CN117467732A - 一种白蛋白活性肽的制备方法及活性多肽 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及蛋类食品深加工技术领域，特别涉及一种白蛋白活性肽的制备方法及活性多肽，制备方法包括以下步骤：S1、将鸡蛋蛋清粉与水混合，保温润涨后得到料液；S2、在料液中加入地衣芽孢杆菌酸性蛋白酶进行水解，得到水解液；S3、将水解液灭酶、离心除杂后得到上清液，上清液经膜分离以截留多肽，即得所述白蛋白活性肽。该白蛋白活性肽具有保护胃蛋白酶活性的特性，可以用在食品、医药保健品或饲料中，作为胃蛋白酶的保护剂；而且经过酶解，白蛋白分子量降低，更易于吸收，也可以作为术后恢复的营养剂。

Description

一种白蛋白活性肽的制备方法及活性多肽
技术领域
本发明涉及蛋类食品深加工技术领域，特别涉及一种白蛋白活性肽的制备方法及活性多肽。
背景技术
胃蛋白酶是一种天冬氨酸类蛋白酶，因其优异的蛋白质降解作用而被广泛用于食品加工、医药和农牧业加工等众多行业，如氨基酸水解，多肽生产，动物饲养与饲料加工、皮革加工，果汁澄清，助消化药品等等。但是由于胃蛋白酶的热稳定性差和pH范围较窄，限制了它的应用范围，具体为：胃蛋白酶的稳定性差，持续时间短，加工温度超过60℃或pH＞5时很容易失活，为了达到良好的持续酶解效果，需要添加较高的活性的酶量，导致了胃蛋白酶使用成本的增加。因此，发现具有提高胃蛋白酶活性和稳定性的食品原料或添加剂具有广泛的工业价值和市场前景。
关于提高胃蛋白酶稳定性的研究有：边金霖在《雅安藏茶对胃蛋白酶的促进作用》中报道，雅安藏茶中儿茶素能提高胃蛋白酶活性；该文引证的参考文献报道，有机酸、氨基酸和VC等酸性物质均能有效提高蛋白酶活性。刘新泽在《饲粮中添加不同组合的酸化剂形态以及胃蛋白酶活性的影响》中研究认为，饲粮中添加0.1％(甲酸甲酸铵+精油)复合酸化剂提高了肉鸡的胃蛋白酶活性。
关于鸡卵清白蛋白加工活性多肽的研究有：金嫘在《中性蛋白酶酶解蛋清制备活性肽的研究》一文中报道的，用1398中性蛋白酶水解蛋清蛋白，可得到分子量主要是低于1350Da的寡肽。中国专利文献CN107183308A公开了碱性蛋白酶水解蛋清蛋白粉，得到蛋清源活性肽的方法。中国专利文献CN110477185A公开了用耐热蛋白酶THERMOASE PC10F水解蛋清蛋白加工抗氧化肽的方法。
综上，目前尚未发现具备保护胃蛋白酶、提高胃蛋白酶热稳定性的多肽的报道。
发明内容
为解决上述背景技术提到的现有技术的不足，本发明提供一种白蛋白活性肽的制备方法，包括以下步骤：
S1、将鸡蛋蛋清粉与水混合，保温润涨后得到料液；
S2、在料液中加入地衣芽孢杆菌酸性蛋白酶进行水解，得到水解液；
S3、将水解液灭酶、离心除杂后得到上清液，上清液经过膜分离以截留多肽，即得所述白蛋白活性肽。
进一步的，S1中，所述鸡蛋蛋清粉与水的质量比为1:(10-15)。
进一步的，S1中，所述保温润涨的温度为70-80℃，时间为60-120min。
进一步的，S2中，所述地衣芽孢杆菌酸性蛋白酶加入量按按蛋清粉中的蛋白质量计，每g加酶活3000u-5000u。
进一步的，S2中，调节所述料液的pH为2.5-4.0，水解温度为45-55℃，水解时间为60-120min。
进一步的，S3中，先将所述水解液的pH调至5.5-6.5，再将所述水解液加热至75-85℃灭酶。
