CN117486828A - 一种光控释放onoo－的化合物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种光控释放ONOO－的化合物及其制备方法和应用。本发明提供的ONOO‑供体由二苯吩噻嗪类似物和精氨酸共价连接而成，其较强的共轭效应使得其有极强的光响应能力，该聚合物具有近红外光发射，同时具有优异的活性氧、活性氮产生能力。当L6在660nm激光照射下会产生超氧阴离子和单线态氧，单线态氧氧化精氨酸的胍基产生NO，·O2 ‑和NO生成过氧亚硝酸盐(ONOO‑)，达到对高效杀伤肿瘤细胞的目的。因而该化合物是一种潜在高效杀伤肿瘤的光敏剂。这种杀伤方式与普通光敏剂相比具有更强的氧化和硝化损伤细胞能力，且开发周期相对于其它光敏药物短，因而可以在临床治疗当中具有很大的潜在应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种光控释放ONOO-的化合物及其制备方法和应用。
背景技术
恶性肿瘤是目前威胁人类健康的重大疾病，在手术切除、化疗、放疗等癌症诊疗方面仍不尽如人意。如今，作为“明星”分子，过氧亚硝酸盐(ONOO-)作为一种内源性信号分子和多种病理生理过程的参与者，如血管调节、蛋白质硝化和氧化，越来越受到关注。此外，ONOO-是一种有效的氧化剂和亲核试剂，成为一种有效的癌症治疗策略。然而，它在癌症治疗中的应用取得了有限的成功，主要是由于实体瘤的细胞内环境，包括缺氧，弱酸性pH，某些酶的过表达以及在生物系统中ONOO-的短暂瞬时特征(≈1-20ms)。因此，最大化ONOO-病变介导的毒性是获得良好治疗结果不可或缺的先决条件，但这仍然是一项具有挑战性的任务。在生物系统中，ONOO-的形成来源于一氧化氮(NO)和超氧自由基(·O2 -)。由于其前体物种的瞬态性质和ONOO-的化学特性本身，直接生成是极其困难的。与自发释放NO供体相比，刺激响应性NO释放为以安全可控的方式内源性智能释放NO提供了一套工具。精氨酸作为蛋白质生物合成所必需的α氨基酸。1988年，Palmer等人证明精氨酸是一种具有出色生物相容性的天然NO供体。NO是在生理条件下在NO合酶(NOS)存在下由精氨酸末端胍基团的氮原子产生的。此外，精氨酸可以被ROS氧化释放NO。另外，超氧阴离子作为Type I型活性氧由于在肿瘤缺氧微环境可以高效杀伤而被广受关注。目前NO释放和·O2 -生成的刺激源往往不同，通常同时利用两种内源性刺激(如GSH)或外源性刺激(光、超声、x射线等)来触发NO释放和·O2 -生成。与单刺激相比，双刺激更为繁琐。刺激顺序的差异和操作者的个体差异明显影响ONOO-产生的剂量和速率。因此，单一刺激的ONOO-生成策略可能更具吸引力。在这些刺激中，光，特别是近红外(NIR)光作为触发可能是一个很好的选择，因为它可以方便和精确地定位所需的位置，具有很高的时空分辨率。此外，与紫外线或可见光相比，近红外光具有较低的组织副作用和更好的组织穿透深度。因此，合成光控一体化释放ONOO-供体分子是本发明的宗旨。
发明内容
本发明的目的是提供一种光控释放ONOO-的化合物及其制备方法和应用，其在近红外I区660nm光照射下产生超氧阴离子和单线态氧，单线态氧氧化胍基产生NO，超氧阴离子和NO原位高效产生ONOO-，对4T1细胞具有高效杀伤，该光敏剂(光控释放ONOO-的化合物)具有近红外光发射，同时具有优异的活性氧和活性氮产生能力，是一类潜在的应用于抗肿瘤的有机光敏试剂。本发明的有机光敏剂(光控释放ONOO-的化合物)所采用的制备方法操作简单，条件温和，在抗肿瘤治疗方面有较高的应用价值。
为了达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：
一种光控释放ONOO-的化合物，所述光控释放ONOO-的化合物结构式为：
一种光控释放ONOO-的化合物制备方法，具体包括以下步骤：
步骤1、将化合物L1、L2和DMSO混合，然后加入重铬酸钾，室温搅拌后，接着加入甲醇和盐酸，用薄层色谱法监测反应，反应完成后，减压除去甲醇和水，将剩余溶液缓慢倒入饱和氯化钠中，蓝色沉淀物经过滤、收集、干燥，粗产物经硅胶柱层析纯化得到深蓝色固体，即化合物L3；
步骤2、将化合物L3、氢氧化钠水溶液和甲醇混合，回流，待反应体系冷却至室温，用稀硝酸调节溶液为酸性，然后用二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，旋除溶剂，经硅胶柱层析纯化得蓝黑色固体，即化合物L4；
