CN113214390B

CN113214390B - 抗金黄色葡萄球菌单克隆抗体、应用及包含其的免疫磁珠

Info

Publication number: CN113214390B
Application number: CN202110729090.8A
Authority: CN
Inventors: 蒋蔚; 韩先干; 王权; 王亚磊; 张海洋
Original assignee: Shanghai Veteromaru Research Institute Caas China Animal Health And Epidemiology Center Shanghan Branch Center
Current assignee: Shanghai Veteromaru Research Institute Caas China Animal Health And Epidemiology Center Shanghan Branch Center
Priority date: 2021-06-29
Filing date: 2021-06-29
Publication date: 2022-04-01
Anticipated expiration: 2041-06-29
Also published as: CN113214390A

Abstract

本发明公开了抗金黄色葡萄球菌单克隆抗体、应用及包含其的免疫磁珠。所述抗金黄色葡萄球菌的单克隆抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述轻链可变区的LCDR1～3包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，LCDR2包含氨基酸序列YAS，LCDR3包含如SEQ ID NO:2所示的序列；所述重链可变区的HCDR1～HCDR3包含分别如SEQ ID NO:3、4和5所示的序列。

Description

抗金黄色葡萄球菌单克隆抗体、应用及包含其的免疫磁珠

技术领域

本发明属于病原菌分离技术领域，具体涉及一种抗金黄色葡萄球菌单克隆抗体、应用及包含其的免疫磁珠。

背景技术

金黄色葡萄球菌作为主要的食源性致病菌，其常规的检测方法费时耗力，不能满足检测需求，因此目前市场急需开发金黄色葡萄球菌的快速检测技术。目前针对金葡菌的检测方法主要有传统的分离鉴定、分子生物学检测方法，免疫学检测方法等。其中免疫学检测方法是重要的检测方法之一，单克隆抗体因其特异性强，效价高，化学性质稳定，一直是免疫学检测方法的重要工具。

本研究利用灭活的金黄色葡萄球菌全菌作为免疫原，免疫Balb/C小鼠。通过杂交瘤技术制备分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，ELISA方法筛选效价高、特异性强的阳性细胞株，经过4次亚克隆后得到稳定分泌抗金葡菌抗体的细胞株。扩大培养后注入小鼠腹腔，收集腹水，制备单克隆抗体，ELISA方法测定腹水的效价和特异性，通过简易过碘酸钠标记法测定不同抗体间与抗原表位的结合是否相互影响，通过亚型测定试剂盒鉴定单克隆抗体的亚型，为后续金黄色葡萄球菌的免疫磁珠制备奠定基础。

磁珠富集技术，是利用表面覆盖特定官能团的纳米级磁珠与具有某种特定性状的生物化学分子通过共价或非共价方式偶联，进而与目标物发生特异性结合，通过磁响应将目标物从溶质中分离出来的技术。免疫磁珠因其在免疫学检测上的独特优势，一直在食源性检测领域发挥着重要的作用。

现有技术中部分专利申请涉及使用抗体免疫磁珠进行金黄色葡萄球菌的富集(如CN102426229A)，然而其中所用抗体为人IgG，因而难以保证检测方法的特异性，由此进一步地需要将捕获到的细菌在鉴别培养基上培养又增加了时间成本；另外，利用人IgG抗体的免疫磁珠其捕获率也低。因此，急需能够特异性针对金黄色葡萄球菌的抗体。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术中存在的富集金黄色葡萄球菌的抗体免疫磁珠特异性与捕获率、敏感度难以兼顾等缺陷，提供一种抗金黄色葡萄球菌单克隆抗体、应用及包含其的免疫磁珠。

本发明提供一种抗金黄色葡萄球菌的单克隆抗体，其包含重链可变区和轻链可变区，所述轻链可变区的LCDR1～3包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，LCDR2包含氨基酸序列YAS，LCDR3包含如SEQ ID NO:2所示的序列；所述重链可变区的HCDR1～HCDR3包含分别如SEQ ID NO:3、4和5所示的序列。

较佳地，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:6所示的序列，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:8所示的序列；

更佳地，所述的单克隆抗体的轻链包含如SEQ ID NO:7所示的序列，重链包含如SEQ ID NO:9所示的序列。

本发明还提供一种包含如上所述单克隆抗体的单克隆抗体免疫磁珠。

所述的单克隆抗体免疫磁珠可通过本领域常规的制备方法进行制备。

所述免疫磁珠可为本领域常规，例如DM3-020(直径180nm)、DM3-050(直径750nm)和SM3-D100(直径1150nm)，较佳地为直径700～800nm的免疫磁珠，更佳地为750nm的免疫磁珠。

本发明还提供一种如上所述的单克隆抗体免疫磁珠在检测金黄色葡萄球菌中的应用。

本发明还提供一种检测金黄色葡萄球菌的方法，其包括以下步骤：

(1)按照金黄色葡萄球菌检验国际方法中的样品前处理办法处理样品，将如上所述的单克隆抗体免疫磁珠与所述样品在偶联缓冲液中孵育40～50min；

(2)计算捕获率。

其中，步骤(1)中所述的偶联缓冲液优选MEST缓冲液；所述MEST缓冲液的浓度优选0.025M，pH优选7.0。

在本发明一较佳实施方案中，步骤(1)中所述样品在偶联缓冲液中孵育45min。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：

本发明制备得到的单克隆抗体的效价高(可达1:5120000以上)，且所述单克隆抗体的特异性强；并适用于单克隆抗体免疫磁珠的制备，制备得到的单克隆抗体免疫磁珠对于金黄色葡萄球菌具有高的特异性，对于4株来源不同的金黄色葡萄球菌捕获率可达90％以上，而对于其余12种常见的食源性病原微生物捕获率可低于10％；高敏感性，细菌数量为10⁴CFU、10³CFU和10²CFU时，单克隆抗体免疫磁珠的捕获率可达90％以上，以及具有高捕获率。此外，本发明的免疫磁珠在更大的体系里(如，1mL左右的体系中)也能很好地工作。简言之，本发明的单克隆抗体免疫磁珠操作简单、反应时间短，基质对于捕获率的影响低，为后续的分子检测方法奠定了基础。

