CN117467000A - 抗肠炎沙门菌单克隆抗体、包含其的免疫磁珠及其应用 - Google Patents

抗肠炎沙门菌单克隆抗体、包含其的免疫磁珠及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN117467000A
CN117467000A CN202210905842.6A CN202210905842A CN117467000A CN 117467000 A CN117467000 A CN 117467000A CN 202210905842 A CN202210905842 A CN 202210905842A CN 117467000 A CN117467000 A CN 117467000A
Authority
CN
China
Prior art keywords
monoclonal antibody
salmonella enteritidis
seq
immunomagnetic beads
variable region
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202210905842.6A
Other languages
English (en)
Inventor
韩先干
李师莹
张海洋
蒋蔚
宋小凯
龚建森
苗晋锋
陈兆国
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Veterinary Research Institute CAAS
Original Assignee
Shanghai Veterinary Research Institute CAAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Veterinary Research Institute CAAS filed Critical Shanghai Veterinary Research Institute CAAS
Priority to CN202210905842.6A priority Critical patent/CN117467000A/zh
Publication of CN117467000A publication Critical patent/CN117467000A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
    • C07K16/1203—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria
    • C07K16/1228—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • C07K16/1235—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia from Salmonella (G)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54346—Nanoparticles
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • G01N33/56916—Enterobacteria, e.g. shigella, salmonella, klebsiella, serratia
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/35—Valency
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
    • G01N2333/24—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • G01N2333/255—Salmonella (G)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了抗肠炎沙门菌单克隆抗体、包含其的免疫磁珠及其应用。所述抗肠炎沙门菌的单克隆抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述轻链可变区的LCDR1包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，LCDR2包含氨基酸序列KVS，LCDR3包含如SEQ ID NO:2所示的序列；所述重链可变区的HCDR1～HCDR3分别包含如SEQ ID NO:3、4和5所示的序列。本发明抗肠炎沙门菌单克隆抗体的效价高；并适用于单克隆抗体免疫磁珠的制备，制备得到的单克隆抗体免疫磁珠对于肠炎沙门菌具有高的特异性，对于6株来源不同的肠炎沙门菌捕获率可达90％以上。

Description

抗肠炎沙门菌单克隆抗体、包含其的免疫磁珠及其应用
技术领域
本发明属于病原菌分离技术领域，具体涉及一种抗肠炎沙门菌单克隆抗体、包含其的免疫磁珠及其应用。
背景技术
肠炎沙门菌作为重要的人畜共患病原菌，其常规的检测方法费时耗力、仪器昂贵，不能满足检测需求，因此目前市场急需开发肠炎沙门菌的快速检测技术。目前针对肠炎沙门菌的检测方法主要有GB 4789.4-2016检测方法、分子生物学检测方法和免疫学检测方法等。其中免疫学检测方法是重要的检测方法之一，单克隆抗体因其特异性强，效价高，化学性质稳定，一直是免疫学检测方法的重要工具。
本研究利用灭活的肠炎沙门菌作为免疫原，免疫Balb/C小鼠。通过杂交瘤技术制备分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，ELISA方法筛选效价高、特异性强的阳性细胞株，经过4次亚克隆后得到稳定分泌抗金葡菌抗体的细胞株。扩大培养后注入小鼠腹腔，收集腹水，制备单克隆抗体，ELISA方法测定腹水的效价和特异性，通过简易过碘酸钠标记法测定不同抗体间与抗原表位的结合是否相互影响，通过亚型测定试剂盒鉴定单克隆抗体的亚型，为后续肠炎沙门菌的免疫磁珠制备奠定基础。