步骤3、将化合物L4、精氨酸PBF甲酯盐酸盐、DMF、三乙胺和HATU混合，然后室温反应，反应完全后加入大量水，抽滤，柱层析分离得蓝黑色固体，即化合物L5；
步骤4、将化合物L5和TFA混合，然后室温反应，反应结束后，加入冷乙醚，抽滤得到黑色固体L6，即光控释放ONOO-化合物；
所述化合物L3的结构式为：
所述化合物L4的结构式为：
所述化合物L5的结构式为：
进一步，所述步骤1中L1、L2与重铬酸钾的摩尔比为1～1.5:1:0.75～1.5。
进一步，所述步骤1中甲醇与盐酸的体积比为10:1。
进一步，所述步骤1中室温搅拌的时间为20min，继续在室温下搅拌的时间为40min。
进一步，所述步骤2中L3与氢氧化钠水溶液的摩尔比为1:3～6。
进一步，所述步骤2中回流温度为75℃，回流时间为1h。
进一步，所述步骤3中化合物L4、精氨酸PBF甲酯盐酸盐、三乙胺和HATU的摩尔比为1:1～2:3～7:2～3。
进一步，所述步骤4中化合物L5与TFA的摩尔质量比为1:40～60，反应时间为0.5h。
一种光控释放ONOO-的化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明提供的L6溶解在DMSO中，用水稀释后再使用。
与现有技术相比本发明具有以下优点：
本发明提供的ONOO-供体由二苯吩噻嗪类似物和精氨酸共价连接而成，其较强的共轭效应使得其有极强的光响应能力，该聚合物具有近红外光发射，同时具有优异的活性氧、活性氮产生能力。当L6在660nm激光照射下会产生超氧阴离子和单线态氧，单线态氧氧化精氨酸的胍基产生NO，·O2 -和NO生成过氧亚硝酸盐(ONOO-)，达到对高效杀伤肿瘤细胞的目的。因而该化合物是一种潜在高效杀伤肿瘤的光敏剂。这种杀伤方式与普通光敏剂相比具有更强的氧化和硝化损伤细胞能力，且开发周期相对于其它光敏药物短，因而可以在临床治疗当中具有很大的潜在应用价值。
附图说明
图1为本发明光控释放ONOO-化合物L6在水中的紫外吸收光谱图；
图2为本发明光控释放ONOO-化合物L6在水中的荧光发射光谱图；
图3为本发明光控释放ONOO-化合物L6的单线态氧产生能力研究图；
图4为本发明光控释放ONOO-化合物L6的超氧阴离子产生能力研究图；
图5为本发明光控释放ONOO-化合物L6的NO产生能力研究图；
图6为本发明光控释放ONOO-化合物L6的ONOO-产生能力研究图；
图7为本发明光控释放ONOO-化合物L6在不同浓度下对4T1细胞的抗肿瘤性能研究图。
具体实施方式
以下给出本发明的具体实施例，用来对本发明的构成进行进一步说明。
实施例1
一种光控释放ONOO-化合物的制备
(1)在250mL圆底烧瓶中加入L1(1.40g，5.2mmol)和L2(1.052g，3.8mmol)和DMSO(20mL)，然后加入重铬酸钾(1.20g，4.05mmol)。室温搅拌20min后，加入200mL甲醇和20mL盐酸(2mol/L)。继续在室温下搅拌40min，用薄层色谱法监测反应。反应完成后，减压除去甲醇和水，将剩余溶液缓慢倒入100mL饱和氯化钠中。蓝色沉淀物经过滤、收集、干燥，粗产物经硅胶柱层析纯化(甲醇：二氯甲烷＝1:50，v/v)，得到产率为35％的深蓝色固体L3(596mg)。
1H NMR(600MHz,CDCl3)δ8.67(s,1H),8.48(s,1H),7.72(s,1H),7.55(s,2H),6.90(s,1H),6.66(s,1H),6.42(s,1H),4.23(s,2H),3.69(s,2H),3.43(s,4H),2.56(s,2H),2.15(s,2H),1.33(s,9H)；13C NMR(151MHz,CDCl3)δ173.37,153.33,150.60,139.29,136.83,133.72,132.82,132.05,130.72(d,J＝23.4Hz),129.43,124.68,124.08,123.37,116.59,104.49,101.85,60.70,45.75,43.68,31.07,23.66,14.24,12.76；HRMS-ESI forC26H30N3O2S+(m/z)448.2055[M]+。
(2)在50mL圆底烧瓶中加入L3(1.0g，2.1mmol)、10mL氢氧化钠水溶液(1mol/L)和10mL甲醇，75℃回流1h。待反应体系冷却至室温，用稀硝酸调节溶液pH＝3，然后用二氯甲烷(3×30mL)萃取三次，无水硫酸钠干燥，旋除溶剂，用极性为甲醇:二氯甲烷＝1:10过柱，得蓝黑色固体L4(483mg)，产率51％。
