CN117467758A - Mef2a作为靶点的应用及药物的筛选方法、抑制mef2a的物质在制备药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本公开是关于MEF2A作为靶点的应用及药物的筛选方法、抑制MEF2A的物质在制备药物中的应用，涉及抑制细胞因子风暴技术领域。包括MEF2A作为靶点在筛选用于治疗细胞因子风暴的药物中的应用。特异性抑制MEF2A基因转录或翻译、特异性抑制MEF2A蛋白表达的物质在制备治疗细胞因子风暴的药物中的应用。MEF2A作为靶点在细胞因子风暴模型筛选治疗细胞因子风暴的药物的应用。筛选抑制或降低上述细胞因子风暴模型中MEF2A表达的物质的方法。
Description
技术领域
本公开涉及抑制细胞因子风暴技术领域，具体而言，涉及MEF2A作为靶点治疗细胞因子风暴的应用及药物的筛选方法、抑制MEF2A的物质在制备治疗细胞因子风暴的药物中的应用。
背景技术
细胞因子风暴是一种不受控制的全身性炎症综合征，可导致多器官衰竭甚至死亡，是恶性肿瘤或重症感染性患者死亡的重要原因，也是临床上疾病由轻/中症向重症/危重症转变的标志之一。当前针对细胞因子风暴的治疗，临床上仍以非选择性的糖皮质激素(临床上最为广泛而有效的抗炎和免疫抑制剂)和秋水仙碱治疗为主，然而，由于其严重的毒副作用，一般只在细胞因子风暴综合征的急性和危重期使用。
目前的研究主要关注靶向炎性细胞因子或调控炎症信号通路来控制细胞因子风暴，目前临床上用于治疗细胞因子风暴的靶向细胞因子的药物有：靶向IL6受体的妥珠单抗、靶向IL1受体的拮抗剂阿那白滞素、靶向TNFα的阿达木单抗等。这些药物均为靶向某一种促炎细胞因子或其受体发挥抑制作用。而细胞因子风暴是多个细胞因子同时过度表达和过度激活免疫反应，而细胞因子表达的调控机制高度复杂，特定细胞因子的表达总是受到其他细胞因子的影响，形成一个“细胞因子级联”网络。由于炎症网络的复杂性，靶向一种细胞因子或一种炎症信号通路可能会刺激下游的代偿性免疫反应。因此，对于细胞因子风暴的治疗，需要同时针对多个炎性细胞因子靶点，而临床上同时采用多种药物来抑制不同的细胞因子，显然不现实也不合理。尽管有研究提示抑制某一种细胞因子，也可以一定程度上降低细胞因子风暴，但缺少充足的临床数据。
需要说明的是，在上述背景技术部分公开的信息仅用于加强对本公开的背景的理解，因此可以包括不构成对本领域普通技术人员已知的现有技术的信息。
发明内容
本公开的目的在于克服上述现有技术的不足，提供MEF2A作为靶点的应用及药物的筛选方法、抑制MEF2A的物质在制备药物中的应用，以实现对多个促炎细胞因子表达的抑制，从而抑制细胞因子风暴。
根据本公开的一个方面，提供一种MEF2A作为靶点在筛选用于治疗细胞因子风暴的药物中的应用。
在本公开的一种示例性实施例中，所述靶点为MEF2A基因。
在本公开的一种示例性实施例中，所述靶点为MEF2A蛋白分子。
根据本公开的另一个方面，特异性抑制MEF2A基因转录或翻译的物质在制备治疗细胞因子风暴的药物中的应用。
根据本公开的另一个方面，特异性抑制MEF2A蛋白表达的物质在制备治疗细胞因子风暴的药物中的应用。
根据本公开的另一个方面，MEF2A作为靶点在细胞因子风暴模型筛选治疗细胞因子风暴的药物的应用。
在本公开的一种示例性实施例中，所述细胞因子风暴模型为人细胞共培养细胞因子风暴模型或动物细胞因子风暴模型。
在本公开的一种示例性实施例中，所述人细胞共培养细胞因子风暴模型中，人细胞共培养包括至少一种正常免疫细胞和至少一种正常组织细胞共培养。
在本公开的一种示例性实施例中，所述正常免疫细胞为人正常巨噬细胞，所述正常组织细胞为人正常肺上皮细胞。
根据本公开的另一个方面，提供一种细胞因子风暴治疗药物的筛选方法，筛选抑制或降低上述细胞因子风暴模型中MEF2A表达的物质。
本公开提供的MEF2A作为靶点在筛选用于治疗细胞因子风暴的药物中的应用，只需要敲低或抑制MEF2A的表达就可以同时抑制多个促炎细胞因子表达，从而抑制细胞因子风暴。其优势在于同时抑制多个炎症因子的表达，而非单纯地对某个炎性细胞因子进行表达抑制，避免仅靶向的针对一种细胞因子或一种炎症信号通路造成的代偿性免疫反应，及其导致的“细胞因子级联”复杂程度增加的问题。
