CN117467745A - 核酸信号方法体系、核酸检测试纸及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及核酸检测领域，尤其涉及核酸信号方法体系、核酸检测试纸及其应用。本发明提供了核酸信号放大体系，包括：捕获区、信号放大区和荧光信号捕获区。本发明提供的基于荧光分子放大体系的核酸检测试纸条，借助分子放大体系对特定核酸序列进行识别和杂交，为荧光微球与待测核酸链的杂交提供了充足的杂交位点，保证了核酸检测的灵敏度和特异性。此外，本发明提供的非扩增核酸检测试纸条以控制线和检测线为检测平台，依靠抗原‑抗体反应直接或间接地固定荧光微球，通过荧光强度可视化待测核酸浓度，实现快速、灵敏、准确的非扩增式核酸检测。
Description
技术领域
本发明涉及核酸检测领域，尤其涉及核酸信号方法体系、核酸检测试纸及其应用。
背景技术
核酸作为所有生命形式必不可少的信息携带分子，广泛存在于所有动植物细胞、微生物体内。核酸检测(NAT)是一种用于检测特定核酸序列的技术，通常用于检测和鉴定生物体内的特定物种或亚种。目前，核酸检测主要应用于检测在血液、尿液、组织中充当病原体的病毒或细菌，从而辅助进行艾滋病、衣原体感染、结核、多种呼吸道疾病等多种疾病的早期诊断。随着核酸检测需求的不断提高，开发低成本、灵敏、简便的核酸检测方法，实现对多种病原体核酸的快速检测，对于控制大型流行性传染病的传播、普及常见感染性疾病的居家自检意义重大。
目前，核酸检测技术主要包括聚合酶链反应(PCR)、链置换测定(SDA)和转录介导测定(TMA)等。尽管这些技术灵敏度高，但该类技术不仅检测时间长达3小时，而且需要专用仪器和操作熟练的技术人员，大大限制了病毒核酸筛查的效率，使其难以普适于大规模快速检测等应用场景。为解决上述问题，基于荧光试纸条的非扩增式核酸检测方法应运而生。基于荧光免疫分析法的核酸检测试纸条灵敏度高达500copies/mL，能够实现核酸分子的准确检测；基于CRISPR-cas13切割技术的非扩增核酸试纸条检测流程简单、响应迅速，能够实现核酸分子的快速检测。然而，以上方法较难平衡检测灵敏度、检测成本和检测时间。上述核酸检测试纸条或需要特殊合成的酶或蛋白质辅助检测，极大提高的检测成本；或检测流程繁琐，检测周期长，无法实现核酸快速筛查；或灵敏度较低，无法满足疾病潜伏期低病毒核酸拷贝数的准确检测，因此，在构建灵敏度高、成本低廉、检测流程简便、响应时间短的一次性便携式核酸试纸条上仍存在一定技术壁垒。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了核酸信号方法体系、核酸检测试纸及其应用。本发明提供的基于荧光分子放大体系的核酸检测试纸条，借助分子放大体系对特定核酸序列进行识别和杂交，为荧光微球与待测核酸链的杂交提供了充足的杂交位点，保证了核酸检测的灵敏度和特异性。此外，本发明提供的非扩增核酸检测试纸条以控制线和检测线为检测平台，依靠抗原-抗体反应直接或间接地固定荧光微球，通过荧光强度可视化待测核酸浓度，实现快速、灵敏、准确的非扩增式核酸检测。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
核酸信号放大体系，包括：捕获区、信号放大区和荧光信号捕获区；
所述捕获区包括：捕获探针，所述捕获探针与待测核酸部分互补；
所述信号放大区包括：标签区、预放大区、初级放大区和次级放大区；
所述标签区包括：标签区探针；所述标签区探针包括：P1序列和P2序列；
所述预放大区包括：P3序列和P4序列；
所述初级放大区包括：P5序列和P6序列；
所述次级放大区包括：P7序列和P8序列；
所述荧光信号捕获区与待测核酸的荧光微球结合；
所述P1序列与待测核酸部分互补；所述P2序列与所述P4序列互补；
所述P3序列与所述P5序列互补；所述P6序列与所述P7序列互补；
所述P2序列、所述P3序列、所述P6序列和所述P8序列为固定序列。
在本发明的一些实施方案中，上述核酸信号放大体系，所述次级放大区的3’端结合有生物素；所述生物素与修饰有链霉亲和素的待测核酸的荧光微球结合。
在本发明的一些实施方案中，上述核酸信号放大体系，所述P2序列具有：
(1)、如SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列；或
