3.根据权利要求2所述的双液相发酵溶胞产物的制备工艺，其特征在于，所述微射流处理过程中的处理的条件为：加料速度为10~15L/min、搅拌转速600~1000rpm，搅拌时间为20~60min。
4.一种根据权利要求1~3任一项所述的制备工艺制备得到的双液相发酵溶胞产物在制备护肤品中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述双液相发酵溶胞产物在护肤品中的添加量为1~5wt%。
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