磁珠富集技术，是利用表面覆盖特定官能团的纳米级磁珠与具有某种特定性状的生物化学分子通过共价或非共价方式偶联，进而与目标物发生特异性结合，通过磁响应将目标物从溶质中分离出来的技术。免疫磁珠因其在免疫学检测上的独特优势，一直在食源性检测领域发挥着重要的作用。
现有技术中部分专利申请涉及使用抗体免疫磁珠进行肠炎沙门菌的富集，然而其中所用抗体为人IgG，因而难以保证检测方法的特异性，由此进一步地需要将捕获到的细菌在鉴别培养基上培养又增加了时间成本；另外，利用人IgG抗体的免疫磁珠其捕获率也低。因此，急需能够特异性针对肠炎沙门菌的抗体。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术中存在的富集肠炎沙门菌的抗体免疫磁珠特异性与捕获率、敏感度难以兼顾等缺陷，提供一种抗肠炎沙门菌单克隆抗体、包含其的免疫磁珠及其应用。
本发明技术方案的第一方面提供一种抗肠炎沙门菌的单克隆抗体，其包含重链可变区和轻链可变区，所述轻链可变区的LCDR1包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，LCDR2包含氨基酸序列KVS，LCDR3包含如SEQ ID NO:2所示的序列；所述重链可变区的HCDR1～HCDR3分别包含如SEQ ID NO:3、4和5所示的序列。
较佳地，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:6所示的序列，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:8所示的序列。
更佳地，所述单克隆抗体还包括鼠重链恒定区和鼠人轻链恒定区，所述鼠重链恒定区优选IgG1，所述鼠轻链恒定区优选Kappa型。
进一步更佳地，所述的单克隆抗体的轻链包含如SEQ ID NO:7所示的序列，重链包含如SEQ ID NO:9所示的序列。
本发明中，抗体可变区CDR的编号/定义规则采用了IMGT，基于同样的抗体序列以其他规则例如Kabat、AbM、Chothia或Contact获得的可变区或CDR的技术方案仍属于本发明保护的范围。
本发明技术方案的第二方面提供一种分离的核酸，其编码如第一方面所述的单克隆抗体。
优选地，编码所述重链的核酸包括如SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列，编码所述轻链的核酸包括如SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列。
本发明技术方案的第三方面提供一种重组表达载体，其包括如第二方面所述的核酸。
本发明技术方案的第四方面提供一种转化体，其包含如第二方面所述的核酸或第三方面所述的重组表达载体。
优选地，所述转化体的宿主细胞为哺乳动物细胞或大肠杆菌。
本发明技术方案的第五方面提供一种制备单克隆抗体的方法，其在适合如第四方面所述的转化体生长的条件下培养所述转化体，使其表达所述的单克隆抗体。
本发明技术方案的第六方面提供一种单克隆抗体免疫磁珠，其包含如第一方面所述的单克隆抗体。
所述的单克隆抗体免疫磁珠可通过本领域常规的制备方法进行制备。
在一些优选的实施例中，制备其的方法包括使用活化的免疫磁珠偶联所述的单克隆抗体。
在一些更优选的实施例中，所述活化使用包括EDC和NHS的混合液；优选所述EDC和NHS的比例为1:1，和/或，在37℃、200rpm活化30min。
在另一些优选的实施例中，所述偶联包括将所述活化的免疫磁珠与所述单克隆抗体共培养，以使二者发生偶联。
在另一些更优选的实施例中，所述偶联包括以下步骤中的一种或多种：
(1)用MEST缓冲液、pH 6.0重悬活化的免疫磁珠；优选重复3次；
(2)用MEST缓冲液、pH 7.0重悬活化的免疫磁珠，弃上清后重复1次；优选所述MEST缓冲液的浓度为0.025mol/L；
(3)加入所述单克隆抗体，混匀后重悬，使与活化的免疫磁珠偶联，弃上清获得单克隆抗体免疫磁珠；优选30r/min室温活化3h；
(4)用MEST缓冲液、pH 7.4重悬单克隆抗体免疫磁珠，弃上清；优选重复3次；
(5)用封闭液优选含1％BSA的0.01mol/L PBST、pH 7.4封闭，弃上清；
(6)用PBST缓冲液、pH 7.4重悬，弃上清；优选重复4次；
(7)用含0.02％NaN3和0.5％BSA的0.01mol/L PBST、pH 7.4重悬。
在一些优选的实施例中，所述免疫磁珠可为本领域常规，例如PM3-020(直径180nm)、PM3-050(直径700nm)和SM3-D100(直径1150nm)，较佳地为直径100～200nm的免疫磁珠，更佳地为180nm的免疫磁珠。
本发明技术方案的第七方面提供一种如上第一方面所述的单克隆抗体、第二方面所述的单克隆抗体免疫磁珠在检测肠炎沙门菌或制备检测肠炎沙门菌的诊断剂中的应用。
本发明技术方案的第八方面提供一种检测肠炎沙门菌的方法，其包括以下步骤：
(1)按照肠炎沙门菌检验国际方法中的样品前处理办法处理样品，将如上所述的单克隆抗体免疫磁珠与所述样品在偶联缓冲液中孵育，例如孵育40～50min；
(2)计算捕获率。
较佳地，所述方法为非诊断目的的方法。
在一些优选的实施例中，步骤(1)中所述的偶联缓冲液优选MEST缓冲液；所述MEST缓冲液的浓度优选0.025M，pH优选7.0。
在本发明一较佳实施方案中，步骤(1)中所述样品在偶联缓冲液中孵育15～75min，优选45min。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
本发明制备得到的单克隆抗体的效价高(可达1:1024000以上)，且所述单克隆抗体的特异性强；并适用于单克隆抗体免疫磁珠的制备，制备得到的单克隆抗体免疫磁珠对于肠炎沙门菌具有高的特异性，对于6株来源不同的肠炎沙门菌捕获率可达90％以上，而对于其余4种常见的非肠炎沙门菌的菌株捕获率可低于10％；高敏感性，细菌数量为104CFU、103CFU和102CFU时，单克隆抗体免疫磁珠的捕获率可达85％以上，以及具有高捕获率。此外，本发明的免疫磁珠在更大的体系里(如，1mL左右的体系中)也能很好地工作。简言之，本发明的单克隆抗体免疫磁珠操作简单、反应时间短，基质对于捕获率的影响低，为后续的分子检测方法奠定了基础。
附图说明