(2)、如(1)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(1)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(3)、与(1)或(2)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列；和/或
所述P3序列具有：
(4)、如SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列；或
(5)、如(4)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(41)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(6)、与(4)或(5)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列；和/或
所述P6序列具有：
(7)、如SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列；或
(8)、如(7)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(7)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(9)、与(7)或(8)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列；和/或
所述P8序列具有：
(10)、如SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列；或
(11)、如(10)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(10)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(12)、与(10)或(11)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，所述核酸信号放大体系中P2的序列为：CCGAGCTATGAGGAC(如SEQ ID NO:11所示)。
在本发明的一些实施方案中，所述核酸信号放大体系中P3的序列为：ATATATCGGAGGTGG(如SEQ ID NO:8所示)。
在本发明的一些实施方案中，所述核酸信号放大体系中P6的序列为：AAACACAAGCATTCT(如SEQ ID NO:9所示)。
在本发明的一些实施方案中，所述核酸信号放大体系中P8的序列为：TAACGCGGATGGAACCGTTGGAATA(如SEQ ID NO:15所示)。
在本发明的一些实施方案中，所述核酸信号放大体系中所述待测核酸链包括：P9序列和P10序列；所述捕获探针包括：P11序列和P12序列；
所述P9序列与P11序列互补；所述P10序列与所述P1序列互补。
在本发明的一些实施方案中，所述核酸信号放大体系中还包括：间隔序列。
在本发明的一些实施方案中，所述核酸信号放大体系中所述待测核酸、所述预放大区、所述初级放大区还包括间隔序列。
在本发明的一些实施方案中，所述核酸信号放大体系中所述P3序列和所述P4序列之间包括间隔序列；所述P5序列和所述P6序列之间包括间隔序列。
在本发明的一些实施方案中，所述核酸信号放大体系中所述间隔序列为：AAA。
在本发明的一些实施方案中，所述核酸信号放大体系中所述P3序列的个数为5个；所述P6序列的个数为5个。
在本发明的一些实施方案中，所述核酸信号放大体系中P1的序列为：CTTCCGAAACGAATG(如SEQ ID NO:10所示)。
在本发明的一些实施方案中，所述核酸信号放大体系中P4的序列为：GTCCTCATAGCTCGG(如SEQ ID NO:12所示)。
在本发明的一些实施方案中，所述核酸信号放大体系中P5的序列为：CCACCTCCGATATAT(如SEQ ID NO:13所示)。
在本发明的一些实施方案中，所述核酸信号放大体系中P7的序列为：TTTAGAATGCTTGTG(如SEQ ID NO:14所示)。
在本发明的一些实施方案中，所述核酸信号放大体系中P9的序列为：TGTTAACGTGAGTCT(如SEQ ID NO:16所示)。