应当理解的是，以上的一般描述和后文的细节描述仅是示例性和解释性的，并不能限制本公开。
附图说明
此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本公开的实施例，并与说明书一起用于解释本公开的原理。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本公开的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本公开一种实施方式中，各个促炎细胞因子基因启动子转录活性检测结果示意图。
图2为本公开一种实施方式中，MEF2A作为转录因子与各个促炎细胞因子基因启动子序列结合量检测结果示意图。
图3为本公开一种实施方式中，各个促炎细胞因子的分泌水平示意图。
图4为本公开一种实施方式中，两种共培养细胞中各个促炎细胞因子的蛋白表达水平。
图5为本公开一种实施方式中，两种共培养细胞中各个促炎细胞因子的基因表达水平。
图6为本公开一种实施方式中，各个促炎细胞因子的分泌水平示意图。
图7为本公开一种实施方式中，两种共培养细胞中MEF2A的蛋白表达水平。
图8为本公开一种实施方式中，两种共培养细胞中各个促炎细胞因子的基因表达水平。
图9为本公开一种实施方式中，各个促炎细胞因子的分泌水平示意图。
具体实施方式
现在将参考附图更全面地描述示例实施方式。然而，示例实施方式能够以多种形式实施，且不应被理解为限于在此阐述的实施方式；相反，提供这些实施方式使得本公开将全面和完整，并将示例实施方式的构思全面地传达给本领域的技术人员。
除非另有说明，用于披露本发明的所有术语(包括技术和科学术语)的意义与本发明所属领域普通技术人员所通常理解的相同。通过进一步的指导，随后的定义用于更好地理解本发明的教导。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
细胞因子风暴的主要特征是多种促炎细胞因子同时过度表达，细胞因子风暴涉及的关键促炎细胞因子有IFNα/β、IL1β、IL6、IFNγ、TNFα、IL-8、MCP-1等。因此，寻找同时下调多种促炎细胞因子表达的新靶点是细胞因子风暴治疗的新方向。
为解决上述问题，本公开实施方式提供了MEF2A作为靶点在筛选用于治疗细胞因子风暴的药物中的应用。MEF2A可以作为共同的转录因子，促进细胞因子风暴中涉及的多个关键促炎细胞因子进行基因转录，诱导多个关键促炎细胞因子产生，进而导致或加重细胞因子风暴。所述药物可以作用于MEF2A，抑制MEF2A表达，使得MEF2A在细胞中的表达水平降低，进而抑制多个关键促炎细胞因子的基因转录，达到抑制细胞因子风暴的效果。
本实施例提供的MEF2A作为靶点在筛选用于治疗细胞因子风暴的药物中的应用，只需要敲低或抑制MEF2A的表达就可以同时抑制多个促炎细胞因子表达，从而抑制细胞因子风暴。其优势在于同时抑制多个炎症因子的表达，而非单纯地对某个炎性细胞因子进行表达抑制，避免仅靶向的针对一种细胞因子或一种炎症信号通路造成的代偿性免疫反应，及其导致的“细胞因子级联”复杂程度增加的问题。
在本公开的一种实施方式中，所述靶点可以对应MEF2A基因转录mRNA过程，或者对应mRNA翻译成对应蛋白质过程。在本公开的另一种实施方式中，所述靶点可以对应所述对应蛋白质的修饰过程。通过抑制上述靶点，均可以抑制MEF2A基因产生对应MEF2A蛋白，避免MEF2A蛋白作为转录激活因子激活多种关键促炎细胞因子(例如，IFNα/β、IL1β、IL6、IFNγ、TNFα、IL-8、MCP-1)的基因表达，产生促炎细胞因子的过度免疫反应，进而达到抑制细胞因子风暴的作用。
本公开中，从蛋白水平或者mRNA水平对MEF2A的表达进行抑制都将是有效的。可以理解的是，抑制可以是部分减弱MEF2A的表达，也可以是使其表达沉默。