1H NMR(600MHz,CDCl3)δ8.85(s,1H),8.78(s,1H),7.83(s,1H),7.71(s,2H),6.99(s,1H),6.83(d,J＝4.1Hz,1H),6.74(s,1H),3.63(s,2H),3.58(s,4H),2.74(s,2H),2.20(s,2H),1.33(s,6H)；13C NMR(151MHz,CDCl3)δ178.75,154.47,150.06,139.28,136.47,135.69,133.12,131.43,130.88,130.34,129.35,125.83,125.11,124.77,115.21,104.56,103.39,47.42,45.52,36.64,29.71,23.58,12.81；HRMS-ESI for C24H26N3O2S+(m/z)420.1733[M]+。
(3)在25mL圆底烧瓶中依次加入化合物L4(200mg，0.43mmol)、精氨酸PBF甲酯盐酸盐(310mg，0.65mmol)，DMF(4mL)和三乙胺(298μL，2.15mmol)，然后一次性加入HATU(406mg，1.07mmol)，室温反应3h。反应完全后加入大量水析出固体，抽滤，干法上样，通过柱层析分离(极性为甲醇:二氯甲烷＝1:25)得蓝黑色固体L5(127mg)，产率32％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.81(s,1H),8.21(d,J＝7.9Hz,1H),7.85(d,J＝9.4Hz,1H),7.74(s,2H),7.14(d,J＝9.6Hz,1H),6.87(s,2H),4.54(s,1H),3.71(s,2H),3.61(s,2H),3.60(s,2H),3.21(s,2H),2.95(s,2H),2.70(s,2H),2.57(s,2H),2.50(s,3H),2.25–2.12(m,2H),2.07(s,3H),1.68(d,J＝56.9Hz,8H),1.45(s,6H),1.35(s,6H)；13C NMR(151MHz,CD3OD)δ174.14,172.64,158.41,152.92,151.27,139.90,137.86,137.09,133.32,132.88,132.73,132.03,131.94,130.78,129.34,124.89,124.63,121.94,117.38,116.99,104.66,101.77,86.29,56.21,56.07,55.93,53.39,52.25,51.49,46.58,45.45,43.68,42.47,32.37,28.22,27.27,23.85,18.17,11.72,11.06,7.80；HRMS-ESI forC44H56N7O6S2 +(m/z)842.3730[M]+。
(4)在25mL圆底烧瓶中依次加入L5(127mg，0.15mmol)和2mLTFA，室温反应0.5h，然后加入大量冷乙醚，析出固体，抽滤即可得到黑色固体L6(50mg)，产率53％。
1H NMR(400MHz,CD3OD)δ9.11(d,J＝8.2Hz,1H),8.35(s,1H),8.07(s,1H),7.92(s,1H),7.83(s,1H),7.40(s,2H),7.27(s,1H),4.45(dd,J＝8.8,5.2Hz,1H),3.71(s,6H),3.18(s,2H),2.54(s,2H),2.18(s,2H),1.65(s,2H),1.34(s,6H),1.30–1.25(m,2H)；13C NMR(151MHz,CD3OD)δ174.25,172.54,157.43,153.28,151.20,139.76,136.97,134.10,133.47,132.66,131.66,130.77,129.40,124.90,122.26,117.08,104.72,102.17,52.24,51.50,45.41,43.90,40.46,32.36,28.13,25.04,23.98,22.78,11.71,6.21；HRMS-ESI forC44H56N7O6S2 +(m/z)HRMS-ESI for C44H56N7O6S2 +(m/z)590.2896[M]+。
实施例2