图1为免疫小鼠所用的6种肠炎沙门菌的PCR鉴定结果；M：Marker DL2000，1：肠炎沙门菌ATCC13067，2：肠炎沙门菌CMCC50041，3：肠炎沙门菌JA070，4：肠炎沙门菌JA133，5：肠炎沙门菌SM012，6：肠炎沙门菌SM013，7：阳性对照，8：阴性对照。
图2为免疫小鼠所用的6种肠炎沙门菌的革兰氏染色鉴定结果；A：肠炎沙门菌ATCC13067革兰氏染色结果，B：肠炎沙门菌CMCC50041革兰氏染色结果，C：肠炎沙门菌JA070革兰氏染色结果，D：肠炎沙门菌JA133革兰氏染色结果，E：肠炎沙门菌SM012革兰氏染色结果，F：肠炎沙门菌SM013革兰氏染色结果。
图3为SP2/0细胞(A)和细胞融合后第三天的单克隆(B)观察。
图4为免疫磁珠偶联缓冲液的选择；1：MEST(0.025M pH7.0)；2：MEST(0.025MpH6.0)；3：PBST(0.01M pH7.0)；4：PBS(0.01M pH7.0)；(*，p＜0.05)
图5为免疫磁珠最佳直径的选择。
图6为不同捕获时间对捕获率的影响。
图7为免疫磁珠的特异性实验结果；1：肠炎沙门菌CMCC50041，2：肠炎沙门菌ATCC13076，3：肠炎沙门菌JA070，4：肠炎沙门菌JA133，5：肠炎沙门菌SM012，6：肠炎沙门菌SM013，7：金黄色葡萄球菌CMCC26003，8：单核细胞增生李斯特菌CICC21662，9：多杀性巴氏杆菌2016ds12，10：肠出血型大肠杆菌O157ATCC43889，11：鼠伤寒沙门菌SL14028，12：鸡白痢沙门菌ATCC10398，13：变形杆菌2019prom21。
图8为免疫磁珠的敏感性实验结果。
图9为不同捕获体系和磁珠量对于免疫磁珠捕获率的影响；1：200μL磁珠，800μL菌液；2：100μL磁珠，100μL菌液；3：100μL磁珠，900μL菌液；(*p＜0.05)。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实验材料：
1.实验菌株和动物
肠炎沙门菌ATCC13076，鸡白痢沙门菌ATCC10398，铜绿假单胞菌ATCC9027，肠出血性大肠杆菌O157 ATCC43889，坂崎肠杆菌ATCC21550，副溶血弧菌ATCC33847购于美国菌种保藏中心(American type culture collection，ATCC)；金黄色葡萄球菌CMCC26003购于中国医学细菌保菌管理中心(National Center for Medical Culture Collections，CMCC)；单核细胞增生李斯特菌CICC21662购于中国工业菌种保藏管理中心(China Center ofIndustrial Culture Collection，CICC)。禽致病性大肠杆菌DE17，奇异变形杆菌2019prom21，多杀性巴氏杆菌2016ds12，肠炎沙门菌JA133(禽源)，JA070(禽源)，SM012(猪源)，SM013(猪源)、大肠杆菌308和223为本实验室分离株。鼠伤寒沙门菌SL14028由本实验室保存。Balb/C小鼠和昆明鼠购自上海吉畅生物公司。
2.主要试剂及培养基
LB液体培养基：10g NaCl、10g胰蛋白胨、5g酵母浸出物溶解至1L双蒸水中，调节溶液pH至7.4，在高压锅内121℃高压灭菌15min，温度下降后保存至4℃备用。
LB固体培养基：15g琼脂粉、10g NaCl、10g胰蛋白胨和5g酵母浸出物溶解至1L双蒸水中，调节溶液pH至7.4，在高压锅内121℃高压灭菌15min，冷却至45℃后，倒入灭菌平板中，完全冷却后，保存至4℃备用。
麦康凯琼脂培养基：20g蛋白胨、10g乳糖、5g氯化钠、5g牛胆盐、12g琼脂和0.075g中性红溶解到1L双蒸水中，调节溶液pH至7.4，在高压锅内121℃高压灭菌15min，冷却至45℃后，倒入灭菌平板中，完全冷却后，保存至4℃备用。
亚硒酸盐胱氨酸增菌液(SC)：5g蛋白胨、4g乳糖、4g亚硒酸氢钠、5.5g磷酸氢二钠、4.5g磷酸二氢钠和0.01g L-胱氨酸加热溶解至1L无菌蒸馏水中，无菌操作分装于灭菌容器中，现配现用，无需高压灭菌。
磷酸盐缓冲液(PBS)：0.2g KCl，0.2g KH2PO4和8g NaCl定容至1L双蒸水，调节pH至7.4，用高压锅高压灭菌121℃15min，降温后室温保存备用。
50×TAE：57.1mL冰醋酸，242g Tris和100mL 0.5mol/L EDTA(pH 8.0)，定容至1L后混匀，室温保存备用，使用时50倍稀释。
1％琼脂糖凝胶：100mL 1×TAE缓冲液溶解1g琼脂糖，于微波炉中加热至琼脂充分溶解，温度降至60℃左右，后加入4μL DNA染料Goldview，混匀后倒入模具中凝固备用。
DMEM完全培养基：20mL胎牛血清(美国Gibco公司)，100μL青链霉素(PS)和加入高糖DMEM(美国Gibco公司)至100mL，保存至4℃备用。
HAT培养基：10mL FBS，50μL PS，1mL HAT和加入高糖DMEM至50mL，保存至4℃备用。
HT培养基：10mL FBS，50μL PS，1mL HT和加入高糖DMEM至50mL，保存至4℃备用。
冻存液：70mL高糖DMEM，20mL FBS，10mL DMSO，保存至-20℃备用。
ELISA包被液：1.696g Na2CO3，2.856g NaHCO3定容至1L双蒸水，调节pH至9.6，保存至4℃备用。
ELISA缓冲液(PBST)：1L PBS加入0.5mL Tween-20混匀后，常温保存备用。
ELISA终止液：178.3mL双蒸水滴加浓硫酸(98％)21.7mL。
HRP标记的羊抗鼠IgG购买于Abcom公司。
6孔、12孔、24孔和96孔细胞培养板，25mL细胞培养瓶和96孔酶标板购买于Costar公司。
磷酸盐吐温缓冲液(PBST)：0.2g KCl，0.2g KH2PO4和8g NaCl定容至1L双蒸水，调节pH至7.4，加入50μL Tween-20，用高压锅高压灭菌121℃15min，降温后，0.22μm滤器过滤，4℃保存备用。
N-羟基邻苯二甲酰亚胺(NHS)：购自SIGMA公司，保存至4℃，使用时配成5mg/mL溶液，0.22μm滤器过滤，现配现用。