本公开实施方式还提供了特异性抑制MEF2A基因转录或翻译，或能够特异性抑制MEF2A蛋白表达的物质在制备治疗细胞因子风暴的药物中的应用。其中，所述物质可以包括但不限于核酸分子、脂类、小分子化学药、抗体药、多肽、蛋白和干扰慢病毒。在一种示例中，所述核酸分子可以是反义寡核苷酸、dsRNA、micro RNA、siRNA或者shRNA。在一种示例中，所述物质还可以是组合物。
本公开实施方式提供了MEF2A作为靶点在细胞因子风暴模型筛选治疗细胞因子风暴的药物的应用。通过构建细胞因子风暴模型，以MEF2A为靶点，筛选能够抑制细胞因子风暴模型中MEF2A表达水平的物质，为进一步研究开发治疗细胞因子风暴的药物或药物组合提供参考。同样的，所述物质可以包括但不限于核酸分子、脂类、小分子化学药、抗体药、多肽、蛋白和干扰慢病毒。在一种示例中，所述核酸分子可以是反义寡核苷酸、dsRNA、microRNA、siRNA或者shRNA。在一种示例中，所述物质还可以是组合物。
在本公开的一种实施方式中，所述细胞因子风暴模型为人细胞共培养细胞因子风暴模型。其中，人细胞共培养可以包括至少一种正常免疫细胞和至少一种正常组织细胞共培养，以模拟体内的感染状态。示例性的，所述正常免疫细胞可以为人正常巨噬细胞，所述正常组织细胞可以为人正常肺上皮细胞。人细胞共培养细胞因子风暴模型构建的过程具体为：
S10、人正常巨噬细胞和人正常肺上皮细胞采用Transwell共培养。
S20、共培养24h后，在共培养基中加入细胞因子风暴诱导剂，例如，该诱导剂可以是重组SARS-CoV-2S蛋白(重组SARS-CoV-2病毒Spike蛋白)。
S30、持续感染24h后，分别收集人巨噬细胞和人肺上皮细胞。
分别提取两种细胞的总蛋白和总RNA，采用蛋白免疫印迹(western blot)对总蛋白进行检测，获得多种促炎细胞因子(IL1β、IL6、TNFα、IFNα/β、IFNγ、IL8和MCP-1)的蛋白表达水平。采用实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)对总RNA进行检测，获得多种促炎细胞因子(IL1β、IL6、TNFα、IFNα/β、IFNγ、IL8和MCP-1)的基因表达水平。
收集共培养基的上清液，采用ELISA检测上清液中促炎细胞因子分泌水平。
S40、根据预设的标准判断细胞因子风暴模型是否构建成功。
在本公开的一种实施方式中，所述细胞因子风暴模型为动物细胞因子风暴模型。例如，可以用细菌脂多糖(LPS，Lipopolysaccharides)诱导小鼠的机体免疫，通过采集样本检测多种促炎细胞因子(IL1β、IL6、TNFα、IFNα/β、IFNγ、IL8和MCP-1)的表达水平及分泌水平，进而判断小鼠细胞因子风暴模型构建是否成功。
本公开实施方式还提供了一种细胞因子风暴治疗药物的筛选方法，以便筛选出可以抑制或降低上述细胞因子风暴模型中MEF2A表达的物质。以采用人细胞共培养细胞因子风暴模型为例，实验可以分为三组，分别为：
给药组：包括人细胞共培养细胞因子风暴模型，并将待筛选药物按照预设剂量加入细胞共培养基中。也就是说，向人细胞共培养细胞因子风暴模型中加入待筛选药物，模拟药物治疗。
模型组：人细胞共培养细胞因子风暴模型。
正常组：正常的人共培养细胞。
按照相同的培养条件，将三组培养预设时间后，检测各组的MEF2A的表达水平；这里的MEF2A的表达水平可以是MEF2A蛋白表达水平，也可以是MEF2A基因表达水平，还可以对MEF2A蛋白表达水平和MEF2A基因表达水平均进行检测。若给药组的MEF2A表达水平恢复至正常组的MEF2A表达水平，或者给药组的MEF2A表达水平与正常组的MEF2A表达水平没有统计学上的显著差异，则给药组的待筛选药物符合筛选要求；若给药组的MEF2A表达水平高于正常组的MEF2A表达水平，且具有统计学上的显著差异，则给药组的待筛选药物不符合筛选要求。
以下结合具体的实施例进一步说明。
实验方法说明
Western blotting检测：按照《蛋白质纯化与鉴定实验指南》，马歇克等(1999)进行。