附图说明

图1为免疫小鼠所用的4种金葡菌的PCR鉴定结果；M：Marker DL2000，1：阴性对照，2：ATCC6538株，3：ATCC29213株，4：CMCC26003株，5：ATCC25923株。

图2为免疫小鼠所用的4种金葡菌的革兰氏染色鉴定结果；A：金葡菌ATCC6538革兰氏染色结果，B：金葡菌ATCC29213革兰氏染色结果，C：金葡菌CMCC26003革兰氏染色结果，D：金葡菌ATCC25923革兰氏染色结果。

图3为SP2/0细胞(A)和细胞融合后第三天的单克隆(B)观察。

图4为免疫磁珠偶联缓冲液的选择。

图5为免疫磁珠最佳直径的选择。

图6为不同捕获时间对捕获率的影响。

图7为免疫磁珠的特异性实验结果；1：金黄色葡萄球菌ATCC29213，2：金黄色葡萄球菌ATCC6538，3：金黄色葡萄球菌ATCC25923，4：金黄色葡萄球菌CMCC26003，5：肺炎克雷伯氏菌CMCC46117，6：普通变形杆菌CMCC49027，7：枯草芽孢杆菌ATCC6633，8：铜绿假单胞菌ATCC9027，9：蜡样芽孢杆菌CMCC63303，10：鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028，11：副溶血弧菌ATCC33847，12：阪崎肠杆菌CICC21561，13：肠出血性大肠杆菌O157 ATCC43889，14：福氏志贺氏菌CMCC51572，15：单核细胞增生李斯特菌CICC21662，16：乳房链球菌ATCC BAA-854。

图8为免疫磁珠的敏感性实验结果。

图9为不同捕获体系和磁珠量对于免疫磁珠捕获率的影响；1：100μL磁珠，100μL菌液；2：100μL磁珠，900μL菌液；3：200μL磁珠，800μL菌液。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

实验材料：

1.实验菌株和动物

金黄色葡萄球菌ATCC6538、ATCC29213、ATCC25923、枯草芽孢杆菌ATCC6633、肠出血性大肠杆菌O157 ATCC43889、乳房链球菌ATCCBAA-854、副溶血弧菌ATCC33847，铜绿假单胞菌ATCC9027和鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028购自美国模式培养物集存库(American typeculture collection,ATCC)；金黄色葡萄球菌CMCC26003、肺炎克雷伯氏菌CMCC46117、蜡样芽孢杆菌CMCC63303、福氏志贺氏菌CMCC51572和普通变形杆菌CMCC49027购自中国医学细菌保藏管理中心(National Center for Medical Culture Collections,CMCC)。阪崎肠杆菌CICC21561、单核细胞增生李斯特菌CICC21662购自中国工业微生物菌种保藏管理中心(China Center of Industrial Culture Collection,CICC)。Balb/C小鼠和昆明鼠购自上海杰思捷生物有限公司。

2.主要试剂及培养基

LB液体培养基：10g NaCl、5g酵母浸出物、10g胰蛋白胨定容至1L去离子水中，调节pH至7.4，121℃高压灭菌15min，4℃保存备用。

LB固体培养基：10g NaCl、5g酵母浸出物、10g胰蛋白胨和15g琼脂粉定容至1L去离子水中，调节pH至7.4，121℃高压灭菌15min，4℃保存备用。

BHI液体培养基、TSB液体培养基和THB液体培养基购自BD生物技术有限公司。

DMEM完全培养基：15mL胎牛血清(BI生物)、1mL青链霉素(PS)；1mL L-谷氨酰胺(LG)；和83mL高糖DMEM(美国Gibco公司)。

HT培养基：2mL L-谷氨酰胺(LG)、2mL青链霉素、40mL胎牛血清和154mL DMEM。

HAT培养基：2mL A、2mL HT、2mL LG、2mL PS、40mL FBS和152mL DMEM。

冻存液：10mL DMSO、20mL PS和70mL DMEM，-20℃保存。

磷酸盐缓冲液(PBS)：8g NaCl，0.2g KCl和0.2g KH₂PO₄定容至1L去离子水中，调节pH至7.4，121℃高压灭菌15min，室温保存备用。

革兰氏染色试剂盒购自青岛海博生物技术有限公司(HB8278)。

胎牛血清(FBS)和DMEM高糖培养基购自美国Invitrogen公司。

弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、聚乙二醇(PEG 6000)、次黄嘌呤(H)、氨基蝶呤(A)、胸腺嘧啶脱氧核苷(T)、L-谷氨酰胺(LG)和青链霉素(PS)购自美国Sigma公司。

明胶(AAM289750)购自国药集团化学试剂有限公司。

SBA Clonotyping System-HRP抗体亚型鉴定试剂盒购自Southern Biotech公司。

Ex Taq酶：购自大连宝生物工程有限公司。

ELISA包被液：1.696g Na₂CO₃、2.856g NaHCO₃定容至1L去离子水中，调节pH至9.6。

ELISA洗涤缓冲液(PBST)：0.2g KH₂PO₄、0.2g KCl、2.9g Na₂HPO₄·12H₂O、8.0gNaCl、0.5mL Tween-20加去离子水至1000mL。

ELISA封闭液：10g明胶溶于1000mL去离子水中。

ELISA底物缓冲液：9.210g Na₂HPO₄·12H₂O、2.55g柠檬酸，去离子水定容至500mL。

ELISA终止液(2M H₂SO₄)：178.3mL去离子水滴加浓硫酸(98％)21.7mL。

HRP标记的羊抗鼠IgG购自Abcom公司。

96孔细胞培养板、24孔细胞培养板、25mL细胞培养瓶和96孔酶标版购自美国Costar公司。

2-(N-吗啉基)乙磺酸,4-吗啉乙磺酸)(MES)：购自SIGMA公司，货号：M3671-50G。

1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)：购自Thermoscientific公司，货号：PA184225。