1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)：购自Thermoscientific公司，保存至4℃，使用时配成5mg/mL溶液，0.22μm滤器过滤，现配现用。
2-(N-吗啉基)乙磺酸和4-吗啉乙磺酸(MES)：购自SIGMA公司，保存至4℃。
缓冲液MEST(活化用)：100mL双蒸水溶解MES 0.488g，调节pH至6.0，加入50μLTween-20，后用0.22μm滤器过滤，4℃保存。
缓冲液MEST(偶联用)：100mL双蒸水溶解MES 0.488g，调节pH至7.0，加入50μLTween-20，后用0.22μm滤器过滤，4℃保存。
封闭液：在PBST中加入1％BSA，0.22μm滤器过滤后，4℃保存。
储存液：在1L PBST中加入0.2g NaN3和5g BSA，0.22μm滤器过滤后，4℃保存。
磁珠：购买于苏州海狸生物医学工程有限公司。
3.主要仪器及软件
恒温培养箱(型号GNP-9270BS-III)：购买于上海新苗公司；恒温震荡培养箱(型号TS-2102)：购买于北京创新思成公司；电子分析天平：购买于METTLER TOLEDO公司；4℃冰箱，-20℃冰箱：购买于中国海尔公司；-40℃冰箱，-80℃超低温冰箱：购买于Panasonic公司；PCR仪：购买于德国Eppendorf公司；倒置显微镜：购买于德国蔡司公司；核酸电泳仪：购买于上海天能科技有限公司；凝胶成像系统：购买于美国Alpha公司；分光光度计(型号SmartSpec Plus specphotometer)：购买于美国Bio-Rad公司；台式冷冻高速离心机：购买于北京创新思成公司；乳化仪：购买于Amalgamator公司；多功能酶标仪(型号SynergyII)：购买于美国BIOTEK公司；台式冷冻高速离心机：购买于北京创新思成公司；磁力架：购买于上海奥瑞微纳新材料科技有限公司；GraphPad Prism 8、IBM SPSS Statistics软件进行数据分析。
实施例1肠炎沙门菌菌株的复苏、纯化、鉴定
1.肠炎沙门菌的复苏和纯化
将肠炎沙门菌ATCC13076、CMCC50041从4℃冰箱中取出，掰开安瓿瓶，用接种环挑起固体菌种至3mL液体LB培养基内，同时接种SM012和SM013、JA070、JA133至3mL液体LB培养基内，置于37℃恒温摇床中，200rpm培养过夜。培养后的菌液在LB固体培养基上进行三区划线，置于37℃恒温培养箱过夜培养。挑取平板上单菌落至5mL LB液体培养基，置于37℃恒温摇床中，200rpm过夜培养。
2.肠炎沙门菌的PCR鉴定
取上述纯化后的肠炎沙门菌菌液各500μL至1.5mL EP管内，12000rpm离心5min，弃上清。用1mL PBS溶液洗涤沉淀，再次离心后弃上清，200μL PBS重悬，沸水浴10min，离心后将上清转移至新的1.5mL EP管，取上清作为PCR的模板。sdfI-F：GATGTGGTTGGTTCGTCACTG(SEQ ID NO:12)；sdfI-R：GCGA GACCTCAAACTTACTCAG(SEQ ID NO:13)，目的片段长度：409bp。
PCR反应体系如下表1：
表1
2×Taq Master Mix 10μL
引物F 2μL
引物R 2μL
DNA模板 1μL
dd H2O 5μL
总体系 20μL
反应体系混合后进行PCR，反应条件如下：
PCR产物进行电泳(1.0％琼脂糖凝胶)，样品孔每孔添加10μL产物，Marker孔添加10μL Marker 2000。凝胶成像分析仪检测PCR扩增结果。
分别以肠炎沙门菌ATCC13076、CMCC50041、JA070、JA133、SM012和SM013基因组为模板，以ddH2O为阴性对照，用引物sdfI-F：GATGTGGTTGGTTCGTCACTG(SEQ ID NO:12)和sdfI-R：GCGAGACCTCAAA CTTACTCAG(SEQ ID NO:13)，进行PCR扩增，产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳，预期在409bp处获得条带。检测结果表明6株金葡菌均在409bp左右产生条带。结果与预期相符合(图1)。
3.肠炎沙门菌的革兰氏染色鉴定
运用细菌革兰氏染色试剂盒进行染色。具体步骤为：用接种环挑取1环菌液至洁净载玻片上，空气中自然干燥；涂布经火焰固定后，滴加结晶紫溶液染色1min，水洗；加碘液染1min，水洗；加脱色液并摇动载玻片约30s，至无紫色脱落为止，水洗；加复染液，染1min，水洗。用显微镜观察染色结果。
用革兰氏染色试剂盒进行染色，预计革兰氏阴性菌为红色至淡红色，革兰氏阳性菌为暗紫色至紫色。6株肠炎沙门菌的染色结果显示粉红色或淡红色，与预期结果相符(图2)。
实施例2肠炎沙门菌免疫原的制备
将ATCC13076、CMCC50041、SM012、SM013、JA070和JA133 6株来源不同的肠炎沙门菌分别在LB培养基中增菌，测定OD600值为1.0后，加入终浓度为0.4％的甲醛，16℃摇床130rpm过夜灭活。取灭活后菌液50μL，转接至5mL空白LB培养基，37℃摇床220rpm 8h验证灭活效果。确定灭活效果良好后，分别取灭活后菌液1mL至1.5mL EP管中，12000rpm离心5min，弃上清，用PBS重悬沉淀，离心洗涤6次。等量混合6株细菌的菌液，用PBS调整菌液浓度为1.0×109CFU/mL。初次免疫加入等量弗式完全佐剂，再次免疫加入等量弗式不完全佐剂，乳化90s。乳化后的菌液验证后作为免疫原免疫小鼠。
实施例3动物免疫程序及血清效价测定
每只小鼠每次免疫200μL乳化后的菌液，每次免疫间隔2周，免疫部位依次为足垫、皮下、皮下、皮下和肌肉，共免疫10只小鼠。四免后第7天断尾采血，测定血清效价。