SDS-PAGE电泳检测蛋白的表达：参照汪家政等(2000)编的《蛋白质技术手册》方法。
ELISA检测：按照试剂盒说明方法(上海酶联生物技术有限公司产品)。
质粒的提取：按照试剂盒说明书方法(北京天根公司产品)。
细胞转染：采用LipofectamineTM 2000Reagent转染试剂盒，按照试剂盒说明书方法。
质粒构建
大肠杆菌表达rhATG10S的质粒：以pET-28a(+)为载体，将优化后的ATG10S的CDS利用NdeI和XhoI位点插入到pET-28a(+)为载体上。大肠杆菌表达rhATG10S的质粒的构建方法在多个文件中公开，例如：公开号为CN112794895 A和CN 114404572 A的中国发明专利。
pIE-HA-MEF2A质粒：将N端标记的HA-MEF2A基因序列克隆至pIRES2-EGFP载体(购自Clontech公司产品)上，构建pIE-HA-MEF2A质粒以过表达MEF2A。
促炎细胞因子基因启动子指导荧光素酶(Luciferase)报告基因构件：将多种促炎细胞因子基因(IL1β、IL6、TNFα、IFNα/β、IFNγ、IL8和MCP-1)启动子分别克隆至pGL3.0-basic载体(购自Promega公司产品)上。例如，将IL6基因启动子克隆至pGL3.0-basic载体上，构成IL6基因启动子指导荧光素酶报告基因构件(pGL3-IL6-pro)，同样的可以构建IL1β基因启动子指导荧光素酶报告基因构件(pGL3-IL1β-pro)，TNFα基因启动子指导荧光素酶报告基因构件(pGL3-TNFα-pro)，IFNα基因启动子指导荧光素酶报告基因构件(pGL3-IFNα-pro)，IFNβ基因启动子指导荧光素酶报告基因构件(pGL3-IFNβ-pro)，IFNγ基因启动子指导荧光素酶报告基因构件(pGL3-IFNγ-pro)，IL8基因启动子指导荧光素酶报告基因构件(pGL3-IL8-pro)，MCP-1基因启动子指导荧光素酶报告基因构件(pGL3-MCP-1-pro)。
pRL-SV40-N质粒：作为荧光素酶报告基因检测时的内参，购自碧云天生物科技有限公司。
细胞共培养模型的构建
建立了人正常巨噬细胞与人正常肺上皮细胞共培养模型；具体的，人正常巨噬细胞来源于外周血CD14+单核细胞(Lonza,Anaheim,CA,USA)，人正常肺上皮细胞BEAS-2B(ATCC,VA,USA)。人正常巨噬细胞与人正常肺上皮细胞按照数量比例1：1进行嵌入式共培养。这里所说的建立人正常巨噬细胞与人正常肺上皮细胞共培养模型是指通过实验检测和验证，获得该细胞共培养模型的最佳实验条件，比如共培养细胞的比例、培养基的最佳组分、Transwell装置采用的通透性膜的孔径等。
实施例一
实验分组
实验组11：将各种促炎细胞因子基因启动子指导荧光素酶报告基因构件分别转染至人正常巨噬细胞，且人正常巨噬细胞同时转染pRL-SV40-N质粒，巨噬细胞单独培养6h。将pIE-HA-MEF2A质粒转染至巨噬细胞中，巨噬细胞单独培养6h。再利用Transwell装置与人正常肺上皮细胞BEAS-2B采用嵌入式共培养24h。在培养基中加入0.25mg/mL重组SARS-CoV-2病毒Spike蛋白(S蛋白，the recombinant wild-type S protein,isolate:2019-nCoV,Sino Biological,40591-V08B1)，继续进行细胞培养，持续感染24h。
对照组12：将各种促炎细胞因子基因启动子指导荧光素酶报告基因构件分别转染至人正常巨噬细胞，且人正常巨噬细胞同时转染pRL-SV40-N质粒，巨噬细胞单独培养12h。利用Transwell装置与人正常肺上皮细胞BEAS-2B采用嵌入式共培养24h。在培养基中加入0.25mg/mL重组SARS-CoV-2S蛋白继续进行细胞培养，持续感染24h。