在本发明的一些实施方案中，所述核酸信号放大体系中P10的序列为：CATTCGTTTCGGAAG(如SEQ ID NO:17所示)。
在本发明的一些实施方案中，所述核酸信号放大体系中P11的序列为：AGACTCACGTTAACA(如SEQ ID NO:18所示)。
在本发明的一些实施方案中，所述核酸信号放大体系中P12的序列为：GGGGGGGGGGGGGGG(如SEQ ID NO:19所示)。
在本发明的一些实施方案中，所述核酸信号放大体系中所述预放大区与所述标签区的摩尔浓度比为(1～2):1；所述初级放大区与所述预放大区的摩尔浓度比为：(5～20):1；所述次级放大区与所述初级放大区的摩尔浓度比为：(5～20):1。
在本发明的一些实施方案中，所述核酸信号放大体系中所述待测核酸链、所述标签区、所述预放大区、所述初级放大区与所述次级放大区的核酸互补区段数量比为：1:2:2:10:50。
在本发明的一些实施方案中，所述核酸信号放大体系中所述荧光信号捕获区修饰生物素。
本发明还提供了所述的核酸信号放大体系在核酸检测中的应用。
本发明还提供了核酸检测试纸，包括：样品垫、检测膜和吸水垫；
所述检测膜上设有检测线和控制线；
所述控制线包被有二抗溶液；
所述检测线包被有抗原-抗体溶液；
所述抗体包括抗地高辛抗体；
所述抗原包括末端修饰地高辛分子的特定核酸链；
所述特定核酸链与上述核酸信号放大体系中的所述捕获探针的核酸链互补。
在本发明的一些实施方案中，所述核酸检测试纸中所述特定核酸链与所述P12序列互补。
在本发明的一些实施方案中，所述核酸检测试纸还包括：底板。
在本发明的一些实施方案中，所述核酸检测试纸中所述检测膜包括硝酸纤维素膜。
在本发明的一些实施方案中，所述核酸检测试纸中所述检测膜的一端与所述样品垫搭接，另一端与所述吸水垫搭接；
所述检测膜的孔径为8～15μm，宽度为25mm或18mm；
所述吸水垫的宽度为40～60mm；
所述样品垫的宽度为6～8mm；
所述检测线和所述控制线的宽度为1～2mm，所述检测线和所述控制线的间距为3～5mm。
在本发明的一些实施方案中，所述核酸检测试纸中所述检测膜的一端与所述样品垫搭接，另一端与所述吸水垫搭接；
所述检测膜的孔径为10μm，宽度为25mm；
所述吸水垫的宽度为50mm；
所述样品垫的宽度为8mm；
所述检测线和所述控制线的宽度为1mm，所述检测线和所述控制线的间距为3～5mm。
本发明还提供了上述核酸检测试纸的制备方法，包括如下步骤：
S1：取所述检测膜、所述样品垫、所述吸水垫组装，获得待组装件；
S2：取所述二抗溶液和所述抗原-抗体溶液分别喷涂于所述检测膜后，烘干，获得所述核酸检测试纸；
所述二抗溶液包括：0.05～0.5mg/mL生物素-牛血清蛋白；
所述抗原的浓度为10～100μM，所述抗体的浓度为0.5～2mg/mL。
在本发明的一些实施方案中，所述制备方法S2中，所述二抗溶液包括：0.2mg/mL生物素-牛血清蛋白；
所述抗原的浓度为100μM，所述抗体的浓度为1mg/mL。
在本发明的一些实施方案中，所述制备方法S2中，所述抗原和所述抗体的体积比为2:1。
在本发明的一些实施方案中，所述制备方法S2中，所述抗原和所述抗体在37℃下反应30min后，获得所述抗原-抗体溶液。
在本发明的一些实施方案中，所述制备方法S2中，所述烘干的温度为25～55℃，时间为1～12h。
本发明还提供了上述核酸检测试纸和/或上述制备方法获得的核酸检测试纸在核酸检测中的应用。
在本发明的一些实施方案中，所述应用中所述核酸检测包括如下步骤：
S1：取上述核酸放大体系中的所述捕获探针、所述信号放大区和所述荧光信号捕获区混合，第一加热，获得核酸分子放大体系溶液；
S2：取所述核酸分子放大体系溶液与待测核酸溶液混合，第二加热，获得混合液；
S3：取所述混合液滴加于所述样品垫后，依次滴加第一缓冲液、荧光微球和第二缓冲液，根据荧光强度获得检测结果。
在本发明的一些实施方案中，所述应用中所述核酸检测中所述待测核酸还包括与病毒裂解液混合的步骤。
在本发明的一些实施方案中，所述应用中所述核酸检测中所述混合液、所述第一缓冲液、所述荧光微球和所述第二缓冲液的体积比为：(2～5)：(2～5)：(1～2)：(2～5)。
在本发明的一些实施方案中，所述应用中所述核酸检测S1中所述第一加热的温度为55℃，时间为1h。
在本发明的一些实施方案中，所述应用中所述核酸检测S2中所述核酸检测中所述第二加热的温度为37℃，时间为0～40min。