N-羟基邻苯二甲酰亚胺(NHS)：购自SIGMA公司。

活化缓冲液MEST：取0.488g的MES溶于100mL ddH₂O，NaOH调pH至6.0，加入50μLTween-20，0.22μm滤器过滤。4℃存储。

偶联缓冲液MEST:取0.488g的MES溶于100mL ddH₂O，NaOH调pH至7.0，加入50μLTween-20，0.22μm滤器过滤。4℃存储。

EDC溶液：4℃储存的MES配制5mg/mL EDC(25mM，pH6.0)，0.22μm滤器过滤。现配现用。

NHS溶液：4℃储存的NHS配制5mg/mL NHS(25mM，pH6.0)，0.22μm滤器过滤。现配现用。

封闭液：1％BSA的PBST(pH7.4)，0.22μm滤器过滤。4℃存储。

储存液：0.2g NaN₃和5g BSA，溶于1000mL 0.01M的PBST(pH7.4)，后0.22μm滤器过滤。4℃存储。

光明巴氏杀菌牛奶购买自上海市某超市。

DM3-020(180nm)、DM3-050(750nm)/SM3-D100(1150nm)超顺磁性纳米磁珠购自苏州海狸生物医学工程有限公司。

3.主要仪器及软件

倒置显微镜：购自德国蔡司公司；乳化仪：购自Amalgamator公司；台式低温离心机：购自Thermo Fisher科技有限公司；电子分析天平：购自美国METTLER TOLEDO公司；4℃冰箱和-80℃超低温冰箱：购自中国海尔公司；CO₂细胞培养箱：购自美国ThermoScientific公司；多功能酶标仪：购自美国BIOTEK公司；凝胶成像系统：购自Bio-Rad中国公司；磁分离架购自上海奥瑞微纳新材料科技有限公司；旋转培养器购自海门市麒麟医用仪器厂；电子分析天平购自瑞士METTLER TOLEDO公司。

实施例1金黄色葡萄球菌菌株的复苏、纯化、鉴定

1.金黄色葡萄球菌的复苏和纯化

将购买的菌株金黄色葡萄球菌ATCC6538、ATCC29213、ATCC25923和CMCC26003从4℃冰箱取出，无菌操作，敲碎菌种安瓿瓶，用接种环刮取少量固体菌种，接种至3mL TSB液体培养基。置于恒温摇床中200rpm，37℃过夜增菌。菌液划线至固体LB培养基，置于37℃恒温箱中，过夜培养。挑取单菌落至5mL TSB培养基，置于恒温摇床200rpm，37℃过夜增菌。

2.金黄色葡萄球菌的PCR鉴定

取500μL上述纯化后的菌液于1.5mL EP管中，12000rpm离心5min，用500μLPBS洗涤一次，200μL PBS重悬，沸水浴煮沸10分钟，12000rpm离心2min，取上清做PCR模板用。PCR引物参照论文(李自然,等.,2013)，引物F：AGTATATAGTGCAACTTCAACTAA；引物R：ATCAGCGTTGTCTTCGCTCCAAAT，目的引物长度448bp。

PCR反应体系如下表1：

表1

Ex Taq酶	10μL
		引物F	1μL
引物R	1μL
		DNA模板	2μL
dd H<sub>2</sub>O	6μL
		总体系	20μL

反应体系混合后进行PCR，反应条件如下：

PCR产物进行浓度为1.0％的琼脂糖凝胶电泳。每孔添加样品10μL，Marker 2000。凝胶成像分析仪检测PCR扩增结果。

分别以金黄色葡萄球菌ATCC6538、ATCC29213、ATCC25923和CMCC26003基因组为模板，以ddH₂O为阴性对照，用nuc引物进行PCR扩增，产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳，预期在448bp处获得条带。检测结果表明4株金葡菌均在448bp左右产生条带。结果与预期相符合(图1)。

3.金黄色葡萄球菌的革兰氏染色鉴定

运用细菌革兰氏染色试剂盒进行染色。具体步骤为：用接种环挑取1环菌液至洁净载玻片上，空气中自然干燥；涂布经火焰固定后，滴加结晶紫溶液染色1min，水洗；加碘液染1min，水洗；加脱色液并摇动载玻片约30s，至无紫色脱落为止，水洗；加复染液，染1min，水洗。用显微镜观察染色结果。

用革兰氏染色试剂盒进行染色，预计革兰氏阴性菌为红色至淡红色，革兰氏阳性菌为暗紫色至紫色。4株金黄色葡萄球菌的染色结果显示暗紫色，与预期结果相符(图2)。

实施例2金黄色葡萄球菌免疫原的制备

TSB培养基增菌ATCC6538，待OD₆₀₀值为1.0时，用PBS对菌液进行梯度稀释，取适当稀释梯度的菌液涂板，进行平板计数。

TSB培养基分别增菌ATCC6538、ATCC29213、ATCC25923、CMCC26003四株来源不同的金黄色葡萄球菌。待OD₆₀₀值为1.0时，加入终浓度为0.3％的甲醛，37℃摇床200rpm灭活4h。后各取1mL菌液置于1.5mL EP管中，12000rpm离心5min，弃上清，沉淀用PBS离心洗涤5次。后将4株金黄色葡萄球菌的菌液等量混合，用PBS调整菌液浓度为1.0×10¹⁰CFU/mL。初次免疫加入等量的弗氏完全佐剂，后期免疫加入等量的弗氏不完全佐剂，乳化90s。乳化后的菌液作为免疫原进行小鼠免疫。