需要说明的是，这里实验组11和对照组12还要根据检测的促炎细胞因子的数量设置多组。例如，本实施例中实验组11设置8组，分别对应IL1β、IL6、TNFα、IFNα/β、IFNγ、IL8和MCP-17的基因启动子转录活性的检测。对照组12也相应的设置为8组。
样本采集与检测
收集巨噬细胞，采用裂解液裂解巨噬细胞后收集上清，可以采用试剂盒(Dual-Luciferase Reporter Gene Assay Kit(Beyotime Biotechnology,RG027-1))检测相对荧光素酶活性。根据荧光素酶活性检测评价MEF2A对各个促炎细胞因子基因启动子转录活性的影响。
实验结果及分析
如果MEF2A可以作为转录因子激活各个促炎细胞因子基因启动子，那么就会启动荧光素酶基因表达，荧光素酶的表达水平与MEF2A转录因子的作用强度成正比，可以通过检测荧光素酶的表达水平验证MEF2A对促炎细胞因子基因启动子转录活性的影响。
检测结果展示在图1中。在图1中，采用相同颜色图案填充的Control和MEF2A为同一个促炎细胞因子相关的对照组的检测结果和实验组的检测结果。例如，最左侧第一个Control和最左侧第一个MEF2A分别为IL1β基因启动子转录活性的对照组的检测结果和实验组的检测结果。结果进行统计学分析，各组间用单因素方差分析进行比较，**p<0.01，***p<0.001。如图1所示，以未转染pIE-HA-MEF2A质粒的巨噬细胞为对照组(图1中的Control组)，实验组11(图1中MEF2A组)过表达MEF2A可显著增强促炎细胞因子基因启动子指导报告基因转录活性，说明MEF2A过表达可以促进IL1β、IL6、TNFα、IFNα/β、IFNγ、IL8和MCP-1的基因转录。
实施例二
实验分组与检测
实验组21：将人正常巨噬细胞与人正常肺上皮细胞共培养，在培养基中加入重组SARS-CoV-2病毒Spike蛋白(S蛋白)，模拟感染并24hpi。收集巨噬细胞，进行染色质免疫共沉淀(ChIP)，例如，可以采用酶促ChIP试剂盒Enzymatic Chromatin IPKit(Cell Signaling Technology,9003)进行染色质免疫沉淀。利用anti-MEF2A(MEF2A抗体)特异性的免疫沉淀上清DNA，再经过去交联获得纯化的DNA片段。采用促炎因子基因启动子序列特异性引物(参见表1中SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:16)对DNA进行qRT-PCR，以检测MEF2A与促炎细胞因子基因启动子结合情况。
阴性对照组22：不加anti-MEF2A(MEF2A抗体)特异性的免疫沉淀上清DNA。
实验结果及分析
染色质免疫共沉淀通过交联剂使巨噬细胞中的MEF2A蛋白与对应的促炎因子基因启动子序列交联，裂解巨噬细胞获得染色质(包括MEF2A蛋白与促炎因子基因启动子序列)，染色质被剪切成染色质片段。加入anti-MEF2A，使得染色质片段上的MEF2A与anti-MEF2A特异性结合并沉淀，如此获得包括anti-MEF2A+MEF2A+促炎因子基因启动子序列的第一复合物。将第一复合物中的促炎因子基因启动子序列与MEF2A交联逆转，获得促炎因子基因启动子序列。通过促炎因子基因启动子序列特异性引物对促炎因子基因启动子序列进行qRT-PCR检测，获得各个促炎因子基因启动子序列的定量检测结果。
检测结果展示在图2中。在图2中，采用相同颜色图案填充的Control和MEF2A为同一个促炎细胞因子相关的对照组的检测结果和实验组的检测结果。例如，最左侧第一个Control和最左侧第一个MEF2A分别为IL1β基因启动子序列的对照组的定量检测结果和实验组的定量检测结果。结果进行统计学分析，各组间用单因素方差分析进行比较，***p<0.001。参见图2，与阴性对照组22(图2中的Control组)比较，实验组21(图2中的MEF2A组)结果显示利用MEF2A抗体免疫沉淀DNA中包含有多种促炎细胞因子基因启动子序列，说明MEF2A能与多种促炎细胞因子基因启动子相结合。
因此，通过荧光素酶活性检测实验和染色质共沉淀实验表明，MEF2A可作为多种促炎细胞因子基因启动子上共同的转录因子促进它们的基因进行转录。