效价测定的具体步骤为：将采集到的血液置于1.5mL离心管中，室温静置2h，移液枪吸取析出的血清至1.5mL EP，置于-20℃保存。用间接ELISA的方法测定血清效价，具体步骤为包被液对6株细菌全菌抗原适当稀释后，6株细菌分别包被，在96孔酶标板每孔加入100μL稀释的全菌抗原，4℃过夜或37℃2h包被，PBST洗涤3次，每次间隔5min；拍干后每孔加入200μL 5％脱脂奶粉，37℃封闭2h，PBST洗涤3次，每次间隔5min；拍干后每孔加入100μL 5％脱脂奶粉梯度稀释的待测血清，37℃孵育1.5h，PBST洗涤3次，每次间隔5min；拍干后每孔加入100μL用5％脱脂奶粉1：3000稀释的羊抗鼠IgG(HRP标记)，37℃孵育1.5h，PBST洗涤3次，每次间隔5min；拍干后每孔避光加入100μL显色液(TMB)，37℃避光孵育15min，最后加入100μL终止液，酶标仪读取酶标板OD450读数。对效价最高的小鼠进行腹腔冲击免疫(融合前3天)。
血清效价的测定：四免后7d，在10只小鼠中选取2只，断尾取血，收集血清。将6株肠炎沙门菌分别包被，用5％脱脂奶粉稀释血清，自1000倍开始，2倍稀释直到512000倍。未免疫小鼠的血清作为阴性对照，其他步骤与间接ELISA法相同。实验结果显示，四免后7d两只小鼠的血清效价对于6株肠炎沙门菌的效价能达到1:32000以上(如表2-1、表2-2、表2-3、表2-4、表2-5和表2-6)，其中小鼠1对6株肠炎沙门菌的血清效价均高于小鼠2，最终选取小鼠1进行腹腔冲击，加强免疫。
表2-1以肠炎沙门菌SM012为包被原测定小鼠第四次免疫血清效价
表2-2以肠炎沙门菌SM013为包被原测定小鼠第四次免疫血清效价
表2-3以肠炎沙门菌CMCC50041为包被原测定小鼠第四次免疫血清效价
表2-4以肠炎沙门菌ATCC13076为包被原测定小鼠第四次免疫血清效价
表2-5以肠炎沙门菌JA070为包被原测定小鼠第四次免疫血清效价
表2-6以肠炎沙门菌JA133为包被原测定小鼠第四次免疫血清效价
实施例4肠炎沙门菌单克隆抗体的制备
1.细胞融合和阳性杂交瘤细胞的亚克隆
取加强免疫后小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0混合，离心后弃上清，敲击至管底，45秒内加入1mL PEG(融合剂)，加入提前预热好的空白DMEM不完全培养基15mL终止PEG的作用，37℃水浴10min。把融合管置于37℃，5％CO2培养箱中静置10min后1000rpm离心10min。弃上清，取10mL HAT完全培养基轻轻重悬细胞，取小玻璃培养瓶，吸取10mL HAT完全培养基，分别吸取上述细胞重悬液滴于10mL HAT完全培养基中，铺含有饲养细胞的96孔板。之后放入5％CO2培养箱中培养。观察细胞生长状态。SP2/0细胞为圆形半贴壁细胞，镜检观察，其近似圆形，饱满，折光性好，细胞中央可见颜色较深的细胞核(图3-A)。细胞融合后第3～4天，可在4倍镜下可明显观察到葡萄串状的细胞集团，此即为一个单细胞克隆(图3-B)。此时镜检所有的样品孔，标记有1个单克隆的样品孔，后放入温箱继续培养，待8～9天时，即可采集细胞上清测定效价和特异性，分别以灭活的鸡白痢沙门菌ATCC10398、铜绿假单胞菌ATCCA9027、金黄色葡萄球菌CMCC26003、单核细胞增生李斯特菌CICC21662、大肠杆菌308、大肠杆菌223、鼠伤寒沙门菌SL14028为包被原，间接ELISA测定每个克隆孔上清的效价和特异性，挑取生长状态最好、效价最高、特异性最好的单克隆细胞进行下一次亚克隆。本发明共进行三次亚克隆。第三次亚克隆效价和特异性测定结果见表3-1，所有单克隆细胞皆为阳性且特异性良好，说明杂交瘤细胞经过三次亚克隆后，状态已经稳定。后期挑选效价较高、特异性较好的单克隆孔8H2-4D2-1F1、8H2-4D2-1G、8H2-4D2-1F2、8H2-4D2-1E2、8H2-4F2-3F、8H2-4H-4C和8H2-4H-4D共7株进行扩大培养。
表3-1第三次亚克隆后单克隆细胞阳性孔及其特异性的测定
2.小鼠腹水的制备
Balb/C小鼠在注射细胞前一个月内，提前腹腔注射灭菌石蜡油，每次注射500μL，每7d注射一次，共注射3次，后饲养备用。将杂交瘤细胞从细胞培养瓶中吹下，计数，将5×105-1×106个杂交瘤细胞，悬浮于0.5mL生理盐水中(可打5只小鼠)，打入小鼠腹腔，2周后用酒精棉球在腹部消毒，用50mL注射器针头插入腹腔，收集腹水于灭菌后的1.5mL离心管。收集的腹水4℃、5000rpm离心10min，弃掉上层油脂和下层细胞碎片，吸出中间上清收集到新的离心管。继续4℃、8000rpm离心10min，弃掉下层细胞碎片，吸出上清收集到新的离心管。最终在-80℃保存，等待纯化。
实施例5肠炎沙门菌单克隆抗体的特性分析
1.单克隆抗体效价和特异性的确定
经过3次亚克隆后筛选出单克隆抗体，使用间接ELISA方法测定腹水效价，具体方法同上。考虑到从不同小鼠腹腔采集的腹水可能会有一定差异，对不同小鼠采集到的腹水的效价分别进行检测，部分结果如表4-1所示，当腹水稀释至1024000倍时，仍为阳性(OD600的值为阴性的2倍)，说明注射细胞株后，小鼠产生的腹水效价很高。
以灭活的鸡白痢沙门菌ATCC10398、铜绿假单胞菌ATCCA9027、金黄色葡萄球菌CMCC26003、单核细胞增生李斯特菌CICC21662、大肠杆菌308、大肠杆菌223、鼠伤寒沙门菌SL14028为包被原，以肠炎沙门菌SM013为阳性对照，腹水16000倍稀释，测定抗体的特异性，结果显示，除金黄色葡萄球菌在1000倍稀释时值较高外，其他结果为阴性，但随着稀释倍数的增加，其数值快速下降。本研究结果表明，制备的肠炎沙门菌单克隆抗体特异性良好(见表4-2)。
表4-1腹水效价检测
表4-2单克隆抗体特异性检测
/>
2.单克隆抗体亚型的确定
根据SBA Clonotyping System-HRP抗体亚型鉴定试剂盒内说明书进行具体操作，甲醛灭活肠炎沙门菌CMCC50041(灭活步骤同上)，包被ELISA板，一抗为稀释1000倍的腹水(稀释液为5％FBS的PBST)，二抗为试剂盒内抗体稀释300倍(稀释液为含有1％BSA的PBST)，其余步骤同间接ELISA方法。
通过试剂盒检测，方法与间接ELISA相似，将二抗换成试剂盒内代表各种亚型的抗体，单克隆抗体的亚型结果(表4-3)为轻链Kappa型，重链IgG1型。
表4-3单克隆抗体亚型检测
3.抗肠炎沙门菌单抗序列的测定和分析