实施例3动物免疫程序及血清效价测定

每只小鼠每次免疫200μL乳化后的菌液，每次免疫间隔2周，免疫部位依次为足垫、皮下、皮下、皮下和肌肉，共免疫3只小鼠。五免后第7天断尾采血，测定血清效价。

效价测定的具体步骤为：将采集到的血液置于1.5mL离心管中，室温静置1h，移液枪吸取析出的血清，置于-20℃保存。取OD₆₀₀值为1.0时的4株金黄色葡萄球的新鲜菌液进行甲醛灭活，将灭活后的菌液用PBS洗涤5次后。包被液分别对菌液适当稀释后，96孔酶标板每孔加入100μL的全菌抗原，4种细菌分开包被，4℃包被过夜。PBST洗涤3次，每孔加入200μL的明胶，37℃封闭2h。PBST洗涤3次，检测血清用5％FBS的PBST梯度稀释，每孔加入100μL，37℃孵育2h。之后每孔加入100μL的1：2000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG，37℃孵育1h。PBST洗涤5次，每孔加入100μL TMB显色液，37℃温箱孵育15min，加入50μL终止液，酶标仪读取OD₄₅₀。取血清效价最高的小鼠，在融合前3天腹腔冲击加强免疫。

最佳包被原的选择：以甲醛灭活的金葡菌ATCC6538为包被原进行纵列梯度稀释，以3免后7d采集的小鼠1的血清为一抗进行横列梯度稀释，棋盘法测定抗原的最佳包被量。结果如表2-1，细菌浓度为5×10⁷CFU/mL时，血清效价最高。因此，可以选择浓度等于或高于5×10⁷CFU/mL的细菌为包被原进行血清效价检测，本实验选取浓度为5×10⁸CFU/mL的细菌为包被原。

血清效价的测定：取5免后第7d的小鼠血清进行血清效价测定。将4种金葡菌分开包被，各包4行，血清自1000倍起，2倍梯度稀释，免疫前的小鼠血清1000倍稀释作为阴性对照，其余步骤相同。间接ELISA法测定小鼠的血清效价。实验结果显示，5免后3只小鼠的血清效价对于每一种金葡菌均达到1:500000以上(表2-2、2-3、2-4、2-5)，效价均较高，可以进行细胞融合。小鼠3效价相对最高，因此选取小鼠3，进行腹腔冲击，加强免疫。

表2-1抗原最佳包被浓度的选择

表2-2以金葡菌ATCC6538为包被原测定小鼠五免血清效价

表2-3以金葡菌ATCC29213为包被原测定小鼠五免血清效价

表2-4以金葡菌CMCC26003为包被原测定小鼠五免血清效价

表2-5以金葡菌ATCC25923为包被原测定小鼠五免血清效价

实施例4金黄色葡萄球菌单克隆抗体的制备

1.细胞融合和阳性杂交瘤细胞的亚克隆

取免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0混合，离心后弃上清，敲击至管底，45秒内加入1mL PEG，加入提前预热好的DMEM不完全培养基15mL终止PEG的作用，37℃水浴15min。把融合管置于37℃，5％CO₂培养箱中静置10min后1000rpm离心10min。弃上清，取10mL HAT完全培养基轻轻重悬细胞，取小玻璃培养瓶，吸取10mL HAT完全培养基，分别吸取上述细胞重悬液滴于10mL HAT完全培养基中，铺含有饲养细胞的96孔板。之后放入5％CO₂培养箱中培养。观察细胞生长状态。SP2/0细胞为圆形半贴壁细胞，镜检观察，其近似圆形，饱满，折光性好，细胞中央可见颜色较深的细胞核(图3-A)。细胞融合后第3～4天，可在4倍镜下可明显观察到葡萄串状的细胞集团，此即为一个单细胞克隆(图3-B)。此时镜检所有的样品孔，标记有1个单克隆的样品孔，后放入温箱继续培养，待8～9天时，即可采集细胞上清测定效价和特异性，分别以灭活的金葡菌ATCC6538、铜绿假单胞菌ATCC9027、单核细胞增生李斯特菌CICC21662、肠出血性大肠杆菌O157 ATCC43889、副溶血弧菌ATCC33847和鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028为包被原，间接ELISA测定每个克隆孔上清的效价和特异性，挑取生长状态最好、效价最高、特异性最好的单克隆细胞进行下一次亚克隆。本发明共进行四次亚克隆。第四次亚克隆效价和特异性测定结果见表2-6，所有单克隆细胞皆为阳性且特异性良好，说明杂交瘤细胞经过四次亚克隆后，状态已经稳定。后期挑选效价较高、特异性较好的单克隆孔3-G8-B6-A10-G6-A8(简称SP1)、2-A4-B8-E5-C5-C4(简称SP2)、2-C1-B9-E11-C6-C7(简称SP3)和2-E3-C5-H11-G10-C12(简称SP4)共4株进行扩大培养。

表2-6第四次亚克隆后单克隆细胞阳性孔及其特异性的测定

2.小鼠腹水的制备

Balb/C小鼠在注射细胞前一个月内，提前腹腔注射灭菌石蜡油，每次注射500μL，每7d注射一次，共注射3次，后饲养备用。将第四次亚克隆后的阳性孔单克隆吸出，转移至提前铺好饲养细胞的24孔板。待细胞长满后，收集8个孔的细胞与15mL离心管中，1000rpm，离心5min，弃上清，用700～800μL生理盐水重悬，注射入Balb/C小鼠腹腔，待腹部膨大后，采集腹水，12000rpm，离心15min，收集腹水转移至干净的EP管中，-80℃冻存。