表1.促炎因子基因启动子序列特异性引物序列
实施例三
实验分组
实验组31：在人正常巨噬细胞中转染mef2a-siRNA(Santa Cruz，货号sc-35894)，6h后，采用Transwell装置与人正常肺上皮细胞共培养24h。在共培养基中加入0.25mg/mL重组SARS-CoV-2S蛋白，持续感染24h。
模型组32：人正常巨噬细胞培养6h后，采用Transwell装置与人正常肺上皮细胞共培养24h。在共培养基中加入0.25mg/mL重组SARS-CoV-2S蛋白，持续感染24h。
对照组33：人正常巨噬细胞培养6h后，采用Transwell装置与人正常肺上皮细胞共培养48h。
样本采集
收集各组上清液、人巨噬细胞和人肺上皮细胞。所述上清液为各组培养基溶液进行离心，去除细胞碎片等杂质后获取的上清液。
样本检测与分析
采用ELISA试剂盒检测上清液中各个促炎细胞因子对应的蛋白分泌水平，以评价敲低MEF2A对促炎细胞因子的蛋白分泌水平的影响。同时，收集人巨噬细胞和人肺上皮细胞，分别提取细胞总蛋白和总RNA，采用Western blot检测总蛋白，获得多种促炎细胞因子(例如，IL1β、IL6、TNFα、IFNα/β、IFNγ、IL8和MCP-1)的蛋白表达水平。采用实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)对总RNA进行检测，获得多种促炎细胞因子(IL1β、IL6、TNFα、IFNα/β、IFNγ、IL8和MCP-1)的基因表达水平。其中，qRT-PCR引物序列参见表2。
表2.qRT-PCR引物序列
各个促炎细胞因子对应的蛋白分泌水平检测结果展示在图3中。在图3中，每个小图为同一个促炎细胞因子的蛋白分泌水平的检测结果；其中，在一个小图中，(-，-)分组为该促炎细胞因子的对照组33的蛋白分泌水平检测结果，(+，-)分组为该促炎细胞因子的模型组32的蛋白分泌水平检测结果，(+，+)分组为该促炎细胞因子的实验组31的蛋白分泌水平检测结果。例如，最左上角的小图为IL1β的检测结果，(-，-)分组为IL1β的对照组33的蛋白分泌水平检测结果，(+，-)分组为IL1β的模型组32的蛋白分泌水平测试结果，(+，+)分组为IL1β的实验组31的蛋白分泌水平检测结果。
各个促炎细胞因子的蛋白表达水平和基因表达水平展示在图4和图5中。如图4和图5所示，包括检测人巨噬细胞(Macrophages)和人肺上皮细胞(BEAS-2B)中对应的各个促炎细胞因子的蛋白表达水平和基因表达水平。其中，(-，-)分组为对照组33的检测结果，(+，-)分组为模型组32的检测结果，(+，+)分组为实验组31的检测结果。
结果进行统计学分析，各组间用单因素方差分析进行比较，***p<0.001。如图3、图4和图5所示，与对照组33相比，实验组32的培养基中加入了重组SARS-CoV-2S蛋白，使得各个促炎细胞因子的分泌水平均显著增高(如图3所示)，两种共培养细胞中各个促炎细胞因子的蛋白表达水平和基因表达水平均升高(如图4和图5所示)，说明SARS-CoV-2病毒S蛋白可以诱导细胞因子风暴。而实验组31中，人巨噬细胞转染mef2a-siRNA后，即使用S蛋白处理，模拟了体内病毒感染，培养基中的促炎细胞因子的分泌水平也显著降低(如图3所示)，两种共培养细胞中各个促炎细胞因子的蛋白表达水平和基因表达水平同样明显降低(如图4和图5所示)，基本与对照组的促炎细胞因子的分泌水平相当。说明敲低MEF2A表达后可有效抑制由SARS-CoV-2病毒S蛋白诱导的细胞因子风暴。
实施例四
实验分组
实验组41：人正常巨噬细胞和人正常肺上皮细胞采用Transwell共培养。24h后，在培养基中同时加入0.25mg/mL重组SARS-CoV-2S蛋白和2.5μM ATG10S蛋白(rhATG10S)，继续培养24h。
模型组42：人正常巨噬细胞和人正常肺上皮细胞采用Transwell共培养。24h后，在培养基中加入0.25mg/mL重组SARS-CoV-2S蛋白，继续培养24h。