为了鉴定抗体序列，使用TRIzol试剂从杂交瘤细胞中分离总RNA。具体步骤：1)Trizol裂解：用1mL Trizol重悬全部细菌，吹打混匀静置3-5min。(2)氯仿分相：每个样品加入0.2mL的氯仿(三氯甲烷)，剧烈震荡15s，室温放置充分作用3min后12,000rpm离心15min。(3)RNA沉淀：将上层水相转移至新的1.5mL无RNA酶EP管中，加入500μL的异丙醇使RNA分子沉淀，充分颠倒混匀。(4)RNA洗涤：轻轻吸出上清液(注意不要吸到白色沉淀)，在纸上控干，在沉淀中加入1mL 75％乙醇(750μL无水乙醇，250μL DEPC水，提前配置)，7,500rpm离心5min。(5)RNA溶解：弃上清，干燥10min。加入适量DEPC水吹打溶解，置于冰上，测OD260/280。然后使用抗体恒定区特异性引物(轻链引物mIgkappaRT：ctaacactcattcctgttga(SEQ IDNO:14)；重链引物mIgG1HCRT：TTATTTACCAGGAGAGTGGGA(SEQ ID NO:15))，利用Thermo逆转录试剂盒反转录为cDNA，并以相应的cDNA为模板用Ex Taq酶(Takara)和简并引物进行PCR扩增，随后送到上海生工生物技术公司进行测序，以获得单抗的重链和轻链的可变区序列。使用IgBLAST工具确定互补决定区(CDR)的位置。为了测定抗体序列，从杂交瘤细胞中提取RNA，然后简并引物法扩得可变区序列。测序结果显示单抗可变区的序列的胚系基因家族的基因片段(表5)，其中VH，DH，JH分别为重链可变区的V，D，J胚系基因片段，VK，JK分别为轻链可变区的V，J胚系基因片段。
表5抗肠炎沙门菌单抗可变区的胚系基因(IgBlast分析)
注：VH，DH，JH分别为重链可变区的V，D，J胚系基因片段；VK，JK分别为轻链可变区的V，J胚系基因片段。
测序结果如下(编号/定义规则为IMGT规则)：
轻链核苷酸序列(SEQ ID NO:10)
注：加粗部分为可变区序列，非加粗部分为恒定区序列。
轻链氨基酸序列(SEQ ID NO:7)：
注：加粗部分为可变区序列，非加粗部分为恒定区序列，*为终止密码子。
轻链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO:6)：
其中：
LCDR1：RRIVHRNGNTY(SEQ ID NO:1)
LCDR2：KVS
LCDR3：GQGGHGPT(SEQ ID NO:2)
重链核苷酸序列(SEQ ID NO:11)：
/>
注：加粗部分为可变区序列，非加粗部分为恒定区序列。
重链氨基酸序列(SEQ ID NO:9)：
/>
注：加粗部分为可变区序列，非加粗部分为恒定区序列，*为终止密码子。
重链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO:8)：
其中：
HCDR1：(SEQ ID NO:3)
HCDR2：(SEQ ID NO:4)
HCDR3：(SEQ ID NO:5)
实施例6金黄色葡萄球菌免疫磁珠的制备
1.磁珠的活化
充分震荡保存在4℃内的商品化免疫磁珠，取200μL(2mg)至高温灭菌后的1.5mLEP管内，将其放置在磁分离架上，静置1min后，弃上清。加入500μL高温灭菌PBST缓冲液(0.01mol/L，pH 7.4)重悬，重复3次；取5mg/mL的EDC、NHS溶液(现配现用)各200μL重悬，充分混匀后，置于37℃摇床200rpm活化30min；取出活化完成的磁珠，瞬离，将其放置在磁分离架上，静置1min后，弃上清。用500μL MEST缓冲液(0.025mol/L，pH 6.0)重悬，重复3次。活化后，磁珠表面的羧基可以共价偶联带有伯胺基的生物配体。
2.免疫磁珠的制备
加入500μL MEST缓冲液(0.025mol/L，pH 7.0)重悬1次，将其放置在磁分离架上，静置1min后，弃上清。在500μL MEST缓冲液(0.025mol/L，pH 7.0)中加入3μL肠炎沙门菌单克隆抗体，震荡混匀后，重悬磁珠，置于涡旋培养仪上，30r/min室温活化3h；偶联结束后，瞬离，置于磁分离架上，静置1min后，弃上清。用500μL PBST缓冲液(0.01mol/L，pH 7.4)重悬，重复3次，置于磁分离架上，静置1min后，弃上清。加入封闭液含1％BSA的PBST(0.01mol/L，pH 7.4)1mL，置于37℃恒温摇床200r/min 30min，进行封闭，其中BSA可封闭未偶联的抗原表位；封闭结束后，将其放置在磁分离架上，静置1min后，弃上清。加入500μL高温灭菌PBST缓冲液(0.01mol/L，pH 7.4)重悬，重复4次；待完全移除上清后，用600μL稀释液PBST(0.01mol/L，pH 7.4，0.02％NaN3，0.5％BSA)重悬免疫磁珠，于4℃保存待用。
3.免疫磁珠捕获细菌
将肠炎沙门菌CMCC50041作为被捕获菌株，用接种环从冻存管内蘸取，然后在麦康凯培养基划线，恒温培养箱37℃过夜培养，挑选形态正常的单菌落至液体LB，培养至OD600为1.0时从37℃恒温摇床拿出，用PBST(0.01mol/L，pH 7.4)稀释至2×104CFU。重悬稀释液保存的磁珠，一次制备的磁珠可以做三次平行试验，捕获体系为200μL磁珠+100μL稀释菌液+700μL PBST(pH 7.4)，混合均匀后，置于涡旋培养仪上，30r/min室温捕获45min。
捕获完成后，瞬离，放置在磁分离架上，静置1min后，转移上清至1.5mL EP管内，加入1mL PBST缓冲液(pH 7.4)重悬洗涤1次，再次加入1mL PBST缓冲液(pH 7.4)重悬。上清和磁珠充分混匀，各取200μL挂LB平板，综合三次平行试验的结果，计算捕获率(捕获率＝磁珠菌数/(磁珠菌数+上清菌数))，再进行2次重复试验，得到最终可靠的捕获率。
实施例7免疫磁珠捕获条件的优化
1.免疫磁珠偶联缓冲液的确定
偶联缓冲液的成分、浓度和pH值均可以对单抗的偶联率造成较大的影响，进而影响到目的细菌的捕获率，因此，对于偶联缓冲液的探索对于本实验具有重大意义。本实验分别用MEST(0.025M，pH 7.0)、MEST(0.025M，pH 6.0)、PBST(0.01M，pH 7.0)和PBS(0.01M，pH7.0)共4种偶联缓冲液，肠炎沙门菌CMCC50041为目的菌，PBST梯度稀释至约2×104CFU/mL，以本研究制备的该肠炎沙门菌免疫磁珠。按照上述免疫磁珠活化、封闭和捕获步骤进行实验。平行测定3次，计算捕获率，进而确定最佳偶联缓冲液。