在本发明的一些实施方案中，所述应用中所述核酸检测S2中所述第二加热的温度为37℃，时间为30min。
在本发明的一些实施方案中，所述应用中所述核酸检测S2中所述荧光微球修饰链霉亲和素。
在本发明的一些实施方案中，所述应用中所述核酸检测S2中所述第一缓冲液和所述第二缓冲液包括：柠檬酸钠缓冲液。
本发明提供了核酸信号放大体系，包括：捕获区、信号放大区和荧光信号捕获区；
所述捕获区包括：捕获探针，所述捕获探针与待测核酸链部分互补；
所述信号放大区包括：标签区、预放大区、初级放大区和次级放大区；
所述标签区包括：标签区探针，所述标签区探针与待测核酸链部分互补；
所述预放大区为所述标签区的延伸，与所述标签区探针和初级放大区的核酸链部分互补；
所述初级放大区与所述次级放大区的核酸链部分互补；
所述荧光信号捕获区与待测核酸的荧光微球结合。
本发明的有益效果包括：
(1)、本发明提供一种基于荧光分子放大体系的核酸检测试纸条，该试纸条借助特殊设计的分子放大体系对特定核酸序列进行识别和杂交，为荧光微球与待测核酸链的杂交提供充足的杂交位点，依靠抗原-抗体反应将荧光微球直接或间接地固定在核酸检测试纸条上，灵敏、快速、准确地反映待测样本中待测核酸分子的浓度，从而提供一种一次性、便携、低成本的核酸检测试纸条。
(2)、本发明提出的基于荧光分子放大体系的核酸检测试纸条无需外界仪器设备辅助即可实现核酸非扩增快速检测，系统制备简单、应用范围广、对于构建面向感染性疾病居家诊断、大规模病毒筛查、远程医疗等场景的医疗器械前景广阔。
(3)、本发明聚焦现有非扩增核酸检测方法中检测灵敏度低、成本高、检测流程复杂的问题，提出一种基于荧光分子放大体系的核酸检测试纸条，以实现核酸分子低成本、灵敏、简便的快速检测。该检测试纸条无需与自动化装置或设备集成即可完成检测功能，在构建面向疾病筛查的便携式核酸居家检测装置方面具有巨大潜力。
(4)、本发明所述方法与现有方法相比，成本更低、灵敏度更高、检测流程更简便、应用范围更广，符合核酸检测试纸条居家检测要求。同时，本发明提出的基于荧光分子放大体系的核酸检测试纸条不涉及核酸分子的扩增和待测样本的转移，能够最大程度降低病原体泄露的风险。
(5)、本发明提供的方法以侧向流系统为基础，借助分子放大体系对特定核酸序列进行识别和杂交，为荧光微球与待测核酸链的杂交提供了充足的杂交位点，显著增加了单一核酸所携带的信号分子。随后，核酸检测试纸条质控线和检测线位置修饰的分子依靠抗原-抗体反应分别捕获样本中的信号分子和与待测核酸链杂交的放大体系，将荧光微球直接或间接地固定在核酸检测试纸条上，最终根据荧光信号强度对标待测样本中特定核酸分子的浓度，从而提供一种能够低成本、灵敏、快速检测特定核酸序列的便携式非扩增核酸检测试纸条。
(6)、本发明提供的检测方法的检测时间为75分钟左右(包含样本预处理)，而现有技术的检测时间需要8h甚至更长时间；同时，本发明提供的检测方法只需要裂解病毒释放出核酸后就可以开始检测，而现有技术需要复杂的样本预处理流程，耗时长且麻烦。
(7)、本发明提供的检测方法可用于现场快速检测的技术方案，而现有技术大部分是在实验室使用的试剂盒，可使用场景十分局限。
(8)、本发明提供的检测方法从检测的角度说，是预杂交信号放大团簇，检测的时候只有一步跟靶标核酸的杂交，系统操作简便。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示本发明所述的非扩增核酸试纸条的检测流程示意图；
图2示本发明所述的非扩增核酸试纸条的结构示意图；其中：0示试纸条；01示样品垫；02示硝酸纤维素膜；03示检测线；04示控制线；05示吸水垫；06示胶板；
图3示本发明所述的非扩增核酸试纸条的分子放大体系示意图；其中：1示分子放大体系；11.示捕获探针；12示标签区；13示预放大区；14示放大区；141示初级放大区；142示次级放大区；15示荧光信号捕获区；2示待测核酸链；
图4示本发明所述的非扩增核酸试纸条的检测结果示意图；
图5示本发明所述的非扩增核酸试纸条的灵敏度测试结果图；
图6示本发明所述的非扩增核酸试纸条定量检测的线性拟合图；
图7示本发明所述的非扩增核酸试纸条核酸分子放大体系溶液与待测核酸溶液孵育时间对检测结果的影响测试图。
具体实施方式
本发明公开了核酸信号方法体系、核酸检测试纸及其应用。