实施例5金黄色葡萄球菌单克隆抗体的特性分析

1、单克隆抗体效价和特异性的确定

经过4次亚克隆后共筛选出4株单克隆抗体，分别命名为SP1、SP2、SP3和SP4。以金黄色葡萄球菌ATCC6538为包被原，间接ELISA方法测定腹水效价，具体方法同上。由结果(表2-7)可以看出，4株单克隆抗体的效价均较高。特别是SP4，在稀释了5120000倍时，OD₄₅₀依然在0.7以上。以灭活的铜绿假单胞菌ATCC9027、单核细胞增生李斯特菌CICC21662、肠出血性大肠杆菌O157 ATCC43889、副溶血弧菌ATCC33847和鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028为包被原，以金黄色葡萄球菌ATCCA6538为阳性对照，腹水50000倍稀释，测定抗体的特异性，结果显示，4种抗体皆不与上述5株常见的食源性病原微生物发生反应，提示4种抗体特异性均较好(见表2-8)。

表2-7单克隆抗体的效价测定

表2-8单克隆抗体的特异性测定

2、单克隆抗体抗原决定簇的确定

采用简易过碘酸钠法对单克隆抗体进行HRP标记，标记步骤：称取9mg HRP溶解于1.8mL ddH2O中；于上液中加入450μL 0.1M NaIO₄溶液，室温下避光搅拌20min；将上述溶液转移至透析袋中，用浓度为1mM的醋酸钠缓冲液(pH4.4)，4℃透析过夜；1.5mL EP管分装，每管300μL，共6管；吸取一定量(3mg)腹水，溶于0.01M碳酸盐缓冲液，定容至300μL；将步骤(4)中的EP管，每管加入5μL 0.2M pH 9.5的碳酸盐缓冲液，混匀，立即吸取全部液体转移至EP管中；避光，室温搅拌2h；加0.1mL新配置的4mg/mL NaBH₄溶液，混匀，再置4℃反应2h；将上述溶液装入透析袋中，用PBS缓冲液4℃透析过夜；转移至EP管中，-20℃保存。

3、竞争ELISA法测定不同抗体间与抗原表位的结合是否相互影响

具体步骤为：以金黄色葡萄球菌ATCC6538为包被原，包被和封闭步骤同上，封闭后每孔加入50μL 500倍稀释的标记HRP的单克隆抗体SP1(简称HRP-SP1)，再分别在每列加入50μL 100、500、2500、5000、10000、50000和250000倍梯度稀释的单克隆抗体SP2、SP3和SP4。另取一列单独加入100μL 1000倍稀释的标记HRP的单克隆抗体SP1作为对照。依照此方法将待测抗体两两配对，进行反应；37℃温箱孵育2h后，PBST洗涤5次；每孔加入100μL TMB显色液，37℃温箱孵育15min；每孔加入50μL终止液，酶标仪测定OD₄₅₀。结果如下表，表2-9显示SP1与SP2、SP3和SP4无竞争；表2-10显示SP2与SP3和SP4无竞争；表2-11显示SP3与SP4无竞争。综合表2-9、2-10和2-11的结果可知：4种单克隆抗体之间皆无抗原表位重合或覆盖。

表2-9 SP1与SP2、SP3、SP4之间的竞争ELISA测定结果

表2-10 SP2与SP3、SP4之间的竞争ELISA测定结果

表2-11 SP3与SP4之间的竞争ELISA测定结果

4、单克隆抗体亚型的测定

采用SBA Clonotyping System-HRP抗体亚型鉴定试剂盒进行抗体的亚型鉴定，实验方法参照说明书。首先用甲醛灭活的金葡菌ATCC6538包被酶标板，一抗为含5％FBS的PBST 1000倍稀释的腹水，试剂盒中的二抗用含1％BSA的PBST进行300倍稀释，其余步骤同上实施例3中间接ELISA实验方法。按照SBAClonotyping System-HRP抗体亚型鉴定试剂盒的说明书进行操作，结果(表2-12)显示，4种抗体的轻链类型皆为Kappa型，SP1重链类型为IgG2a，SP2重链类型为IgG1，SP3重链类型为IgG2a，SP4重链类型为IgG2b型。

表2-12单克隆抗体的亚型测定结果

5.抗金黄色葡萄球菌单抗序列的测定和分析

为了鉴定抗体序列，使用TRIzol试剂从杂交瘤细胞中分离总RNA。具体步骤：1)Trizol裂解：用1mL Trizol重悬全部细菌，吹打混匀静置3-5min。(2)氯仿分相：每个样品加入0.2mL的氯仿(三氯甲烷)，剧烈震荡15s，室温放置充分作用3min后12,000rpm离心15min。(3)RNA沉淀：将上层水相转移至新的1.5mL无RNA酶EP管中，加入500μL的异丙醇使RNA分子沉淀，充分颠倒混匀。(4)RNA洗涤：轻轻吸出上清液(注意不要吸到白色沉淀)，在纸上控干，在沉淀中加入1mL 75％乙醇(750μL无水乙醇，250μL DEPC水，提前配置)，7,500rpm离心5min。(5)RNA溶解：弃上清，干燥10min。加入适量DEPC水吹打溶解，置于冰上，测OD260/280。然后使用抗体恒定区特异性引物(轻链引物：mIgkappaRT:CTAACACTCATTCCTGTTGA；重链引物mIgG1HCRT:TTATTTACCAGGAGAGTGGGA)，利用Thermo逆转录试剂盒反转录为cDNA，并以相应的cDNA为模板用Ex Taq酶(Takara)和简并引物进行PCR扩增，随后送到上海生工生物技术公司进行测序，以获得单抗的重链和轻链的可变区序列。使用IgBLAST工具确定互补决定区(CDR)的位置。为了测定抗体序列，从杂交瘤细胞中提取RNA，然后简并引物法扩得可变区序列。测序结果显示单抗可变区的序列的胚系基因家族的基因片段(表3)，其中VH，DH，JH分别为重链可变区的V，D，J胚系基因片段，VK，JK分别为轻链可变区的V，J胚系基因片段。

表3抗金黄色葡萄球菌单抗可变区的胚系基因(IgBlast分析)