进一步的，S3中，将所述上清液经膜分离以截留分子量为200-10000Da的多肽，经过浓缩和干燥即得粉状白蛋白活性肽。
再进一步，所述膜分离方法为：将所述上清液采用10000Da的超滤膜超滤，得到的滤出液再用200Da的纳滤膜纳滤浓缩。
优选上述干燥为冷冻干燥或喷雾干燥。
本发明还提供一种活性多肽，其组分包括上述的制备方法制得的白蛋白活性肽。
进一步的，所述活性多肽具有保护胃蛋白酶活性的特性。
优选的，将白蛋白活性肽与活力为4-11ku/g的胃蛋白酶按质量比(2-4):1混合具有提高胃蛋白酶热稳定性的作用。
本发明发现，白蛋白活性肽作为热稳定剂与胃蛋白酶混合使用时，胃蛋白酶初始活力应小于100u/m l，且该活性肽与胃蛋白酶的质量比在(2-4):1，在这一范围内提高胃蛋白酶稳定性的效果较好。其原理可能是，本发明的200-10000Da白蛋白肽在一定浓度和一定胃蛋白酶活力的作用下，能进一步水解生成具有保护胃蛋白酶的小肽(分子量主要分布在3000Da以下)，从而提高了胃蛋白酶的稳定性。当胃蛋白酶活力及白蛋白肽浓度超出一定范围时，胃蛋白酶酶解产生的祛保护作用的小肽产物会增多，从而使白蛋白肽对胃蛋白酶的保护作用减弱。
与现有技术相比，本发明提供的一种白蛋白活性肽的制备方法及活性多肽具有如下有益效果：
(1)本发明提供的白蛋白活性肽的加工工艺简单，步骤少,制得的多肽纯度较高,在86％以上；
(2)通常胃蛋白酶在pH＞5或60-70℃加热的条件下，酶很容易失活，而本发明提供的白蛋白活性肽不但能提高胃蛋白酶的热稳定性，延长胃蛋白酶的活性半衰期50％以上，而且能够扩大胃蛋白酶的PH活性范围。具体表现为：在胃蛋白酶中加入白蛋白活性肽后，在pH5-7或在60-70℃以下加热30-40分钟内的热稳定性和pH稳定性明显提高；
(3)本发明提供的白蛋白活性肽在与胃蛋白酶混合溶解后，可进一步被水解成低分子多肽，3000Da以下的小分子肽在90％以上，由于小分子肽可以快速被人体吸收，因此也可以作为保健品或恢复体力的营养品等功能产品。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明提供的不同比例白蛋白活性肽对猪胃蛋白酶活力的影响曲线图；
图2为本发明提供的样品的分子量分布图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供一种白蛋白活性肽的制备方法的操作示例，具体步骤如下：
S1、将鸡蛋蛋清粉与水按照质量比1：(10-15)混合，70-80℃保温润涨60-120min，得到料液；
S2、调节料液的pH至2.5-4.0，加入地衣芽孢杆菌酸性蛋白酶,在45-55℃保温水解60-120min，得到水解液；其中地衣芽孢杆菌酸性蛋白酶的加入量按按蛋清粉中的蛋白质量计，每g加酶活3000u-5000u。
S3、调节水解液的pH至5.5-6.5后，加热到75-85℃灭酶10-15min，离心除去不溶物，得到上清液，再将上清液用10000Da的超滤膜超滤，得到的滤出液再用200Da的纳滤膜纳滤浓缩，即得白蛋白活性肽；
S4、将白蛋白活性肽干燥成粉状，即得白蛋白肽粉。
本发明提供如下实施例和对比例：
实施例1
一种白蛋白活性肽的制备方法如下：
S1、取100g鸡蛋蛋清粉(蛋白含量84％)，加入清水1000g混合，在80℃保温润涨60min，得到料液；
S2、用盐酸调节料液的pH到2.6，然后加入地衣芽孢杆菌酸性蛋白酶(上海缘聚生物科技有限公司)300ku,在52℃保温水解95min，得到水解液；