应该理解，表述“……中的一种或多种”单独地包括每个在所述表述后叙述的物体以及所述叙述的物体中的两者或更多者的各种不同组合，除非从上下文和用法中另有理解。与三个或更多个叙述的物体相结合的表述“和/或”应该被理解为具有相同的含义，除非从上下文另有理解。
术语“包括”、“具有”或“含有”，包括其语法同义语的使用，通常应该被理解为开放性和非限制性的，例如不排除其他未叙述的要素或步骤，除非另有具体陈述或从上下文另有理解。
应该理解，只要本发明仍可操作，步骤的顺序或执行某些行动的顺序并不重要。此外，两个或更多个步骤或行动可以同时进行。
本文中的任何和所有实例或示例性语言如“例如”或“包括”的使用，仅仅打算更好地说明本发明，并且除非提出权利要求，否则不对本发明的范围构成限制。本说明书中的任何语言都不应解释为指示任何未要求保护的要素对于本发明的实践是必不可少的。
此外，用以界定本发明的数值范围与参数皆是约略的数值，此处已尽可能精确地呈现具体实施例中的相关数值。然而，任何数值本质上不可避免地含有因个别测试方法所致的标准偏差。因此，除非另有明确的说明，应当理解本公开所用的所有范围、数量、数值与百分比均经过“约”的修饰。在此处，“约”通常是指实际数值在一特定数值或范围的正负10％、5％、1％或0.5％之内。
本发明提供一种基于荧光分子放大体系的核酸检测试纸条，该核酸试纸条以侧向流系统为基础，借助特殊设计的分子放大体系对特定核酸序列进行识别和杂交，为荧光微球与待测核酸链的杂交提供充足的杂交位点，依靠抗原-抗体反应将荧光微球直接或间接地固定在核酸检测试纸条上，灵敏、快速、准确地反映待测样本中待测核酸分子的浓度，从而提供一种一次性、便携、低成本的核酸检测试纸条。
本发明所提供的基于荧光分子放大体系的核酸检测试纸条主要包括试纸条、样本预处理液、核酸信号放大体系、荧光微球四个部分。
所述试纸条样品垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和胶板、控制线和测试线六部分组成，用于构建侧向流系统。所述样品垫、硝酸纤维素膜、吸水垫依次连接，两两之间末端重合以保证流体的高效流动。
根据本发明一个实施例的非扩增核酸检测试纸条，在所述试纸条硝酸纤维素膜表面修饰控制线和测试线，所述控制线用于直接捕获样本中的荧光微球，控制线修饰分子为生物素-牛血清白蛋白(Biotin-BSA)。所述检测线用于捕获杂交了待测核酸链的放大体系，从而间接捕获荧光微球。检测线修饰分子为与抗地高辛抗体(Anti-Digoxin)结合的末端修饰地高辛分子的特定核酸链，所述特定核酸链，可通过与放大体系中的捕获探针碱基互补配对作用达到识别和捕获待测核酸分子的目的。
根据本发明一个实施例的非扩增核酸检测试纸条，所述样本预处理液为病毒裂解液(圣湘生物科技有限公司，S1014)，用于裂解病毒并释放病毒核酸。
根据本发明一个实施例的非扩增核酸检测试纸条，所述核酸信号放大体系包括待测核酸链捕获和信号放大两大部分。
根据本发明一个实施例的非扩增核酸检测试纸条，所述待测核酸链捕获部分包含待测核酸不同区域的捕获探针，所述捕获探针用于结合所述待测核酸链并与所述检测线表面修饰的特定核酸链互补配对。
根据本发明一个实施例的非扩增核酸检测试纸条，所述信号放大部分包含标签区、预放大区、放大区和荧光信号捕获区四个分支。所述标签区用于识别和结合待测核酸分子。所述预放大区用于结合并拓展所述标签区，为所述放大区的固定提供较长的核酸单链。所述放大区可根据需要设计为包含初级放大区、次级放大区的二级放大，所述初级放大区和次级放大区之间依靠核酸互补配对依次杂交。所述荧光信号捕获区用于提供荧光信号结合位点，所述荧光信号捕获区组成为生物素。
根据本发明一个实施例的非扩增核酸检测试纸条，所述荧光微球直接或间接固定在核酸检测试纸条表面，用于反应待测核酸浓度。所述荧光微球能够同时与所述试纸条控制线修饰分子和所述核酸信号放大体系中信号放大部分的荧光信号捕获区结合。所述荧光微球表面链霉亲和素分子修饰。
本发明中分子放大体系能够对特定核酸序列进行识别和杂交，为荧光微球与待测核酸链的杂交提供了充足的杂交位点，并依靠抗原-抗体反应直接或间接地固定荧光微球，通过荧光强度可视化待测核酸浓度，实现快速、灵敏、准确的非扩增式核酸检测。本发明提供的基于荧光分子放大体系的核酸检测试纸条无需外界仪器设备辅助即可实现核酸非扩增快速检测，可应用于感染性疾病居家诊断、大规模病毒筛查、远程医疗等场景。