注：V_H，D_H，J_H分别为重链可变区的V，D，J胚系基因片段；V_K，J_K分别为轻链可变区的V，J胚系基因片段。

测序结果如下：

轻链核苷酸序列(SEQ ID NO:10)

注：加粗部分为可变区序列，非加粗部分为恒定区序列。

轻链氨基酸序列(SEQ ID NO:7)：

注：加粗部分为可变区序列(SEQ ID NO:6)，非加粗部分为恒定区序列，*为终止密码子。

其中：

LCDR1：QSIVTS(SEQ ID NO:1)

LCDR2：YAS

LCDR3：QQSNKWPTWT(SEQ ID NO:2)

重链核苷酸序列(SEQ ID NO:11)：

注：加粗部分为可变区序列，非加粗部分为恒定区序列。

重链氨基酸序列(SEQ ID NO:9)：

注：加粗部分为可变区序列(SEQ ID NO:8)，非加粗部分为恒定区序列，*为终止密码子。

其中：

HCDR1：GFSLTTYA(SEQ ID NO:3)

HCDR2：IWTGGTS(SEQ ID NO:4)

HCDR3：AREVFAY(SEQ ID NO:5)

实施例6金黄色葡萄球菌免疫磁珠的制备

1、磁珠的活化

取2mg(即200μL，10mg/mL)磁珠置于1.5mL EP管中，置于磁力架；静置1min，磁珠与上清分离后弃上清，加入500μl活化缓冲液(MEST，pH 6.0)重悬磁珠，涡旋振荡器混合均匀，置于磁分离架上1min，弃上清，反复洗涤3次，每次1min，弃上清；加入200μL EDC(5mg/mL)和200μL NHS(5mg/mL)(现配现用)，混匀磁珠后，置于37℃摇床，200rpm/min，活化30min；取出，瞬离，放置磁力架1min，加入500μL活化缓冲液(MEST，pH 6.0)，将磁珠混匀，转移到新的EP管中；磁分离，移除上清，500μL活化缓冲液(MEST，pH 6.0)洗涤2次，用磁力架进行磁分离，移液器吸取上清，此时，磁珠表面的羧基已经活化，能够与带有伯胺基的生物配体进行共价偶联。

2、免疫磁珠的制备

500μL偶联缓冲液MEST(MEST，pH 7.0)洗涤1次，弃上清；取新EP管，加入500μL偶联缓冲液MEST(MEST，pH 7.0)，吸取2.9μL适量腹水SP4与偶联缓冲液中涡旋震荡，将混合物吸入装有磁珠的EP管中，混匀后置于旋转培养仪，30rpm/min，室温反应至少3h；偶联后，轻柔瞬离，将EP管置于磁分离架，静置1min，500μL PBST轻柔洗涤3次；加入1mL封闭液进行封闭，EP管置于37℃摇床，200rpm/min，封闭至少30min(或者4℃过夜)；取出，轻柔瞬离，置于磁力架，静置，弃上清，PBST洗涤4次，每次1min，弃上清；加入600μL储存液，重悬免疫磁珠，4℃保存，待用。

3、免疫磁珠捕获细菌

根据各细菌的生长特性，单核细胞增生李斯特菌CICC21662和枯草芽孢杆菌ATCC6633用BHI培养基；金黄色葡萄球菌ATCC6538用TSB培养基；肠出血性大肠杆菌O157ATCC43889和鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028用LB培养基；副溶血弧菌ATCC33847用3％NaCl的LB培养基；铜绿假单胞菌ATCC9027、阪崎肠杆菌CICC21561、福氏志贺氏菌CMCC51572，蜡样芽孢杆菌CMCC63303、肺炎克雷伯氏菌CMCC46117、普通变形杆菌CMCC49027用营养肉汤；乳房链球菌ATCC BAA-854用THB培养基。各细菌培养条件均为37℃，180rpm摇床增菌。待OD₆₀₀为1.0时，用PBST对菌液进行10倍(或5倍)梯度稀释，直到适当浓度。此时，吸取适量稀释后的菌液加入到新的EP管中，取适量偶联后的免疫磁珠(提前轻柔混匀)于其混匀，置于旋转培养仪，30r/min，室温反应一定时间。同时吸取适量稀释后的菌液涂LB平板，计算原始菌液浓度。捕获结束后，轻柔瞬离，置于磁力架。吸取上清100μL，涂LB平板，计算磁珠捕获后，上清残留细菌数量。后500μL PBST轻柔洗涤免疫磁珠1次，200μL PBST将磁珠重悬混匀，吸取100μL挂LB平板，计算磁珠捕获数。免疫磁珠捕获率计算公式如下：

捕获率＝磁珠捕获数/(上清残留数+磁珠捕获数)。

实施例7免疫磁珠捕获条件的优化

1.免疫磁珠偶联缓冲液的确定

偶联缓冲液的成分、浓度和pH值均可以对单抗的偶联率造成较大的影响，进而影响到目的细菌的捕获率，因此，对于偶联缓冲液的探索对于本实验具有重大意义。本实验分别用MES(0.025M，pH 7.0)、MEST(0.025M，pH 7.0)、PBS(0.01M，pH 7.0)和PBST(0.01M，pH7.0)共4种偶联缓冲液，以金黄色葡萄球菌ATCC6538为目的菌，PBST梯度稀释至约10⁴CFU/mL，以DM3-050(直径750nm)制备免疫磁珠。按照上述标记和捕获步骤进行实验。平行测定3次，计算捕获率，进而确定最佳偶联缓冲液。

由图4可知，以MEST(0.025M，pH 7.0)为偶联缓冲液时，捕获率最高，可以达到96％左右，因此本研究后期选择MEST(0.025M，pH 7.0)为偶联缓冲液。