(1)在250mL圆底烧瓶中加入L1(0.98g，3.8mmol)和L2(1.052g，3.8mmol)和DMSO(20mL)，然后加入重铬酸钾(0.84g，2.85mmol)。室温搅拌20min后，加入200mL甲醇和20mL盐酸(2mol/L)。继续在室温下搅拌40min，用薄层色谱法监测反应。反应完成后，减压除去甲醇和水，将剩余溶液缓慢倒入100mL饱和氯化钠中。蓝色沉淀物经过滤、收集、干燥，粗产物经硅胶柱层析纯化(甲醇：二氯甲烷＝1:50，v/v)，得到产率为30％的深蓝色固体L3(510mg)。
(2)在50mL圆底烧瓶中加入L3(1.0g，2.1mmol)、12.6mL氢氧化钠水溶液(1mol/L)和10mL甲醇，75℃回流1h。待反应体系冷却至室温，用稀硝酸调节溶液pH＝3，然后用二氯甲烷(3×30mL)萃取三次，无水硫酸钠干燥，旋除溶剂，用极性为甲醇:二氯甲烷＝1:10过柱，得蓝黑色固体L4(454mg)，产率48％。
(3)在25mL圆底烧瓶中依次加入化合物L4(200mg，0.43mmol)、精氨酸PBF甲酯盐酸盐(310mg，0.86mmol)，DMF(4mL)和三乙胺(417μL，3.01mmol)，然后一次性加入HATU(489mg，1.29mmol)，室温反应3h。反应完全后加入大量水析出固体，抽滤，干法上样，通过柱层析分离(极性为甲醇:二氯甲烷＝1:25)得蓝黑色固体L5(111mg)，产率28％。
(4)在25mL圆底烧瓶中依次加入L5(127mg，0.15mmol)和2.7mLTFA，室温反应0.5h，然后加入大量冷乙醚，析出固体，抽滤即可得到黑色固体L6(47mg)，产率50％。
实施例3
L6的紫外吸收和荧光发射光谱测试
配制1.6mmol L-1的L6的DMSO溶液1mL，准确移取125μL，溶于1875μL的水中，配成100μmol L-1的L6的溶液。稀释至20倍后，准确移取2.00mL浓度为5μmol L-1的L6的溶液至四通比色皿中，然后在HITACHI UH5300紫外吸收仪上测定。再准确移取2.00mL的浓度为5μmolL-1的L6的水溶液至比色皿中，然后在HITACHI F-4600荧光仪上测定，激发狭缝宽度为2.5nm，发射狭缝宽度为5.0nm。测试是在室温和外界大气压下进行。紫外吸收和荧光发射光谱测试结果分别见图1和图2。由图1可知：L6的最大吸收峰为665nm。由图2可知：当激发波长为665nm时，L6的荧光发射为710nm。
实施例4
L6产生单线态氧能力测试
采用DPBF检测1O2的产生。称量2.43mg的DPBF，溶解于3mL的无水乙醇中，避光4℃待用，将100μLDPBF乙醇溶液与100μL浓度为100μM L6溶液或40μL浓度为250μM的RB(标准II型光敏剂)溶液加入到无水乙醇中(总体积为2mL)，使得DPBF的最终浓度为150μM，L6与RB的最终浓度为5μM，空白对照组为1900μL乙醇和100μL水。之后用光强为1.0W/cm2的660nm照射配好的溶液50s，每隔10s测试一次，并记录波长为410nm处的吸光度值。所得测试结果见图3，说明本发明L6可以产生单线态氧。
实施例5
L6产生超氧阴离子能力测试
采用二氢乙锭(DHE)作为·O2-检测指示剂。称量1mg DHE溶解于1mL的DMSO溶液中，称量2mg小牛胸腺DNA(Ct DNA)于50mL离心管中，加入9.8mL 800μL的1×PBS(10mM，pH＝7.4)溶解，再取200μL浓度为1mg/mL的DHE DMSO母液加入其中，置于冰水上待用。向950μL浓度为20μM的DHE测试液中加入50μL浓度为100μM的L6水溶液，使得光敏剂的最终浓度为5μM，空白对照组为1mL的DHE测试液。之后1.0W/cm2的660nm照射5min，并且每隔1min记录波长为600nm处的荧光光谱变化(所用的激发波长为540nm)。所得测试结果见图4，说明本发明L6可以产生超氧阴离子自由基。
实施例6
L6产生活性氮能力测试
采用典型的Griess法定量脂质体中NO的释放。释放的NO与水接触后转化为硝酸盐或亚硝酸盐，然后与Griess试剂反应，最后转化为偶氮染料，可使用微孔板阅读器或UV-Vis吸收光谱(λ＝540nm)进行定量。为了鉴定L6是否在光照下产生NO，将含有5.0μM的L6溶液与Griess试剂混合后进行光照(1W/cm2，5min)。空白对照组为2mL的Griess试剂。每分钟记录540nm吸光度值。所得测试结果见图5，说明本发明L6可以产生NO。
实施例7
L6产生ONOO-能力测试
用L-酪氨酸作为探针检测L6生成ONOO-。在含有l-酪氨酸(0.5mM)的PBS(0.1M，pH＝8.2)中制备NaHCO3(15mM)溶液作为空白溶液。然后分别制备含有L6(5μM)的溶液，分别用660nm(1W/cm2，2min)照射。记录各组在406nm处的荧光强度，激发波长为313nm。所得测试结果见图6，说明本发明L6可以产生ONOO-。