本发明中的非扩增核酸试纸条，样品垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和胶板、控制线和测试线六部分组成，用于构建侧向流系统。图2为本发明所述的非扩增核酸试纸条的检测流程示意图。所述样品垫由多孔玻璃纤维材料制备而成，借助玻璃纤维有序孔径过滤样本中的颗粒杂质，降低检测背景并降低假阳性。同时，所述玻璃纤维样品垫、硝酸纤维素膜、吸水垫依次连接，两两之间末端重合以保证流体高效、连续的流动。
在一个实施例中，所述非扩增核酸检测试纸条的试纸条部分由玻璃纤维样品垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和胶板四部分组成。所述硝酸纤维素膜孔径为10μm，样本流动的毛细管速度为140s/4cm。所述玻璃纤维样品垫宽8mm，所述硝酸纤维素膜宽25mm，所述吸水垫宽50mm，所述胶板宽80mm。所述玻璃纤维样品垫、硝酸纤维素膜、吸水垫在所述胶板上依次连接，两两之间末端重合。所述试纸条经过切割后长80mm，宽3.5mm。
在一个实施例中，所述非扩增核酸试纸条的核酸信号放大体系包括待测核酸链捕获和信号放大两大部分。待测核酸链捕获部分包含待测核酸不同区域的捕获探针，所述捕获探针用于结合所述待测核酸链并与所述检测线表面修饰的特定核酸链互补配对。所述信号放大部分包含标签区、预放大区、放大区和荧光信号捕获区四个分支。所述放大区可根据需要设计为包含初级放大区、次级放大区的二级放大。所述荧光信号捕获区用于提供荧光信号结合位点，所述荧光信号捕获区组成为生物素分子所述核酸信号放大体系结构示意图如图3所示。
本发明实施例1中，所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
(1)、首先，配置试纸条控制线和检测线位置的划线溶液，其中，控制线划线溶液可根据具体需要，在磷酸缓冲液(PBS)中配制0.2mg/mL生物素-牛血清白蛋白(Biotin-BSA)。检测线划线溶液主要为与1mg/mL抗地高辛抗体(Anti-Digoxin)结合的100μM末端修饰地高辛分子的特定核酸链(5’-CCCCCCCCCCCCCCC-3’(如SEQ ID NO:7所示))。为使所述检测线划线溶液中的抗原-抗体结合充分，将1mg/mL抗地高辛抗体(Anti-Digoxin)与100μM末端修饰地高辛分子的特定核酸链按照体积比2：1混合，并在37℃下反应30min。
(2)、其次，将所述宽8mm的玻璃纤维样品垫、宽25mm的硝酸纤维素膜和所述宽50mm的吸水垫，依次连接在所述宽80mm的胶板上。所述玻璃纤维样品垫、硝酸纤维素膜、吸水垫连接时两两之间末端重合。随后，将控制线划线溶液和检测线划线溶液喷涂在试纸条硝酸纤维素膜表面。所述控制线和检测线宽1mm，间距3-5mm。将喷涂了检测线溶液和控制线溶液的试纸条放入25-55℃的烘箱内干燥1-12h，随后切割为长80mm，宽2.5-4mm的条带。优选地，控制线和检测线宽1mm，间距为3.5mm，试纸条喷涂检测线溶液和控制线溶液后置于37℃烘箱内干燥1h，随后切割为长80mm，宽3.5mm的试纸条。
(3)、随后，设计核酸分子放大体系的核酸序列，在放大区14中进行两级放大，包括初级放大序列141和次级放大序列142，分子放大体系示意图如图3所示。根据捕获探针11、标签区12、预放大区13、放大区14中核酸链的长度和数量确定各自浓度比例。
标签区、预放大区、初级放大区和次级放大区的浓度预设定为A、B、C和D，其中的摩尔浓度比例关系为B：A为1-2，C：B为5-20，D：C为5-20。
以随机合成的短链单链核酸作为待测目标核酸序列为例，按照标签区、预放大区、初级放大区和次级放大区中核酸杂交区段数量比1：2：2：10：50，设计以下分子放大体系核酸序列：
待测目标核酸序列：5’-TGTTAACGTGAGTCT(P9)AAA CATTCGTT TCGGAAG(P10)-3’(如SEQ ID NO:1所示)
所述核酸分子放大体系的探针序列如下：
捕获探针：5’-AGACTCACGTTAACA(P11)GGGGGGGGGGGGGGG
(P12)-3’(如SEQ ID NO:2所示)
标签区：5’-CTTCCGAAACGAATG(P1)CCGAGCTATGAGGAC(P2)-3’(如SEQ ID NO:3所示)