2.免疫磁珠最佳直径的确定

根据之前的研究，免疫磁珠的直径变化可对特定细菌的捕获造成较大的影响。本实验以金黄色葡萄球菌ATCC6538为目的菌，PBST梯度稀释至约10⁴CFU/mL，选择海狸公司3种不同规格的磁珠，DM3-020(直径180nm)、DM3-050(直径750nm)和SM3-D100(直径1150nm)进行偶联和捕获实验，实验方法同上。本实验重复3次，计算捕获率，确定免疫磁珠最佳直径。

由图5可知，虽然SM3-D100免疫磁珠的捕获率要更高一点，且DM3-050和SM3-D100在捕获率上差异显著(P<0.05)，且细菌在DM3-050免疫磁珠中生长速度更快，导致DM3-050磁珠捕获到的细菌绝对数更多，这可能是由于腹水中的营养物质促进了细菌在捕获过程中的生长。因此，选择DM3-050羧基磁珠进行下一步的实验，将其制备的免疫磁珠命名为SP4免疫磁珠。

3.免疫磁珠最佳捕获时间的确定

探索不同捕获时间对于捕获率的影响，以金黄色葡萄球菌ATCC6538为目的菌，PBST梯度稀释至约10⁴CFU/mL，运用SP4免疫磁珠进行捕获实验。分别选取捕获时间为15min、30min、45min、60min、75min和90min为检测点，进行捕获。该实验重复3次，计算捕获率，确定最佳捕获时间。

以金黄色葡萄球菌ATCC6538为目的细菌，运用SP4免疫磁珠进行捕获实验。根据图6，捕获时间在45min后，捕获率基本稳定，所以选择45min，为最佳捕获时间。

实施例8免疫磁珠的性能分析

1.免疫磁珠的特异性分析

选取金黄色葡萄球菌ATCC6538、ATCC29213、ATCC25923、CMCC26003、SH001株进行免疫磁珠的广谱性适用实验。选取枯草芽孢杆菌ATCC6633、乳房链球菌ATCC BAA-854和铜绿假单胞菌ATCC9027、肺炎克雷伯氏菌CMCC46117、蜡样芽孢杆菌CMCC63303、福氏志贺氏菌CMCC51572、普通变形杆菌CMCC49027、阪崎肠杆菌CICC21561、单核细胞增生李斯特菌CICC21662、肠出血性大肠杆菌O157 ATCC43889、副溶血弧菌ATCC33847和鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028共12株常见的食源性病原微生物进行免疫磁珠的特异性实验。SP4免疫磁珠，捕获时间为45min，其余实验步骤同上，该实验重复3次，计算捕获率，确定免疫磁珠的广谱性和特异性。

如图7，SP4免疫磁珠对于4株来源不同的金黄色葡萄球菌捕获率均在90％以上，而对于其余12种常见的食源性病原微生物捕获率均低于10％，说明SP4免疫磁珠特异性较好。

2.不同细菌浓度下免疫磁珠的捕获性能分析

选取金黄色葡萄球菌ATCC6538为目的菌，梯度稀释至捕获体系内约10⁴CFU、10³CFU和10²CFU细菌，运用SP4免疫磁珠进行捕获，捕获时间45min，按照以上步骤进行实验，该实验重复3次，计算捕获率。

如图8，细菌数量约为10⁴CFU、10³CFU和10²CFU时，SP4免疫磁珠的捕获率均在90％以上，提示该免疫磁珠在细菌浓度较低的情况下捕获率仍然很高。

3.不同捕获体系和磁珠量对于免疫磁珠捕获率的影响

选取金黄色葡萄球菌ATCC6538为目的菌，用PBST将菌液稀释至10⁴CFU/mL左右，分别取100μL免疫磁珠与100μL和900μL菌液混合，另外取200μL免疫磁珠与800μL菌液混合，进行捕获实验，捕获时间45min，捕获步骤同上。该实验重复3次，计算捕获率，确定不同捕获体系和磁珠量对于捕获率的影响。

如图9，100μL免疫磁珠与100μL菌液混合捕获时，和200μL免疫磁珠与800μL菌液混合时，捕获率均在90％以上。100μL免疫磁珠与900μL菌液混合捕获时，捕获率有所下降，但依然维持在80％以上。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院上海兽医研究所（中国动物卫生与流行病

学中心上海分中心）

<120> 抗金黄色葡萄球菌单克隆抗体、应用及包含其的免疫磁珠

<130> P19011197C

<160> 11

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 6

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 1

Gln Ser Ile Val Thr Ser

1 5

<210> 2

<211> 10

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 2

Gln Gln Ser Asn Lys Trp Pro Thr Trp Thr

1 5 10

<210> 3

<211> 8

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 3

Gly Phe Ser Leu Thr Thr Tyr Ala

1 5

<210> 4

<211> 7

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 4

Ile Trp Thr Gly Gly Thr Ser

1 5

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 5

Ala Arg Glu Val Phe Ala Tyr

1 5

<210> 6

<211> 108

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 6

Asp Ile Leu Leu Ile Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Val Thr Ser

20 25 30

Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Lys Trp Pro Thr

85 90 95

Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ser Lys

100 105

<210> 7

<211> 215

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 7

Asp Ile Leu Leu Ile Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Val Thr Ser

20 25 30

Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Lys Trp Pro Thr

85 90 95

Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ser Lys Arg Ala Asp Ala

100 105 110

Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser

115 120 125

Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp

130 135 140

Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val

145 150 155 160

Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met

165 170 175

Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser

180 185 190

Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys

195 200 205

Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys

210 215

<210> 8

<211> 113

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 8

Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Thr Tyr

20 25 30

Ala Ile His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Val Ile Trp Thr Gly Gly Thr Ser Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met

50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu

65 70 75 80

Lys Met Ser Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Glu Val Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

100 105 110

Ala

<210> 9

<211> 437

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 9

Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Thr Tyr

20 25 30

Ala Ile His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Val Ile Trp Thr Gly Gly Thr Ser Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met

50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu

65 70 75 80

Lys Met Ser Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Glu Val Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