S3、调节水解液的pH到6.0，然后在85℃加热灭酶10min；离心除去不溶物沉淀，上清液先用10000Da的超滤膜超滤，得到的滤出液再经200Da的纳滤膜纳滤浓缩，即得白蛋白活性肽浓缩液；
S4、将浓缩液经过冷冻干燥，得到分子量为200-10000Da、多肽含量86.8％的白蛋白肽粉。
本实施例白蛋白活性肽在不同添加比例情况下的猪胃蛋白酶活力影响试验：
取6份活力为4100u/g的猪胃蛋白酶，每份1克，其中5份分别加入实施例1制得的白蛋白肽粉1g(记为A1)、2g(记为A2)、3g(记为A3)、4g(记为A4)和5g(记为A5)，另外1份(记为A0)不加白蛋白肽粉；纯猪胃蛋白酶粉A0和其他5份混合酶粉分别加入100m l清水和5g大豆分离蛋白，溶解成A0、A1、A2、A3、A4和A5样液(猪胃蛋白酶初始活力均为41.0u/m l)，用盐酸调PH到3.0，然后放入70℃保温加热不同时间，定时取样放入冰水中冷却到0℃左右保存，之后测定各时间点样液的猪胃蛋白酶活力(国标福林酚法)，计算半衰期T1/2，结果见图1和表1。
表1不同白蛋白肽添加比例的猪胃蛋白酶液在70℃的活力T1/2与增加率
注：半衰期T1/2＝0.693/k；k＝(lnc1-lnc2)/t2-t1,t2-t1＝-10,c1＝41。
从以上实验可以看出,没有加白蛋白肽粉的原酶(A0)和按1:1和1:5加入白蛋白肽粉的A1和A5在70℃加热20min的活性完全丧失，A1和A5的酶活半衰期相对A0虽有延长，但是增加率不足20％。白蛋白肽粉和猪胃蛋白酶添加比例为2:1(A2)，3:1(A3)和4:1(A4)时，猪胃蛋白酶的酶活半衰期T1/2相比原酶A0分别增加了150％以上。添加比例为3:1(A3)和4:1(A4)时的酶解液在加热30min以上仍然有胃蛋白酶活性，比例为2:1(A2)时，接近30min有活性。所以，该白蛋白肽粉对猪胃蛋白酶的适宜添加比例为(2-4):1。其原理可能是，用地衣芽孢杆菌酸性蛋白酶水解得到的200-10000Da白蛋白多肽，在一定活力的猪胃蛋白酶的作用下，能进一步水解生成具有保护猪胃蛋白酶的多肽，其中的小分子肽具有保护猪胃蛋白酶的作用。
白蛋白肽粉添加比为5:1(A5)时，对猪胃蛋白酶的保护性下降的原因可能是:加入的200-10000Da白蛋白肽接触到猪胃蛋白酶后，水解出具有保护胃蛋白酶的物质，同时也可能水解产生不利于保护胃蛋白酶的物质。当白蛋白肽加入比例适宜时，保护性多肽占主导，对胃蛋白酶保护作用显著；当加入白蛋白浓度过高时，不利于胃蛋白酶保护的水解物增加，保护胃蛋白酶稳定性的作用即减弱，并可能抵消对保护性的多肽的作用。
实施例2
一种白蛋白活性肽的制备方法如下：
S1、取100g鸡蛋蛋清粉(蛋白含量84％)，加入清水1500g混合，在70℃保温润涨120min，得到料液；
S2、用乳酸调节料液的pH到3.5，然后加入地衣芽孢杆菌酸性蛋白酶(上海缘聚生物科技有限公司)420ku,在45℃保温水解120min，得到水解液；
S3、调节水解液的pH到6.5，然后在75℃加热灭酶15min；离心除去不溶物沉淀，上清液先用10000Da的超滤膜超滤，得到的滤出液再用200Da的纳滤膜纳滤，即得白蛋白活性肽的浓缩液；
S4、将浓缩液经过喷雾干燥，得到分子量为200-10000Da、多肽含量86.25％的白蛋白肽粉。
本实施例白蛋白肽对牛胃蛋白酶活力的影响试验：