L6对4T1细胞的杀伤效果测试：
1)4T1细胞的培养：
将4T1细胞在含10％胎牛血清和1％抗生素(青霉素100单位/mL、链霉素100.0μg/mL)的1640培养基中，在37℃5％CO2培养箱中培养。
2)对4T1细胞杀伤效率测试：
采用甲基噻唑基四唑(MTT)法检测L6对4T1细胞(培养基为含10％的胎牛血清(FBS)和1％双抗的1640培养基)的细胞活力。操作如下：4T1细胞以8000个细胞/孔的密度接种到96孔板里，之后在常氧培养箱中(37℃)培养12h，不同浓度的L6(0μM、0.625μM、1.25μM、2.5μM 5μM)的培养基孵育4h。设置光照组和黑暗组，光照组使用660nm照射(1W/cm2，7min)，暗组不做光照处理，光照之后再孵育4h。称量250mg MTT粉溶解于50mL的PBS中，过滤膜后使用，将MTT母液用培养基稀释10倍，加入细胞96孔板中，再次孵育3h，将旧培养基吸出，每孔加入100μL DMSO溶液。最后用酶标仪记录490nm处的吸光度值，所有数据均重复三次，取平均值、取得方差。图7为L6对4T1细胞的杀伤性能测试结果，由图7可知，L6能高效的杀伤4T1细胞。
本发明说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。尽管上面对本发明说明性的具体实施方式进行了描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。
Claims (10)
1.一种光控释放ONOO-的化合物，其特征在于，所述光控释放ONOO-的化合物结构式为：
2.如权利要求1所述的一种光控释放ONOO-的化合物制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
步骤1、将化合物L1、L2和DMSO混合，然后加入重铬酸钾，室温搅拌后，接着加入甲醇和盐酸，用薄层色谱法监测反应，反应完成后，减压除去甲醇和水，将剩余溶液缓慢倒入饱和氯化钠中，蓝色沉淀物经过滤、收集、干燥，粗产物经硅胶柱层析纯化得到深蓝色固体，即化合物L3；
步骤2、将化合物L3、氢氧化钠水溶液和甲醇混合，回流，待反应体系冷却至室温，用稀硝酸调节溶液为酸性，然后用二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，旋除溶剂，经硅胶柱层析纯化得蓝黑色固体，即化合物L4；
步骤3、将化合物L4、精氨酸PBF甲酯盐酸盐、DMF、三乙胺和HATU混合，然后室温反应，反应完全后加入大量水，抽滤，柱层析分离得蓝黑色固体，即化合物L5；
步骤4、将化合物L5和TFA混合，然后室温反应，反应结束后，加入冷乙醚，抽滤得到黑色固体L6，即光控释放ONOO-化合物；
所述化合物L3的结构式为：
所述化合物L4的结构式为：
所述化合物L5的结构式为：
3.根据权利要求2所述的一种光控释放ONOO-的化合物制备方法，其特征在于，所述步骤1中L1、L2与重铬酸钾的摩尔比为1～1.5:1:0.75～1.5。
4.根据权利要求2所述的一种光控释放ONOO-的化合物制备方法，其特征在于，所述步骤1中甲醇与盐酸的体积比为10:1。
5.根据权利要求2所述的一种光控释放ONOO-的化合物制备方法，其特征在于，所述步骤1中室温搅拌的时间为20min，继续在室温下搅拌的时间为40min。
6.根据权利要求2所述的一种光控释放ONOO-的化合物制备方法，其特征在于，所述步骤2中L3与氢氧化钠水溶液的摩尔比为1:3～6。
7.根据权利要求2所述的一种光控释放ONOO-的化合物制备方法，其特征在于，所述步骤2中回流温度为75℃，回流时间为1h。
8.根据权利要求2所述的一种光控释放ONOO-的化合物制备方法，其特征在于，所述步骤3中化合物L4、精氨酸PBF甲酯盐酸盐、三乙胺和HATU的摩尔比为1:1～2:3～7:2～3。
9.根据权利要求2所述的一种光控释放ONOO-的化合物制备方法，其特征在于，所述步骤4中化合物L5与TFA的摩尔质量比为1:40～60，反应时间为0.5h。
10.一种如权利要求1所述的光控释放ONOO-的化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
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