100 105 110

Ala Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser

115 120 125

Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly

130 135 140

Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser

145 150 155 160

Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr

165 170 175

Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr

180 185 190

Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys

195 200 205

Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val

210 215 220

Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val

225 230 235 240

Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile

245 250 255

Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val

260 265 270

Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser

275 280 285

Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu

290 295 300

Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala

305 310 315 320

Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro

325 330 335

Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys

340 345 350

Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr

355 360 365

Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr

370 375 380

Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu

385 390 395 400

Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser

405 410 415

Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser

420 425 430

His Ser Pro Gly Lys

435

<210> 10

<211> 648

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 10

gacatcttgc tgattcagtc tccagccatc ctgtctgtga gtccaggaga aagagtcagt 60

ttctcctgca gggccagtca gagcattgtc acaagcatac actggtatca gcaaagaaca 120

aatggttctc caaggcttct cataaagtat gcttctgagt ctatctctgg gatcccttcc 180

aggtttagtg gcagtggatc agggacagat tttactctta gcatcaacag tgtggagtct 240

gaagatattg cagattatta ctgtcaacaa agtaataagt ggccaacgtg gacgttcggt 300

ggaggcacca agctggaaag caaacgggct gatgctgcac caactgtatc catcttccca 360

ccatccagtg agcagttaac atctggaggt gcctcagtcg tgtgcttctt gaacaacttc 420

taccccaaag acatcaatgt caagtggaag attgatggca gtgaacgaca aaatggcgtc 480

ctgaacagtt ggactgatca ggacagcaaa gacagcacct acagcatgag cagcaccctc 540

acgttgacca aggacgagta tgaacgacat aacagctata cctgtgaggc cactcacaag 600

acatcaactt cacccattgt caagagcttc aacaggaatg agtgttag 648

<210> 11

<211> 1314

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 11

caggtgcagc tgaaggagtc aggacctggc ctggtggctc cctcacagag cctgtccgtc 60

acttgcactg tctctgggtt ttcattaacc acctatgcta tacactggat tcgccagcct 120

ccaggaaagg gtctggagtg gctgggagta atttggactg gtggaacctc aaattataat 180

tcggctctca tgtccagact gagcatcagc aaagacaatt ccaagagcca agttttctta 240

aaaatgagca gtctgcaaac tgatgacacg gccatgtact actgtgccag agaggtcttt 300

gcttactggg gccaagggac tctggtcact gtctctgcag ccaaaacgac acccccatct 360

gtctatccac tggcccctgg atctgctgcc caaactaact ccatggtgac cctgggatgc 420

ctggtcaagg gctatttccc tgagccagtg acagtgacct ggaactctgg atccctgtcc 480

agcggtgtgc acaccttccc agctgtcctg cagtctgacc tctacactct gagcagctca 540

gtgactgtcc cctccagcac ctggcccagc gagaccgtca cctgcaacgt tgcccacccg 600

gccagcagca ccaaggtgga caagaaaatt gtgcccaggg attgtggttg taagccttgc 660

atatgtacag tcccagaagt atcatctgtc ttcatcttcc ccccaaagcc caaggatgtg 720

ctcaccatta ctctgactcc taaggtcacg tgtgttgtgg tagacatcag caaggatgat 780

cccgaggtcc agttcagctg gtttgtagat gatgtggagg tgcacacagc tcagacgcaa 840

ccccgggagg agcagttcaa cagcactttc cgctcagtca gtgaacttcc catcatgcac 900

caggactggc tcaatggcaa ggagttcaaa tgcagggtca acagtgcagc tttccctgcc 960

cccatcgaga aaaccatctc caaaaccaaa ggcagaccga aggctccaca ggtgtacacc 1020

attccacctc ccaaggagca gatggccaag gataaagtca gtctgacctg catgataaca 1080

gacttcttcc ctgaagacat tactgtggag tggcagtgga atgggcagcc agcggagaac 1140

tacaagaaca ctcagcccat catggacaca gatggctctt acttcgtcta cagcaagctc 1200

aatgtgcaga agagcaactg ggaggcagga aatactttca cctgctctgt gttacatgag 1260

ggcctgcaca accaccatac tgagaagagc ctctcccact ctcctggtaa ataa 1314

Claims

1.一种抗金黄色葡萄球菌的单克隆抗体，其包含重链可变区和轻链可变区，其特征在于，所述轻链可变区的LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，LCDR2的氨基酸序列如YAS所示，LCDR3的序列如SEQ ID NO:2所示；所述重链可变区的HCDR1的序列如SEQ ID NO:3所示，HCDR2的序列如SEQ ID NO:4所示，HCDR3的序列如SEQ ID NO:5所示。

2.如权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述轻链可变区的序列如SEQ ID NO:6所示，所述重链可变区的序列如SEQ ID NO:8所示。

3.如权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的轻链的序列如SEQID NO:7所示，重链的序列如SEQ ID NO:9所示。

4.一种包含如权利要求1-3任一项所述的单克隆抗体的单克隆抗体免疫磁珠。

5.如权利要求4所述的单克隆抗体免疫磁珠，其特征在于，所述免疫磁珠的直径为700～800nm。

6.如权利要求5所述的单克隆抗体免疫磁珠，其特征在于，所述免疫磁珠的直径为750nm。

7.一种如权利要求4～6任一项所述的单克隆抗体免疫磁珠在检测金黄色葡萄球菌中的应用。

8.一种检测金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于，其包括以下步骤：

(1)按照金黄色葡萄球菌检验国际方法中的样品前处理办法处理样品，将如权利要求4～6任一项所述的单克隆抗体免疫磁珠与所述样品在偶联缓冲液中孵育40～50min；

(2)计算捕获率。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的偶联缓冲液为MEST缓冲液。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述MEST缓冲液的浓度为0.025M，pH为7.0。

11.如权利要求8-10任一项所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述样品在偶联缓冲液中孵育45min。