取活力为9000u/g的牛胃蛋白酶21份，每份1克；其中12份各加入2g实施例2制得的白蛋白肽粉(记为B1)，另外9份不加入白蛋白肽粉(记为B0)，21份样品分别加入100m l清水中溶解(牛胃蛋白酶初始活力均为90u/m l)。取6份B1和6份B0，用盐酸和碳酸钠分别调各样品的PH为2.0，3.0，4.0，5.0，6.0和7.0，放入60℃的水浴锅中同时加热30分钟，加热结束后0℃保存，之后测定并计算各pH条件下样液的牛胃蛋白酶活力和变化率，结果见表2。
另取6份B1分别调各样品的pH为2.0，3.0，4.0，5.0，6.0和7.0，取3份B0分别调各样品的pH为2.0、3.0和4.0，以上9份样本放入70℃的水浴锅中同时加热30分钟，反应结束后迅速放入冰水中冷却到0℃保存，之后测定各pH条件下样液的牛胃蛋白酶活力，计算变化率，结果见表2。
表2不同白蛋白肽添加比例的牛胃蛋白酶活力在不同pH下的变化
从表2可以看出，在相同温度和pH条件下，加入白蛋白肽的各B1样品中的牛胃蛋白酶活性均远高于没加白蛋白肽的B0样品。在60℃加热30min后，在pH为2-7的B1样品中的牛胃蛋白酶均有活性，而在pH为5以上的B0样品中的牛胃蛋白酶均已失活；并且，pH为2-4的B1样品中牛胃蛋白酶活性比B0平均提高了255.4％。在70℃加热30min后，在pH为2-4的B0样品中的牛胃蛋白酶活性均已丧失，而B1样品中的牛胃蛋白酶在pH2-6的条件下均有活性。由此可见，白蛋白肽不但能够提高牛胃蛋白酶的热稳定性，而且能提高牛胃蛋白酶的pH稳定性和使用范围。
取实施例2制得的白蛋白肽粉用清水稀释到20mg/ml,记为A组；另取pH为3、60℃加热水解并灭酶的B1样品，记为B组，用紫外检测仪和凝胶G50检测A组和B组样品的分子量分布，结果见图2和表3。
从图2和表3可知，实施例2制得的白蛋白肽没与牛胃蛋白酶混合成液体水解之前，该混合肽在小于10000Da范围内均有分布，最大洗脱峰出现在60.8m l(对应的分子量为5210Da)。当该白蛋白肽的B1样品加入牛胃蛋白酶，60℃水解30分钟后，水解物变成了主要为小于5000Da的多肽混合物，主要洗脱峰出现在91.5m l(对应的分子量为1920Da),多肽主要为3000Da以下的小肽。由此认为，200-10000Da的白蛋白肽进一步被牛胃蛋白酶水解为小肽后，其中的某段分子量的多肽对牛胃蛋白酶的结构具有保护作用，因此提高了牛胃蛋白酶的热稳定性。
实施例3
一种白蛋白活性肽的制备方法如下：
S1、取100g鸡蛋蛋清粉(蛋白含量84％)，加入清水1400g混合，在75℃保温润涨90min，得到料液；
S2、用盐酸调节料液的pH到3.0，然后加入地衣芽孢杆菌酸性蛋白酶(上海缘聚生物科技有限公司)336ku,在50℃保温水解100min，得到水解液；
S3、调节水解液的pH到5.8，然后在75℃加热灭酶15min；离心除去不溶物沉淀，上清液先用10000Da的超滤膜超滤，得到的滤出液再用200Da的纳滤膜纳滤，即得白蛋白活性肽的浓缩液；
S4、将浓缩液经过冷冻干燥，得到分子量为200-10000Da、多肽含量87.42％的白蛋白肽粉。
本实施例白蛋白肽对猪胃蛋白酶活力影响的对比试验：