预放大区：5’-ATATATCGGAGGTGG(P3)AAA ATATATCGGAGGT GG AAAATATATCGGAGGTGG AAA ATATATCGGAGGTGG AAA AT ATATCGGAGGTGG AAA GTCCTCATAGCTCGG(P4)-3’(如SEQ ID NO:4所示)
初级放大区：5’-CCACCTCCGATATAT(P5)AAACACAAGCATTCT AAA AAACACAAGCATTCTAAA AAACACAAGCATTCT AAA AAACA CAAGCATTCT AAA AAACACAAGCATTCT(P6)AAA-3’(如SEQID NO:5所示)
次级放大区：5’-TTTAGAATGCTTGTG(P7)TAACGCGGATGGAACC GTTGGAATA-3(P8)’(如SEQ ID NO:6所示)
(4)、随后，将100μM捕获探针11、标签区12、预放大区13、放大区14核酸链按照1：2：2：10：50体积比混合，在55℃下反应1h后得到核酸分子放大体系溶液。
(5)、最后，将核酸分子放大体系溶液与待测核酸溶液混合，在37℃下混合30min后，滴加65μL于核酸试纸条的样品垫位置，随后依次滴加50μL柠檬酸钠缓冲液、20μL荧光微球(苏州纳微科技，LFGNC-005-001A)、50μL柠檬酸钠缓冲液，使用荧光读卡器对核酸检测试纸条荧光强度进行采集，待样本流动完全后对试纸条检测线和控制线位置的荧光强度进行读取，检测结果如图4所示。
相较于现有非扩增式核酸检测方法，本发明提出的基于荧光分子放大体系的核酸检测试纸条显示出明显提高的检测灵敏度和增大的线性范围。基于分子放大体系的核酸检测试纸条在1fM-1nM范围内呈现出双对数线性；如图5-6所示；而普通非扩增式核酸试纸条检测范围仅为1pM-1nM。如图7所示，核酸分子放大体系溶液与待测核酸溶液在37℃下混合30min，检测灵敏度最佳。本发明基于荧光分子放大体系的核酸检测试纸条无需外界仪器设备辅助即可实现核酸非扩增快速检测，可应用于感染性疾病居家诊断、大规模病毒筛查、远程医疗等场景，具有良好的通用性。
综上，以上所述的基于荧光分子放大体系的核酸检测试纸条及其应用仅仅是示意性的，其中作为分离部件说明的单元可以是或者也可以不是物理上分开的，作为整体单元说明的部件可以是或者也可以不是整体物理单元，即可以位于一个地方，或者也可以分布到多个部位上。可以根据实际的需要选择其中的部分或者全部模块来实现本实施例方案的目的。本领域普通技术人员在不付出创造性的劳动的情况下，即可以理解并实施。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (11)
1.核酸信号放大体系，其特征在于，包括：捕获区、信号放大区和荧光信号捕获区；
所述捕获区包括：捕获探针，所述捕获探针与待测核酸链部分互补；
所述信号放大区包括：标签区、预放大区、初级放大区和次级放大区；
所述标签区包括：标签区探针；所述标签区探针包括：P1序列和P2序列；
所述预放大区包括：P3序列和P4序列；
所述初级放大区包括：P5序列和P6序列；
所述次级放大区包括：P7序列和P8序列；
所述荧光信号捕获区与待测核酸的荧光微球结合；
所述P1序列与待测核酸链部分互补；所述P2序列与所述P4序列互补；
所述P3序列与所述P5序列互补；所述P6序列与所述P7序列互补；
所述P2序列、所述P3序列、所述P6序列和所述P8序列为固定序列。
2.如权利要求1所述的核酸信号放大体系，其特征在于，所述P2序列具有：
(1)、如SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列；或
(2)、如(1)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(1)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(3)、与(1)或(2)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列；和/或
所述P3序列具有：
(4)、如SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列；或