对照组43：人正常巨噬细胞和人正常肺上皮细胞采用Transwell共培养48h。
样本采集
分别收集各组上清液、巨噬细胞和肺上皮细胞。所述上清液为各组培养基溶液进行离心处理，去除细胞碎片等杂质后获取的上清液。
样本检测与分析
采用ELISA方法检测上清液中促炎细胞因子的分泌水平。
各个促炎细胞因子对应的蛋白分泌水平检测结果展示在图6中。在图6中，每个小图为同一个促炎细胞因子的蛋白分泌水平的检测结果。其中，在一个小图中，(-，-)分组为该促炎细胞因子的对照组43的蛋白分泌水平检测结果，(+，-)分组为该促炎细胞因子的模型组42的蛋白分泌水平检测结果，(+，+)分组为该促炎细胞因子的实验组41的蛋白分泌水平检测结果。例如，最左上角的小图为IL1β的检测结果，(-，-)分组为IL1β的对照组43的蛋白分泌水平检测结果，(+，-)分组为IL1β的模型组42的蛋白分泌水平测试结果，(+，+)分组为IL1β的实验组41的蛋白分泌水平检测结果。
如图7所示，为各组人巨噬细胞(Macrophages)和人肺上皮细胞(BEAS-2B)中MEF2A的蛋白表达水平检测结果。其中，(-，-)分组为对照组43的MEF2A的蛋白表达水平检测结果，(+，-)分组为模型组42的MEF2A的蛋白表达水平检测结果，(+，+)分组为实验组41的MEF2A的蛋白表达水平检测结果。β-actin为内参对照。
如图8所示为各个促炎细胞因子的基因表达水平检测结果，包括检测人巨噬细胞(Macrophages)和人肺上皮细胞(BEAS-2B)中对应的各个促炎细胞因子的基因表达水平。其中，(-，-)分组为对照组43的基因表达水平检测结果，(+，-)分组为模型组42的基因表达水平检测结果，(+，+)分组为实验组41的基因表达水平检测结果。
结果进行统计学分析，各组间用单因素方差分析进行比较，***p<0.001。如图6所示，与对照组43和模型组42比较，实验组41的各个促炎细胞因子分泌水平均显著降低。说明ATG10S能显著降低促炎细胞因子的分泌水平，实现抑制细胞因子风暴的作用。
分别提取巨噬细胞和肺上皮细胞中的细胞总蛋白和总RNA，采用Western blot对总蛋白进行检测，分别获得巨噬细胞和肺上皮细胞中MEF2A的蛋白表达水平。采用实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)对总RNA进行检测，获得多种促炎细胞因子(IL1β、IL6、TNFα、IFNα/β、IFNγ、IL8和MCP-1)的基因表达水平。如图7和图8所示，实验组41中两种细胞内的MEF2A蛋白水平显著降低，各个促炎细胞因子的基因表达水平也显著降低，因此，ATG10S能显著降低促炎细胞因子的mRNA水平，同时也能降低MEF2A蛋白水平，说明ATG10S蛋白可以以MEF2A为靶点，抑制细胞因子风暴，降低MEF2A蛋白表达。
实施例五
实验分组
实验组51：将人正常巨噬细胞转染pIE-HA-MEF2A质粒，巨噬细胞单独培养6h后，采用Transwell装置与人正常肺上皮细胞共培养24h。在培养基中同时加入0.25mg/mL重组SARS-CoV-2S蛋白和2.5μM ATG10S蛋白，继续共培养24h。
实验组52：将人正常巨噬细胞转染pIE-HA-MEF2A质粒，巨噬细胞单独培养6h后，采用Transwell装置与人正常肺上皮细胞共培养24h。在培养基中加入0.25mg/mL重组SARS-CoV-2S蛋白，继续共培养24h。
实验组53：将人正常巨噬细胞转染pIE-HA-MEF2A质粒，巨噬细胞单独培养6h后，采用Transwell装置与人正常肺上皮细胞共培养24h。在培养基中加入2.5μM ATG10S蛋白，继续共培养24h。
模型组54：将人正常巨噬细胞单独培养6h后，采用Transwell装置与人正常肺上皮细胞共培养24h。在培养基中加入0.25mg/mL重组SARS-CoV-2S蛋白，继续共培养24h。
对照组55：将人正常巨噬细胞单独培养6h后，采用Transwell装置与人正常肺上皮细胞共培养48h。