取8份活力为7.3ku/g的猪胃蛋白酶，每份1克，其中4份分别加入实施例3制得的白蛋白肽粉4g(记为C1),另外4份不加白蛋白肽粉(记为C0)；在C0和C1中分别加入100ml清水溶解(8份样液的初始猪胃蛋白酶活力均为73u/ml)，调pH到3.6，然后在每份样液中各加入6克扇贝蛋白粉，把C0和C1两两配成4对，分别放在40℃，50℃，60℃和70℃的水浴锅加热30min，加热结束后迅速放入冰水中冷却到0℃保存；之后用福林酚法测定各时间点样液的猪胃蛋白酶活力，按照GBT 22492-2008的方法检测多肽含量，结果见表4。
表4胃酶在不同温度下水解扇贝蛋白的水解液酶活下降率与多肽含量
表4可知，猪胃蛋白酶在40-70℃酶解扇贝蛋白粉，其中加了白蛋白肽的C1样液在水解后的多肽含量比未加白蛋白肽的C0样液增加18-59％，温度越高，多肽增加率越大，说明添加白蛋白肽可以提高猪胃蛋白酶的热稳定性和酶活力；猪胃蛋白酶在40-60℃酶解扇贝蛋白粉30min后，C1样液的胃蛋白酶活力下降率比C0减少(ΔC)20-30％。因此可以说明，白蛋白活性肽按2:1的质量比与猪胃蛋白酶混合后，其溶液中的猪胃蛋白酶得到了一定的保护，水解扇贝蛋白的能力也明显提高。
实施例4
一种白蛋白活性肽的制备方法如下：
S1、取100g鸡蛋蛋清粉(蛋白含量84％)，加入清水1500g混合，在75℃保温润涨90min，得到料液；
S2、用盐酸调节料液的pH到3.2，然后加入地衣芽孢杆菌酸性蛋白酶(上海缘聚生物科技有限公司)252ku,在50℃保温水解120min，得到水解液；
S3、调节水解液的pH到6.5，然后在80℃加热灭酶12min；离心除去不溶物沉淀，上清液先用10000Da的超滤膜超滤，得到的滤出液再用200Da的纳滤膜纳滤，即得白蛋白活性肽的浓缩液；
S4、将浓缩液经过冷冻干燥，得到分子量为200-10000Da、多肽含量87.20％的白蛋白肽粉。
对比例1
在步骤S2中用等酶活的黑曲霉酸性蛋白酶3.350(市售常规酶制剂)替换地衣芽孢杆菌酸性蛋白酶进行水解，其他步骤均与实施例4相同。所得白蛋白肽粉的多肽含量84.18％。
对比例2
在步骤S2中用等酶活的米曲霉酸性蛋白酶MSD(阿玛诺天野公司生产)替换地衣芽孢杆菌酸性蛋白酶进行水解，其他步骤均与实施例4相同。所得白蛋白肽粉的多肽含量81.95％。
对比例3
在步骤S2中用等酶活的宇佐美曲霉酸性蛋白酶537(市售常规酶制剂)替换地衣芽孢杆菌酸性蛋白酶进行水解，其他步骤均与实施例4相同。所得白蛋白肽粉的多肽含量86.52％。
对比例4
在步骤S2中用等酶活的蜂蜜曲霉蛋白酶(阿玛诺天野公司3SD蛋白酶)替换地衣芽孢杆菌酸性蛋白酶进行水解，料液的pH值为8.0，水解温度为45℃，水解结束后95℃灭酶10min，其他处理均与实施例4相同。所得白蛋白肽粉的多肽含量85.33％。
对比例5
在步骤S2中用等酶活的地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶(市售常规酶制剂)替换地衣芽孢杆菌酸性蛋白酶进行水解，料液的pH值为10.0，水解温度为60℃，水解结束后90℃灭酶10min，其他处理均与实施例4相同。所得白蛋白肽粉的多肽含量82.49％。
取实施例4和对比例1-5制得的白蛋白肽粉分别进行以下操作：
取活力为4100u/g的猪胃蛋白酶2份，每份1克，加入100ml清水中，一份加入白蛋白肽粉3克(记为D1)溶解,另外一份不加白蛋白肽粉(记为D0)溶解；两份溶液分别加入脱脂火麻仁蛋白粉5克，溶解成D0和D1样液(猪胃蛋白酶初始活力均为41u/ml)；盐酸调样液PH到3.2，然后60℃保温加热10分钟，取出样液迅速放入冰水中冷却到0℃保存，之后用福林法测定该样品的猪胃蛋白酶活力C2并计算半衰期T1/2，结果见表5。