(5)、如(4)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(41)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(6)、与(4)或(5)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列；和/或
所述P6序列具有：
(7)、如SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列；或
(8)、如(7)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(7)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(9)、与(7)或(8)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列；和/或
所述P8序列具有：
(10)、如SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列；或
(11)、如(10)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(10)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(12)、与(10)或(11)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列。
3.如权利要求1或2所述的核酸信号放大体系，其特征在于，所述预放大区与所述标签区的摩尔浓度比为(1～2):1；所述初级放大区与所述预放大区的摩尔浓度比为：(5～20):1；所述次级放大区与所述初级放大区的摩尔浓度比为：(5～20):1。
4.如权利要求1至3任一项所述的核酸信号放大体系，其特征在于，所述待测核酸链、所述标签区、所述预放大区、所述初级放大区与所述次级放大区的核酸互补区段数量比为：1:2:2:10:50。
5.如权利要求1至4任一项所述的核酸信号放大体系在核酸检测中的应用。
6.核酸检测试纸，其特征在于，包括：样品垫、检测膜和吸水垫；
所述检测膜上设有检测线和控制线；
所述控制线包被有二抗溶液；
所述检测线包被有抗原-抗体溶液；
所述抗体包括抗地高辛抗体；
所述抗原包括末端修饰地高辛分子的特定核酸链；
所述特定核酸链与如权利要求1至4任一项所述的核酸信号放大体系中的所述捕获探针的核酸链互补。
7.如权利要求6所述的核酸检测试纸，其特征在于，所述检测膜的一端与所述样品垫搭接，另一端与所述吸水垫搭接；
所述检测膜的孔径为8～15μm，宽度为25mm或18mm；
所述吸水垫的宽度为40～60mm；
所述样品垫的宽度为6～8mm；
所述检测线和所述控制线的宽度为1～2mm，所述检测线和所述控制线的间距为3～5mm。
8.如权利要求6或7所述核酸检测试纸的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：取所述检测膜、所述样品垫和所述吸水垫组装，获得待组装件；
S2：取所述二抗溶液和所述抗原-抗体溶液分别喷涂于所述检测膜后，烘干，获得所述核酸检测试纸；
所述二抗溶液包括：0.05～0.5mg/mL生物素-牛血清蛋白；
所述抗原的浓度为10～100μM，所述抗体的浓度为0.5～2mg/mL。
9.如权利要求6或7所述的核酸检测试纸和/或如权利要求8所述制备方法获得的核酸检测试纸在核酸检测中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述核酸检测包括如下步骤：
S1：取如权利要求1至4任一项所述的核酸放大体系中的所述捕获探针、所述信号放大区和所述荧光信号捕获区混合，第一加热，获得核酸分子放大体系溶液；
S2：取所述核酸分子放大体系溶液与待测核酸溶液混合，第二加热，获得混合液；
S3：取所述混合液滴加于所述样品垫后，依次滴加第一缓冲液、荧光微球和第二缓冲液，根据荧光强度获得检测结果。
11.如权利要求10所述的应用，其特征在于，所述混合液、所述第一缓冲液、所述荧光微球和所述第二缓冲液的体积比为：(2～5)：(2～5)：(1～2)：(2～5)。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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