样本采集
收集各组上清液。所述上清液为各组培养基溶液进行离心处理，去除细胞碎片等杂质后获取的上清液。
样本检测与分析
采用ELISA检测各组多种促炎细胞因子的蛋白分泌水平。
各个促炎细胞因子对应的蛋白分泌水平检测结果展示在图9中。在图9中，每个小图为同一个促炎细胞因子的蛋白分泌水平的检测结果；其中，在一个小图中，(-，-，-)分组为该促炎细胞因子的对照组55的蛋白分泌水平检测结果，(+，-，-)分组为该促炎细胞因子的模型组54的蛋白分泌水平检测结果，(+，+，-)分组为该促炎细胞因子的实验组53的蛋白分泌水平检测结果，(+，-，+)分组为该促炎细胞因子的实验组52的蛋白分泌水平检测结果，(+，+，+)分组为该促炎细胞因子的实验组51的蛋白分泌水平检测结果。例如，最左上角的小图为IL1β的检测结果，(-，-，-)分组为IL1β的对照组55的蛋白分泌水平检测结果，(+，-，-)分组为IL1β的模型组54的蛋白分泌水平检测结果，(+，+，-)分组为IL1β的实验组53的蛋白分泌水平检测结果，(+，-，+)分组为IL1β的实验组52的蛋白分泌水平检测结果，(+，+，+)分组为IL1β的实验组51的蛋白分泌水平检测结果。
结果进行统计学分析，各组间用单因素方差分析进行比较，***p<0.001表示与对照组55比较具有显著性差异，###p<0.001表示与模型组54比较具有显著性差异。数据以平均值±标准差表示，绘制散点图。如图9所示，与对照组55比较，实验组51在过表达MEF2A后，促炎细胞因子分泌水平显著性升高。与模型组54比较，实验组52在过表达MEF2A后，促炎细胞因子分泌水平同样显著性升高。上述结果表明抗细胞因子风暴的ATG10S蛋白以MEF2A为靶点抑制多种促炎细胞因子高表达，从而抑制细胞因子风暴，验证了以MEF2A为靶点抑制细胞因子风暴的可行性，也为治疗细胞因子风暴的药物筛选提供新思路。
本领域技术人员在考虑说明书及实践这里公开的发明后，将容易想到本公开的其它实施方案。本申请旨在涵盖本公开的任何变型、用途或者适应性变化，这些变型、用途或者适应性变化遵循本公开的一般性原理并包括本公开未公开的本技术领域中的公知常识或惯用技术手段。说明书和实施例仅被视为示例性的，本公开的真正范围和精神由所附的权利要求指出。
Claims (10)
1.MEF2A作为靶点在筛选用于治疗细胞因子风暴的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述靶点为MEF2A基因。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述靶点为MEF2A蛋白分子。
4.特异性抑制MEF2A基因转录或翻译的物质在制备治疗细胞因子风暴的药物中的应用。
5.特异性抑制MEF2A蛋白表达的物质在制备治疗细胞因子风暴的药物中的应用。
6.MEF2A作为靶点在细胞因子风暴模型筛选治疗细胞因子风暴的药物的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述细胞因子风暴模型为人细胞共培养细胞因子风暴模型或动物细胞因子风暴模型。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述人细胞共培养细胞因子风暴模型中，人细胞共培养包括至少一种正常免疫细胞和至少一种正常组织细胞共培养。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述正常免疫细胞为人正常巨噬细胞，所述正常组织细胞为人正常肺上皮细胞。
10.一种细胞因子风暴治疗药物的筛选方法，其特征在于，筛选抑制或降低权利要求6-9所述的细胞因子风暴模型中MEF2A表达的物质。
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2023
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