表5不同样液在60℃的猪胃蛋白酶活力T1/2
注：T1/2＝0.693/k；k＝(l nC1-l nC2)/t2-t1；t2-t1＝10，C1＝41。
由表5可知，对比例1-5各样品的酶活T1/2均与没加白蛋白肽的D0相近，远低于实施例4，说明这些对比例样品基本上没有提高猪胃蛋白酶稳定性的作用，而实施例4的酶活T1/2比D0的T1/2延长了279.68％，说明本发明实施例提供的白蛋白肽能够提高猪胃蛋白酶在60℃下的稳定性。
本发明得到这种活性白蛋白肽是在抗氧化实验中偶然发现其具有保护胃蛋白酶活性作用的。为了验证其他蛋白酶水解鸡卵清白蛋白是否有这种活性，我们又用相同的方法分别进行了数十种单酶或复合蛋白酶水解白蛋白试验(篇幅所限未列出)，除了地衣芽孢杆菌酸性蛋白酶外，其他酶水解液无明显提高胃蛋白酶稳定性的作用。
需要说明的是：
本文中所使用的术语“食品”一词是广义的，包括人类的食物和饮物。在某些实施方案中，所述食物产品适合于以及设计用于人类进食。本申请白蛋白活性肽可用于制备粉剂、片剂、凝胶剂等固体制剂，也分散于液体中制成液体制剂，包括但不限于实施例方案。
本发明中所采用的原料，例如猪胃蛋白酶、牛胃蛋白酶等，若无特殊说明，均为现有的市售产品，本领域技术人员可采购获取。
本实施例中所用试剂、仪器未注明生产厂家等信息，均为可以通过市场购买获得的常规产品。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (9)

1.一种白蛋白活性肽的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1、将鸡蛋蛋清粉与水混合，保温润涨后得到料液；
S2、在料液中加入地衣芽孢杆菌酸性蛋白酶进行水解，得到水解液；
S3、将水解液灭酶、离心除杂后得到上清液，上清液经过膜分离以截留多肽，即得所述白蛋白活性肽。
2.根据权利要求1所述的白蛋白活性肽的制备方法，其特征在于：S1中，所述鸡蛋蛋清粉与水的质量比为1：(10-15)；
所述保温润涨的温度为70-80℃，时间为60-120min。
3.根据权利要求1所述的白蛋白活性肽的制备方法，其特征在于：S2中，所述地衣芽孢杆菌酸性蛋白酶加入量按所述鸡蛋蛋清粉中的蛋白质量计，每g加酶活力为3000u-5000u。
4.根据权利要求1所述的白蛋白活性肽的制备方法，其特征在于：S2中，调节所述料液的pH为2.5-4.0，水解温度为45-55℃，水解时间为60-120min。
5.根据权利要求1所述的白蛋白活性肽的制备方法，其特征在于：S3中，先将所述水解液的pH调至5.5-6.5，再将所述水解液加热至75-85℃灭酶。
6.根据权利要求1所述的白蛋白活性肽的制备方法，其特征在于：S3中，将所述上清液经膜分离以截留分子量为200-10000Da的多肽，经过浓缩和干燥即得粉状白蛋白活性肽。
7.根据权利要求6所述的白蛋白活性肽的制备方法，其特征在于：所述膜分离的方法为：将所述上清液采用10000Da的超滤膜超滤，得到的滤出液再用200Da的纳滤膜纳滤浓缩。
8.一种活性多肽，其特征在于：其组分包括如权利要求1-7任一项所述的制备方法制得的白蛋白活性肽。
9.根据权利要求8所述的活性多肽，其特征在于：所述活性多肽具有保护胃蛋白酶活性的特性。
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