由图4可知，以MEST(0.025M，pH 7.0)为偶联缓冲液时，捕获率最高，可以达到95％左右，因此本研究后期选择MEST(0.025M，pH 7.0)为偶联缓冲液。
2.免疫磁珠最佳直径的确定
根据之前的研究，免疫磁珠的直径变化可对特定细菌的捕获造成较大的影响。本实验以肠炎沙门菌CMCC50041为目的菌，PBST梯度稀释至约2×104CFU/mL，选择海狸公司3种不同规格的磁珠，PM3-020(180nm)、SM3-D100(1150nm)和PM3-050(700nm)进行偶联和捕获实验，实验方法同上。本实验重复3次，计算捕获率，确定免疫磁珠最佳直径。
由图5可知，捕获率最高的是PM3-020(180nm)，为96.29％；其次是SM3-D100(1150nm)，为94.08％，因此后续试验的磁珠选择直径为180nm的磁珠。
3.免疫磁珠最佳捕获时间的确定
探索不同捕获时间对于捕获率的影响，以肠炎沙门菌CMCC50041为目的菌，PBST梯度稀释至约2×104CFU/mL，运用本研究制备的该肠炎沙门菌免疫磁珠进行捕获实验。分别选取捕获时间为15min、30min、45min、60min、75min为检测点，进行捕获。该实验重复3次，计算捕获率，确定最佳捕获时间。
以肠炎沙门菌CMCC50041为目的细菌，运用本研究制备的该肠炎沙门菌免疫磁珠进行捕获实验。根据图6，同样的条件下，捕获率随着捕获时间的增长而升高，最终在捕获时间75min时，捕获率最高，达到96.35％。但实际上，捕获时间45min之后，捕获率已经达到95％，之后增加30min捕获时间，捕获率只增长1.35％，捕获率无显著差异(p>0.05)，因此，所以选择45min为最佳捕获时间。
实施例8免疫磁珠的性能分析
1.免疫磁珠的特异性分析
选取肠炎沙门菌ATCC13076、CMCC50041、SM012、SM013、JA070、JA133和其他临床常见菌株：金黄色葡萄球菌CMCC26003、单核细胞增生李斯特菌CICC21662、多杀性巴氏杆菌2016ds12、肠出血型大肠杆菌O157ATCC43889、鼠伤寒沙门菌SL14028、鸡白痢沙门菌ATCC10398、变形杆菌2019prom21共13株常见的食源性病原微生物进行免疫磁珠的特异性实验。本研究制备的该肠炎沙门菌免疫磁珠，捕获时间为45min，其余实验步骤同上，该实验重复3次，计算捕获率，确定免疫磁珠的广谱性和特异性。
如图7，本研究制备的该肠炎沙门菌免疫磁珠对于6株来源不同的肠炎沙门菌捕获率均在90％以上，而对于其余7种常见的食源性病原微生物捕获率均低于12％，说明本研究制备的该肠炎沙门菌免疫磁珠特异性较好。
2.不同细菌浓度下免疫磁珠的捕获性能分析
选取肠炎沙门菌为目的菌，梯度稀释至捕获体系内用PBST缓冲液(pH 7.4)稀释菌液，使最终捕获体系中菌液浓度分别为106、105、104、103、102、101CFU/mL，运用本研究制备的该肠炎沙门菌免疫磁珠进行捕获，捕获时间45min，按照以上步骤进行实验，该实验重复3次，计算捕获率。
如图8，免疫磁珠对上述浓度菌液的捕获率分别为70.34％、82.77％、87.89％、93.2％、88.23％和72.5％，说明肠炎沙门菌免疫磁珠敏感性较好
3.不同捕获体系和磁珠量对于免疫磁珠捕获率的影响
选取肠炎沙门菌CMCC50041为目的菌，用PBST将菌液稀释至2×104CFU/mL左右，分别取100μL免疫磁珠与100μL和900μL菌液混合，另外取200μL免疫磁珠与800μL菌液混合，进行捕获实验，捕获时间45min，捕获步骤同上。该实验重复3次，计算捕获率，确定不同捕获体系和磁珠量对于捕获率的影响。
如图9，200μL磁珠+800μL菌液；100μL磁珠+100μL菌液；100μL磁珠+900μL菌液3种捕获体系，同样的条件下，捕获率最高的是200μL磁珠+800μL菌液的捕获体系(96.81％)，其次是100μL磁珠+100μL菌液的捕获体系(90.45％)，因此接下来的试验选择200μL磁珠+800μL菌液的捕获体系。

Claims (10)

1.一种抗肠炎沙门菌的单克隆抗体，其特征在于，其包含重链可变区和轻链可变区，所述轻链可变区的LCDR1包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，LCDR2包含氨基酸序列KVS，LCDR3包含如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；所述重链可变区的HCDR1～HCDR3分别包含如SEQ ID NO:3、4和5所示的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列；
较佳地，所述单克隆抗体还包括鼠重链恒定区和鼠轻链恒定区，所述鼠重链恒定区优选IgG1，所述鼠轻链恒定区优选Kappa型；
更佳地，所述单克隆抗体的轻链包含如SEQ ID NO:7所示的序列，重链包含如SEQ IDNO:9所示的序列。
3.一种分离的核酸，其特征在于，其编码如权利要求1或2所述的单克隆抗体；优选地，编码所述重链的核酸包括如SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列，编码所述轻链的核酸包括如SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列。
4.一种重组表达载体，其特征在于，其包括如权利要求3所述的核酸。
5.一种转化体，其特征在于，所述转化体包含如权利要求3所述的核酸或权利要求4所述的重组表达载体；优选地，所述转化体的宿主细胞为哺乳动物细胞或大肠杆菌。
6.一种制备单克隆抗体的方法，其特征在于，在适合如权利要求5所述的转化体生长的条件下培养所述转化体，使其表达所述的单克隆抗体。
7.一种单克隆抗体免疫磁珠，其特征在于，其包含如权利要求1或2所述的单克隆抗体；
较佳地，制备其的方法包括使用活化的免疫磁珠偶联所述的单克隆抗体；
更佳地，所述活化使用包括EDC和NHS的混合液；优选所述EDC和NHS的比例为1:1，和/或，在37℃、200rpm活化30min。
8.如权利要求7所述的单克隆抗体免疫磁珠，其特征在于，所述偶联包括将所述活化的免疫磁珠与所述单克隆抗体共培养，以使二者发生偶联；
较佳地，所述偶联包括以下步骤中的一种或多种：
(1)用MEST缓冲液、pH 6.0重悬活化的免疫磁珠；优选重复3次；
(2)用MEST缓冲液、pH 7.0重悬活化的免疫磁珠，弃上清后重复1次；优选所述MEST缓冲液的浓度为0.025mol/L；
(3)加入所述单克隆抗体，混匀后重悬，使与活化的免疫磁珠偶联，弃上清获得单克隆抗体免疫磁珠；优选30r/min室温活化3h；
(4)用MEST缓冲液、pH 7.4重悬单克隆抗体免疫磁珠，弃上清；优选重复3次；
(5)用封闭液优选含1％BSA的0.01mol/L PBST、pH 7.4封闭，弃上清；
(6)用PBST缓冲液、pH 7.4重悬，弃上清；优选重复4次；
(7)用含0.02％NaN3和0.5％BSA的0.01mol/L PBST、pH 7.4重悬；
更佳地，所述免疫磁珠的直径为100～200nm；优选所述免疫磁珠的直径为180nm。
9.一种如权利要求1或2所述的单克隆抗体，或如权利要求7或8所述的单克隆抗体免疫磁珠在检测肠炎沙门菌或制备检测肠炎沙门菌的诊断剂中的应用。
10.一种检测肠炎沙门菌的方法，其特征在于，其包括以下步骤：
(1)按照肠炎沙门菌检验国际方法中的样品前处理办法处理样品，将如权利要求7或8所述的单克隆抗体免疫磁珠与所述样品在偶联缓冲液中孵育，例如孵育40～50min；
(2)计算捕获率；
较佳地，所述方法为非诊断目的的方法；和/或，步骤(1)中所述的偶联缓冲液为MEST缓冲液；所述MEST缓冲液的浓度优选0.025M，pH优选7.0；
更佳地，所述样品在偶联缓冲液中孵育15～75min，优选45min。
CN202210905842.6A 2022-07-29 2022-07-29 抗肠炎沙门菌单克隆抗体、包含其的免疫磁珠及其应用 Pending CN117467000A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210905842.6A CN117467000A (zh) 2022-07-29 2022-07-29 抗肠炎沙门菌单克隆抗体、包含其的免疫磁珠及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210905842.6A CN117467000A (zh) 2022-07-29 2022-07-29 抗肠炎沙门菌单克隆抗体、包含其的免疫磁珠及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN117467000A true CN117467000A (zh) 2024-01-30

Family

ID=89633629

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210905842.6A Pending CN117467000A (zh) 2022-07-29 2022-07-29 抗肠炎沙门菌单克隆抗体、包含其的免疫磁珠及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN117467000A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110066336B (zh) 抗cd47单克隆抗体、片段及其医药用途
CN101261272A (zh) Hcmvpp65抗原血症间接免疫荧光法检测试剂盒
CN113493508A (zh) 一种用于检测新冠病毒n蛋白的双抗体夹心elisa试剂盒
CN116444658A (zh) 一种新冠抗体及其应用
CN114574448B (zh) 分泌ActA单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用
CN109852588B (zh) 一种抗罗非鱼免疫球蛋白IgM的单克隆抗体及其细胞株和应用
CN106589124A (zh) Cd146单克隆抗体在胶质瘤血管周细胞检测及分离鉴定中的应用
CN113214390B (zh) 抗金黄色葡萄球菌单克隆抗体、应用及包含其的免疫磁珠
CN113150124A (zh) 一种基于非洲猪瘟病毒p72基因的双抗体夹心ELISA及其应用
CN117467000A (zh) 抗肠炎沙门菌单克隆抗体、包含其的免疫磁珠及其应用
CN116462758B (zh) 抗人ptprz1单克隆抗体及其在细胞流式中的应用
CN113801854B (zh) 分泌欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞系及其应用
CN113788893B (zh) 一种快速富集霍乱弧菌的偶联特异性单克隆抗体的免疫磁珠及其制备方法
CN110702913A (zh) 一种用于定量检测贝氏柯克斯体i相株的单抗组合物
CN111748036B (zh) 一种人鼠嵌合单克隆抗体
CN110540966A (zh) 人流感嗜血杆菌表面蛋白单克隆抗体及抗原捕获elisa试剂盒
CN116970082B (zh) 人源cd7单克隆抗体及其制备方法和应用
CN116217718B (zh) 一种猪丹毒抗体检测试剂盒及其应用
CN116063535B (zh) 一种抗体或其抗原结合片段及其制备方法和应用
CN110862969B (zh) 分泌抗cfp-10抗体的杂交瘤细胞株、其抗体及其应用
JP7181523B2 (ja) 糖鎖をエピトープとして特異的に認識する新規抗体及びその用途
CN117363582B (zh) 一种分泌抗小反刍兽疫病毒f蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其单抗与应用
CN115819567B (zh) 一种单克隆抗体及其在检测试剂盒中的应用
CN110540968B (zh) 人肺炎链球菌表面蛋白单克隆抗体及抗原捕获elisa试剂盒
JP6964117B2 (ja) 検体中のインフルエンザ菌を検出するための抗体、並びに斯かる抗体を用いてインフルエンザ菌を検出するための方法、試薬、及びキット

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination