CN117466997A - 具有中和活性的西尼罗病毒单克隆抗体及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种具有中和活性的西尼罗病毒单克隆抗体及其制备方法与应用。本发明通过将灭活西尼罗病毒作为抗原对小鼠进行免疫试验，并在免疫试验过程中对小鼠血清的中和效价进行监测，筛选出血清中和效价最高的小鼠；再将骨髓瘤细胞SP2/0与筛选出的血清中和效价最高的小鼠的免疫脾细胞进行融合，筛选出阳性杂交瘤细胞进行亚克隆后，进一步通过中和试验对杂交瘤细胞株进行筛选，最终获得能够分泌具有中和活性的西尼罗病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株C9‑G11‑F3。该杂交瘤细胞株C9‑G11‑F3分泌的单克隆抗体不仅具有中和西尼罗病毒的能力，同时具有针对乙型脑炎病毒的交叉保护能力，具有较高的研究意义和应用价值。

Description

具有中和活性的西尼罗病毒单克隆抗体及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种具有中和活性的西尼罗病毒单克隆抗体及其制备方法与应用。
背景技术
西尼罗病毒(West Nile virus，WNV)最初是1937年从乌干达西尼罗地区一名发热的妇女血液中分离出来而被发现，因此得名为西尼罗病毒。它是一种有囊膜的正链RNA病毒，属于黄病毒科黄病毒属，同时也是一种蚊媒传播的病毒，能够使人和马患上致命的神经性脑炎，并引起鸟、鸡等的死亡。
2022年，羚羊谷、圣弗南度谷和圣盖博谷报告了人类WNV感染的病例，共确定了6例病例，其中大多数在7月底和8月初发病；根据希腊疾病防控中心发布的统计数据，2019年希腊共确诊WNV感染病例35例，其中仅8月2日至8月8日一周就报告了2例死亡病例。这给当地的医疗系统和人民健康带来了巨大的冲击，也给全球的公共卫生带来了巨大的挑战。
尽管目前我国还没有WNV确诊病例，但WNV已经在欧洲和北美的温带区域肆虐，随着全球经济贸易一体化的建设，外来病给全球人类的健康带来了威胁，外来病的防治在保障国民健康和医疗系统稳健方面都处于重要战略地位。但是目前市面上并没有针对WNV的特效药物或商品化疫苗上市，而众所周知中和抗体对于疾病的防治有着不错效果。因此，筛选以及制备WNV中和抗体，对进一步开展WNV致病机制研究与防治外来病有重要意义。
现有技术中，公开号为CN104498438A的专利提供了一种西尼罗病毒单克隆抗体及试剂盒，该专利通过将重组表达的西尼罗病毒囊膜蛋白E蛋白纯化后免疫小鼠，取免疫小鼠脾细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞进行融合后对上述细胞进行培养，进一步亚克隆，筛选出一株针对西尼罗病毒的单克隆抗体及分泌这些单克隆抗体的杂交瘤细胞。然而，该方法利用E蛋白免疫小鼠，其最终获得的只是结合效价高的抗体，该抗体的中和活性较低；并且，按照该方法获得的抗体只能特异性针对西尼罗病毒，对于其他种属的黄病毒不具有交叉保护能力，作为治疗性抗体药物应用时适用范围较窄。
有鉴于此，有必要设计一种改进的具有中和活性的西尼罗病毒单克隆抗体及其制备方法与应用，以解决上述问题。
发明内容
针对上述现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种对西尼罗病毒具有较好的中和效果，同时对乙型脑炎病毒具有交叉保护能力的单克隆抗体。
为实现上述目的，本发明提供了一种具有中和活性的西尼罗病毒单克隆抗体，由杂交瘤细胞株C9-G11-F3分泌得到，具有中和西尼罗病毒的能力，同时具有针对乙型脑炎病毒的交叉保护能力；所述杂交瘤细胞株C9-G11-F3保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C202391。
作为本发明的进一步改进，所述单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区；所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示。
作为本发明的进一步改进，编码所述重链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，编码所述轻链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
为实现上述目的，本发明提供了上述具有中和活性的西尼罗病毒单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：
S1、制备西尼罗病毒液，依次对其进行灭活处理与浓缩处理后，作为抗原保存备用；
S2、利用步骤S1制备的所述抗原对小鼠进行免疫试验，并对进行免疫试验的小鼠的血清中和效价进行监测，筛选出中和效价最高的小鼠进行冲击免疫；
S3、将小鼠的骨髓瘤细胞SP2/0与步骤S2中冲击免疫后的小鼠的免疫脾细胞进行细胞融合，筛选出阳性杂交瘤细胞进行亚克隆，并通过中和试验对经过亚克隆的阳性细胞株进行筛选，获得能够分泌具有中和活性的西尼罗病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株C9-G11-F3。
作为本发明的进一步改进，在步骤S2中，对所述试验动物的抗血清中和效价进行监测后，再根据监测的中和效价对所述免疫试验的免疫程序进行调整。
作为本发明的进一步改进，在步骤S2中，筛选出的所述中和效价最高的小鼠的血清对西尼罗病毒的中和效价为1:3200。
作为本发明的进一步改进，在步骤S3中，获得的所述杂交瘤细胞株C9-G11-F3分泌的所述单克隆抗体对西尼罗病毒的中和效价为1:50。
作为本发明的进一步改进，在步骤S3中，获得的所述杂交瘤细胞株C9-G11-F3分泌的所述单克隆抗体对感染西尼罗病毒具有40％的保护效力，对感染乙型脑炎病毒具有20％的保护效力。
本发明还提供了上述具有中和活性的西尼罗病毒单克隆抗体在制备人源化抗体中的应用。
本发明还提供了上述具有中和活性的西尼罗病毒单克隆抗体在制备药物中的应用；所述药物为预防或治疗因西尼罗病毒与乙型脑炎病毒中的至少一种引起的疾病的药物。
本发明的有益效果是：
本发明提供的具有中和活性的西尼罗病毒单克隆抗体的制备方法，通过将灭活西尼罗病毒作为抗原对小鼠进行免疫试验，并在免疫试验过程中对小鼠血清的中和效价进行监测，再根据监测结果对免疫试验的免疫程序进行调整，从而优选出最适宜的免疫程序，以便筛选出血清中和效价较高的小鼠。在此基础上，本发明通过将筛选出的血清中和效价较高的小鼠的免疫脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合，筛选出阳性杂交瘤细胞进行亚克隆后，再进一步通过中和试验对杂交瘤细胞株进行筛选，最终获得的杂交瘤细胞株C9-G11-F3能够分泌出具有中和活性的西尼罗病毒单克隆抗体，该单克隆抗体为中和抗体，不仅对西尼罗病毒具有较高的中和效价，还具有对乙型脑炎病毒的交叉保护能力，为探究西尼罗病毒的致病机制提供了新的原材料，同时也为针对西尼罗病毒及乙型脑炎病毒的治疗性抗体或药物的研发设计提供了新的思路。
附图说明
图1为西尼罗病毒的灭活效果验证图。
图2为以灭活西尼罗病毒作为抗原免疫第90天的小鼠血清中和效价的检测结果。
图3为不同抗原免疫后第43天的小鼠血清中和效价对比图。
图4为杂交瘤细胞株C9-G11-F3分泌的单克隆抗体对西尼罗病毒和乙型脑炎病毒的中和效价。
图5为采用常规的ELISA方法筛选的细胞株对JEV的结合效果及中和效果图。
图6采用不同筛选方式获取的杂交瘤细胞上清的中和效果对比图。
图7为杂交瘤细胞遗传稳定性的检测结果。
图8为腹水纯化效果的SDS-PAGE分析结果。
图9为本发明提供的单克隆抗体对小鼠的保护率分析。
图10为小鼠脑内病毒载量检测结果。
图11为小鼠脑组织相关细胞因子的检测结果。
图12为小鼠脑组织切片的IHC分析结果。
图13为小鼠脑组织切片的HE染色结果。
图14为单克隆抗体的人源化重链质粒。
图15为单克隆抗体的人源化轻链质粒。
图16为单克隆抗体的人源化抗体的中和效果图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细描述。
在此，还需要说明的是，为了避免因不必要的细节而模糊了本发明，在附图中仅仅示出了与本发明的方案密切相关的结构和/或处理步骤，而省略了与本发明关系不大的其他细节。
另外，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
本发明提供了一种具有中和活性的西尼罗病毒单克隆抗体，由杂交瘤细胞株C9-G11-F3分泌得到，具有中和西尼罗病毒的能力，同时具有针对乙型脑炎病毒的交叉保护能力；所述杂交瘤细胞株C9-G11-F3保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C202391。
所述单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区；所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；编码所述重链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，编码所述轻链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
本发明还提供了上述具有中和活性的西尼罗病毒单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：
S1、制备西尼罗病毒液，依次对其进行灭活处理与浓缩处理后，作为抗原保存备用；
S2、利用步骤S1制备的所述抗原对小鼠进行免疫试验，并对进行免疫试验的小鼠的血清中和效价进行监测，筛选出中和效价最高的小鼠进行冲击免疫；
S3、将小鼠的骨髓瘤细胞SP2/0与步骤S2中冲击免疫后的小鼠的免疫脾细胞进行细胞融合，筛选出阳性杂交瘤细胞进行亚克隆，并通过中和试验对经过亚克隆的阳性细胞株进行筛选，获得能够分泌具有中和活性的西尼罗病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株C9-G11-F3。
通过上述方式，本发明选择了灭活西尼罗病毒作为抗原，并在免疫试验及杂交瘤细胞株的筛选过程中均以中和试验的结果作为主要的筛选依据，与现有技术中以蛋白作为抗原进行免疫，并以间接ELISA法检测到的结合效价作为主要筛选依据的方式相比，有效解决了抗体中和活性低、对其他种属的黄病毒不具有交叉保护能力的问题，本发明最终获得的杂交瘤细胞株C9-G11-F3分泌的具有中和活性的西尼罗病毒单克隆抗体是一种中和抗体，不仅对西尼罗病毒具有较高的中和效价，还具有对乙型脑炎病毒的交叉保护能力，具有较高的研究意义和应用价值。
优选的，在步骤S2中，对所述试验动物的抗血清中和效价进行监测后，再根据监测的中和效价对所述免疫试验的免疫程序进行调整。如此操作，能够优选出最适宜的免疫程序，以提高小鼠血清的中和效价，最终筛选出的小鼠的血清对西尼罗病毒的中和效价能够达到1:3200，显著优于现有技术中的常规中和效价水平。
优选的，在步骤S3中，通过中和试验对经过亚克隆的阳性细胞株进行筛选后，以获得中和效价高的杂交瘤细胞株；最终筛选获得的所述杂交瘤细胞株C9-G11-F3分泌的所述单克隆抗体对西尼罗病毒的中和效价为1:50；该单克隆抗体对感染西尼罗病毒具有40％的保护效力，对感染乙型脑炎病毒具有20％的保护效力，实现了对西尼罗病毒和乙型脑炎病毒的交叉保护。
本发明还提供了上述具有中和活性的西尼罗病毒单克隆抗体在制备人源化抗体中的应用。通过对鼠源的单克隆抗体进行测序与人源化改造，即可获得人源化抗体。同时，本发明还提供了上述具有中和活性的西尼罗病毒单克隆抗体在制备药物中的应用；所述药物为预防或治疗因西尼罗病毒与乙型脑炎病毒中的至少一种引起的疾病的药物。
下面结合具体实施例对本发明提供的具有中和活性的西尼罗病毒单克隆抗体及其制备方法与应用进行详细说明。
实施例1
本实施例提供了一种具有中和活性的西尼罗病毒单克隆抗体的制备方法，具体包括如下步骤：
S1、抗原的制备
1.1、西尼罗病毒的扩大培养
复苏BHK-21细胞并连续传代3次以上，待细胞状态稳定时，将细胞接入T175 mm2细胞培养瓶，待细胞铺板培养瓶的80％左右时，以0.01MOI的剂量接入WNV NY99，于37℃，5％二氧化碳培养箱中孵育1h后，弃去上清，加入DMEM维持培养基并继续将细胞于37℃，5％二氧化碳培养箱中培养36-72h，实时观察细胞状态，在细胞出现变圆、吹泡、脱落等病变形态时，将其置于-80℃，如此冻融3次。将细胞收集于50mL无菌离心管中，1000r/min离心10min，使用0.22μm滤膜过滤细胞碎片，得到的上清液即为西尼罗病毒液；将西尼罗病毒液分装于1.5mL无菌离心管中，每管分装500μL，-80℃保存备用。
1.2、病毒滴度测定
将生长状态良好的BHK-21细胞接种于12孔板培养，待细胞长至铺满孔的90％时，使用无血清DMEM培养基清洗两遍待用；将需要测定的西尼罗病毒液10倍倍比稀释，充分混匀后加入12孔板，每孔加入200μL DMEM稀释的病毒液，每个稀释度设置两个重复；放置37℃，5％二氧化碳培养箱中培养1h，使用DMEM基础培养基清洗两遍；每孔加入1mL 1.5％羧甲基纤维素钠，37℃培养，培养过程勿移动；第五天用空斑固定液固定12h，弃去空斑固定液，自来水轻轻冲洗晾干，然后用空斑染色液染色4h后，在自来水下轻轻冲洗，拍干后计数空斑，并根据空斑形成单位(PFU/mL)＝X1+X2+X3+……+Xn/n*V×d计算病毒滴度。其中，X1、X2、X3、……Xn表示同一病毒稀释度在不同孔板中得到的空斑数，n表示计算孔板的培养板孔数；V表示加入的病毒稀释液体积；d表示病毒稀释液的稀释倍数。在本实施例中，计算得到病毒滴度为2×107PFU/mL。
1.3、西尼罗病毒液灭活及灭活效果验证
使用β-丙内酯对西尼罗病毒液进行灭活：将终浓度为0.05％的β-丙内酯加入需要灭活的西尼罗病毒液中，置于4℃24h后将其放置于37℃2h以水解β-丙内酯，得到灭活后的西尼罗病毒液。将灭活后的西尼罗病毒液与BHK-21细胞上盲传3代，验证其灭活效果，结果如图1所示。
在图1中，A为阴性对照组(con)、未灭活的西尼罗病毒液(WNV)与灭活后的西尼罗病毒液(WNV+丙内酯)在BHK-21细胞上盲传三代的细胞状态对比图，B为盲传三代后的灭活西尼罗病毒液(WNV+β-丙内酯)与未灭活的西尼罗病毒液(WNV)的空斑结果对比图。由图1可以证实，上述方法得到的灭活的西尼罗病毒液中的西尼罗病毒已灭活。
1.4、灭活后病毒液的浓缩
将灭活后的西尼罗病毒液通过制备型高速离心机在4℃，30000r/min的条件下离心2h，小心地弃去上清，用1mL无菌PBS重悬灭活西尼罗病毒粒子，作为抗原保存备用，并通过BCA法测得蛋白浓度为0.9mg/mL。
S2、动物免疫
用步骤S1中制备的抗原对小鼠进行免疫试验。本实施例中，免疫试验采用的小鼠为6周龄雌性的BALB/c小白鼠(购自华中农业大学兽医院，简称小鼠)。
在每次免疫之后，对小鼠进行下颌静脉采血，先采用间接ELISA方法检测小鼠的血清效价，确认免疫成功后再进行中和试验，对小鼠血清的中和效价进行实时监测。其中，通过中和试验测定中和效价的步骤具体如下：
(1)将血清置于56℃的水浴锅中30min，灭活补体；
(2)采用倍比稀释的方法，将血清进行稀释；
(3)将稀释后的血清与等体积的病毒充分混匀，置于37℃温箱，作用1.5h；
(4)将“病毒-血清”混合物接种在铺满单层的BHK-21细胞的24孔细胞板上；
(5)将细胞板放于37℃温箱孵育1h后，使用无血清DMEM培养基清洗两遍；
(6)细胞板中加入已配置好的1.5％羧甲基纤维素钠，37℃培养，勿移动。第五天用10％甲醛固定液固定12h，然后结晶紫染色液染色4h，回收染色液后在自来水下轻轻冲洗，拍干后计数空斑；
(7)计算，中和抗体计算采用PRNT50法，即空斑个数为阳性对照一半的血清稀释度为中和效价。
按照上述方式测得小鼠血清的中和效价后，再根据该中和效价对免疫试验的免疫程序进行调整，调整原则在于尽可能获得具有较高中和效价的小鼠。经过大量试验调整后，优选出的小鼠免疫程序如表1所示。
表1优选出的小鼠免疫程序
按照上述免疫程序进行初次免疫和四次加强免疫后，在免疫后第90天，小鼠的血清中和效价检测结果如图2所示。其中，A为小鼠血清中和曲线，B为小鼠血清中和效价统计，C为小鼠血清针对西尼罗病毒WNV和乙型脑炎病毒JEV的效价，图中的8-22表示小鼠的编号。由图2可以看出，对西尼罗病毒具有最高中和效价的21号小鼠的血清同时也对乙型脑炎病毒具有最高的中和效价，其对西尼罗病毒的中和效价能够达到1:3200，对乙型脑炎病毒的中和效价能够达到1:400，显著优于现有技术中的常规中和效价水平。
为了验证免疫抗原的选择对于小鼠血清中和效价的影响，以常规的E蛋白(Envelope protein)作为抗原，按照上述方式进行免疫试验，并在免疫后第43天取小鼠血清，用PRNT法测定小鼠血清的中和效价，并将其与本实施例中以灭活西尼罗病毒(Inactivated WNV)为抗原免疫43天的小鼠血清中和效价进行对比，结果如图3所示。由图3可以看出，常规的以E蛋白为抗原的方式不仅具有较低的中和效价，且小鼠血清均不具有JEV交叉保护能力，而本发明选择以灭活西尼罗病毒作为抗原则能够显著提升对WNV的中和效价，还能够使部分小鼠表现出对JEV的交叉保护能力，以便在后续筛选过程中获得具有较高中和效价且能够对JEV进行交叉保护的单克隆抗体；同时，以灭活西尼罗病毒作为抗原免疫后第43天的小鼠血清中和效价也明显低于免疫后第90天的中和效价，表明完整按照上述免疫程序进行免疫也能够有效提高小鼠血清的中和效价。
在进行细胞融合的前三天，对筛选出的21号小鼠再进行冲击免疫(腹腔注射抗原0.2mg)。
S3、细胞融合与杂交瘤细胞筛选
3.1、SP2/0瘤细胞的制备
从小鼠实体瘤中制备SP2/0细胞。具体步骤如下：
(1)复苏实验室冻存的SP2/0细胞于六孔板培养，待细胞状态良好时，用1640基础培养液(购买于武汉赛维尔生物科技有限公司)重悬，皮下注射BALB/c小鼠(未进行免疫)，约14天后小鼠背部长出肿瘤；
(2)将小鼠拉颈处死，用75％酒精浸泡5min；
(3)在超净工作台上无菌状态下取瘤置无菌匀浆器中，加入5mL 1640基础培养液充分研磨后补加10mL 1640基础培养液，混匀后静置5min，待较大的组织块沉于管底后，吸取上层的细胞悬液于离心管中备用，再补加10mL 1640基础培养液重悬组织，如此重复洗涤两次，将细胞悬液1000r/min离心10min后，取沉淀用15mL 1640基础培养液重悬；
(4)于另一50mL离心管中加入20mL淋巴细胞分离液，将细胞悬液轻轻加于淋巴细胞分离液之上，1000r/min离心10min，用吸管吸取位于界面致密的白色细胞层，用10mL1640基础培养液洗涤一次，计数后备用。
3.2、免疫脾细胞的制备
取步骤S2中经过冲击免疫的小鼠一只，眼眶放血处死，收集血液并分离血清，即为阳性血清。
将小鼠用75％酒精中浸泡5min后移至超净台内放在解剖板上，前肢固定，后肢交叉(左后肢交叉)固定。先剪并撕开皮肤暴露腹膜，换一套剪刀镊子，剪开腹膜暴露脾脏，无菌条件下取出脾脏，放入匀浆器中，加入5mL1640基础培养基研磨，再补加10mL 1640基础培养基，混匀后静置5min；轻轻吸取上层液体于离心管中，匀浆器中再补加10mL 1640基础培养基，混匀静置5min，如此重复洗涤2次，1000r/min离心10min，弃去上清，将脾细胞用适量1640基础培养基重悬后备用。
3.3、饲养细胞的制备
取一只未经免疫的BALB/c小鼠，眼眶放血处死，收集血液并分离血清，得到阴性血清。
将小鼠于75％酒精中浸泡5min后，按照上述步骤3.2中免疫脾细胞的制备方法制备饲养脾细胞，最后获得的饲养脾细胞用适量HAT培养基(购自sigma公司)重悬后均匀平铺在96孔细胞培养板中备用，100μL/孔。
3.4、骨髓瘤细胞与免疫脾细胞体外融合
(1)将步骤3.1得到的SP2/0骨髓瘤细胞悬液(1×107cells)与步骤3.2得到的免疫脾细胞悬液(1×108cells)于50mL离心管中混匀，1000r/min离心10min；
(2)倒空上清(可用灭菌的滤纸吸干)，轻轻敲击离心管底使细胞松动；
(3)将装有细胞混合物的离心管置于37℃水浴中，1min内缓慢加入预热至37℃的50％聚乙二醇(PEG)0.8mL，边加边轻轻用吸管尖搅拌；
(4)继续搅拌1min；
(5)5min内缓慢加入预热至37℃的1640基础培养基10mL，加入时需缓慢并不断轻轻搅拌；最后再缓慢加入30mL预热至37℃的1640基础培养基；
(6)1000r/min离心10min弃去上清后，37℃放置7min；
(7)用适量HAT培养基重悬，均匀平铺在已铺有饲养细胞的96孔细胞培养板，100μL/孔，于37℃，5％CO2培养箱中培养。
3.5、阳性杂交瘤细胞的筛选
融合后第4天补加50μL新鲜的HAT培养基，第8-10天后吸弃全部培养基，换为HT(购自sigma公司)培养基(即1640基础培养基+20％胎牛血清+1％青链霉素+2％HT(次黄嘌呤+胸腺嘧啶核苷))，待融合细胞形成的集落长至培养孔1/4大小，细胞上清变黄时，采用常规间接进行ELISA方法检测杂交瘤细胞上清，具体步骤为：
将浓缩灭活的西尼罗病毒液和浓缩的未接毒BHK-21细胞上清(作为阴性对照)分别包被96孔酶标板，4℃过夜。包被后，用PBST缓冲液(PBS缓冲液+0.5％吐温)洗涤三次，加1％封闭液(1g牛血清白蛋白溶于100mLPBST缓冲液中)于37℃温育1h；再用PBST洗涤三次，加入杂交瘤细胞培养上清，于37℃温育1h；PBST洗涤三次，加羊抗鼠IgG-HRP(武汉博士德生物工程有限公司)，于37℃温育1h，PBST洗涤三次后，加入底物液(购自武汉科前动物生物制品有限责任公司)和显色液(购自武汉科前动物生物制品有限责任公司)，10min后，观察显色反应并加终止液(购自武汉课前生物有限公司)，在630nm波长下测OD值。选取与抗原包被板反应阳性而与阴性对照板反应阴性且细胞生长旺盛形态良好的细胞生长孔作进一步亚克隆。
3.6、阳性杂交瘤细胞的亚克隆
克隆前先制备饲养细胞(具体步骤与步骤3.3一致)，将ELISA检测为阳性的杂交瘤细胞进行有限稀释，使得每个细胞培养孔有1-2个杂交瘤细胞。之后定时观察孔内细胞生长情况并记录；待克隆8-10天，细胞长至约培养孔的1/3-1/2大小时，用间接ELISA方法(具体步骤与步骤3.5中ELISA方法的步骤一致)进行检测；选单集落且检测呈阳性的孔用相同的方法再继续克隆，进一步纯化细胞株。
3.7、杂交瘤细胞株的筛选
将经过两次亚克隆的阳性细胞株通过中和试验(具体步骤与步骤S2中中和试验的步骤一致)进行筛选，筛选出中和活性最高的细胞株后再进行第三次亚克隆，得到能够分泌具有较高中和活性的西尼罗病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株，并对该杂交瘤细胞株对乙型脑炎病毒(JEV)、登革热病毒(DENV)、寨卡病毒(ZIKV)等其他种属黄病毒的中和效价进行测定。结果发现，筛选出的杂交瘤细胞株C9-G11-F3分泌的单克隆抗体对西尼罗病毒(WNV)和乙型脑炎病毒(JEV)均具有中和效果，其中和效价测定结果如图4所示。
由图4可以看出，杂交瘤细胞株C9-G11-F3分泌的单克隆抗体对西尼罗病毒的中和效价能够达到1:50，表示其对西尼罗病毒具有较好的中和效果；同时，该单克隆抗体对乙型脑炎病毒也有一定的中和效果，具有对乙型脑炎病毒的交叉保护能力。
为了验证杂交瘤细胞株的筛选方式对中和效果的影响，仅根据常规的ELISA方法对杂交瘤细胞株进行筛选，不额外增加中和试验进行筛选，选取上清具有强烈WNV结合反应(OD630值＞2.0)的杂交瘤细胞株，对其上清进行JEV结合能力测定，结果如图5中的A图所示，其中，蓝色孔表示与JEV有交叉反应，具有结合JEV的能力，灰色孔则表示阴性，不具有结合JEV的能力。由该图可以看出，共有28株细胞的上清具有结合JEV的能力，进一步对这28株细胞的JEV中和效果进行检测，结果如图2中的B图所示，由该图可以看出，这28株中仅有一株在细胞水平上具有较低(＜10％)的中和效果，而这种在细胞水平上极低的中和效果在动物试验中无法发挥保护实际效力，对乙型脑炎病毒无交叉保护作用。进一步将该细胞株对西尼罗病毒的中和效果与本实施例中利用中和试验筛选到的杂交瘤细胞上清的中和效果进行对比，结果如图6所示。在图6中，A为两种筛选方式下筛选出的杂交瘤细胞上清对西尼罗病毒抑制能力的空斑试验结果，B为两种筛选方式下筛选出的杂交瘤细胞上清对西尼罗病毒抑制效果的数据统计。由图6可以看出，本实施例中利用中和试验筛选出的杂交瘤细胞上清的中和效果明显优于仅根据常规的ELISA方法筛选出的杂交瘤细胞上清的中和效果。
因此，相比于常规的ELISA筛选方法，本发明基于特定的免疫条件获得具有高血清中和效价的小鼠，然后在此基础上结合中和试验作为筛选条件，不仅能够更加准确高效地筛选出对乙型脑炎病毒具有交叉保护作用的杂交瘤细胞株，且对于西尼罗病毒和乙型脑炎病毒均具有较高的中和效价。
为了检验本实施例中获得的杂交瘤细胞株C9-G11-F3的遗传稳定性，通过秋水仙素对该杂交瘤细胞进行处理，并通过吉姆萨染色在油镜下对杂交瘤细胞进行染色体计数，同时设置SP2/0细胞做相同处理以作为阴性对照，其检测结果如图7所示。计数可得，杂交瘤细胞的染色体条数(约100条)远多于对照组骨髓瘤SP2/0细胞，约为骨髓瘤细胞染色体(约60条)和小鼠脾细胞染色体(约40条)数量之和，因此可以推测收获的杂交瘤细胞的确是由骨髓瘤细胞和小鼠脾细胞融合而来，并且能够稳定遗传。
本实施例中还对获得的单克隆抗体进行了大量制备与纯化，具体操作如下：
取10周龄的BALB/c小鼠4只，腹腔注射不完全氟氏佐剂0.5mL/只；7-10d后收集扩大培养的杂交瘤细胞株，腹腔注射小鼠(105-106cells/只)，7-10d后收集腹水，于2000r/min离心10min，取上清备用。
按照IgG抗体纯化试剂盒(购自Thermo公司)的操作说明，对以上离心粗提的腹水进行纯化，具体步骤如下：
1)样品准备：小鼠腹水冰上解冻，解冻后的腹水用平衡液(20mM PB pH＝7.0)稀释80倍，先将解冻后的腹水全部转移至烧杯内，缓慢少量地贴壁加入平衡液，稀释后的样品用0.45μm滤膜过滤。
2)按照AKTA仪器以及抗体纯化的试剂盒操作要求清洗AKTA仪器以及纯化柱，完成住平衡以及上样等操作。
3)洗脱：暂停AKTA仪器，使用柠檬酸(0.1M柠檬酸pH＝3.0)洗脱抗体，调整流速为1mL/min，出峰后用干净的离心管收取洗脱液。
4)复性：暂停AKTA仪器，使用醋酸(1M)进行抗体复性，调整流速为2.5mL/min，约3个柱体积。
5)仪器暂停，使用平衡液将前2步使用的强酸溶液洗去，以3mL/min流速洗脱约3个柱体积。
6)洗杂：仪器暂停，使用NaOH(0.1M)溶液以2.5mL/min的流速洗脱约3个柱体积以除去杂质。
7)仪器清洗：纯化完成后分别使用ddH2O和20％乙醇清洗仪器。
8)将步骤3)中洗脱的抗体取一部分出来进行SDS-PAGE胶验证，其分析结果如图8所示，剩余的抗体分装至1.5mL EP管中，-20℃保存备用。
在图8中，M为蛋白Maker，1为纯化后的单克隆抗体样品。由图8可以看出，纯化后的单克隆抗体样品均能够在55KDa出现抗体重链条带，在25KDa出现抗体轻链的条带，抗体纯化效果良好。
为了验证本实施例获得的单克隆抗体在体内的保护效果，进行了如下动物攻毒保护试验：
此处动物试验共分为5组，分组情况如下：单克隆抗体治疗组(WNV+C9-G11-F3)、交叉保护组(JEV+C9-G11-F3)、WNV阴性对照组(WNV+Negative serum)，JEV阴性对照组(JEV)和阳性对照组(WNV+Positive serum)。其中WNV感染剂量为106PFU，JEV感染剂量为105PFU，感染方式均为腹腔注射。单克隆抗体分别在攻毒后第1天以20mg/kg的剂量通过腹腔注射、在攻毒后第2、3天以5mg/kg的剂量通过腹腔注射。在小鼠攻毒后的1-20天，每天的同一时间段观察小鼠的临床表现并记录小鼠的体重变化以及死亡情况，结果如图9所示。由图9可以看出，本实施例提供的单克隆抗体对于小鼠感染西尼罗病毒具有40％的保护效力，对于小鼠感染乙型脑炎病毒也具有20％的保护效力；并且，使用单克隆抗体治疗后，延长了小鼠攻毒后的发病时间。
为了研究本实施例制备的单克隆抗体对于感染了西尼罗病毒或乙型脑炎病毒的小鼠的影响，仍按照上述方式进行分组与攻毒处理，并在攻毒后第7天，将小鼠进行安乐死，置于75％乙醇中浸泡5min，用无菌的手术器械将小鼠的颈背部皮肤剪开，暴露脑组织，无菌将小鼠脑组织取出，置于无菌PBS中清洗后保存备用。保存的小鼠脑组织一部分使用空斑实验测定脑组织病毒滴度，一部分使用Trizol法提取小鼠脑组织RNA并反转录成cDNA，检测小鼠脑组织相关炎症因子表达情况以及病毒载量，剩余部分制成脑组织切片，分别进行IHC分析和HE染色分析，试验结果如图10-13所示。
在图10中，A为空斑试验测定的小鼠脑组织中西尼罗病毒滴度结果，B为相对荧光定量测定的小鼠脑组织中西尼罗病毒载量结果，C为空斑试验测定的小鼠脑组织中乙型脑炎病毒滴度结果；D为相对荧光定量测定的小鼠脑组织中乙型脑炎病毒载量结果。由图10和图11可以看出，相比于阴性对照组，经过单克隆抗体治疗的小鼠的脑组织内的病毒载量以及IL-1β、CCL-5、IFN-β、IL-6等细胞因子的表达量都有大幅下降，证明了本实施例提供的单克隆抗体在体内能够保护小鼠免受西尼罗病毒和乙型脑炎病毒的感染。
脑组织中的小胶质细胞和星形胶质细胞在激活状态能够分泌多种趋化因子和细胞因子以抵御病原微生物的入侵，故这两种细胞的数量和状态也常被用于评价脑组织炎症反应的强度。IBA-1是小胶质细胞的特异性标志物，当小胶质细胞被激活时，胞体变大，棘突增多，在IHC染色中细胞呈现棕色深染；GFAP是星形胶质细胞成熟的特异性标志物，其激活后在IHC染色中呈现棕色深染的不规则“星状”。由图12可以看出，阴性血清治疗组小鼠星形胶质细胞和小胶质细胞明显被激活，平均光密度统计结果也显示IBA-1和GFAP的数量明显多于抗体治疗组小鼠，表明本发明制备的单克隆抗体对于小鼠西尼罗病毒感染具有保护作用。类似地，乙型脑炎病毒感染组的小鼠脑组织中也观察到棕色深染的小胶质细胞和星形胶质细胞，而单克隆抗体治疗组小鼠脑组织这两种细胞的激活和增生明显降低，表明单克隆抗体对于小鼠感染乙型脑炎病毒具有治疗作用。
结合图13的HE染色结果也可以看出，在攻毒后第7天，阴性血清治疗组小鼠表现出典型脑炎的病理特征，脑组织可见广泛的炎性细胞浸润，大脑皮质血管周围聚集大量炎性细胞，形成血管“袖套”现象，同时纹状体、丘脑和中脑中也出现了大量炎性细胞浸润、坏死和神经元萎缩等现象；而单克隆抗体治疗组则没有出现脑炎的病理特征。这些结果进一步说明了单克隆抗体对西尼罗病毒具有治疗作用。同样地，乙型脑炎病毒感染组小鼠的脑组织也出现了JEV脑炎的病理特征，脑组织可见广泛的炎性细胞浸润，而单克隆抗体治疗组小鼠的脑组织则没有出现类似的病理变化，这些结果证明了单克隆抗体C9-G11-F3对于乙型脑炎病毒的感染也具有一定治疗效果。
实施例2
本实施例提供了实施例1制备的具有中和活性的西尼罗病毒单克隆抗体在制备人源化抗体中的应用。
1.鼠源单克隆抗体VH、VL序列的扩增与重组人源化抗体质粒的构建
PCR扩增实施例1制备的单克隆抗体C9-G11-F3可变区基因后，进行琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统下在500bp左右出现单一清晰条带，将目的条带回收产物与载体pMDTM19-T连接后，进行测序，并通过抗体结构预测软件(http://www.vbase2.org/)预测均具有抗体可变区的结构。
单克隆抗体C9-G11-F3的重链可变区的氨基酸序列和如SEQ ID NO:1所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；编码所述所述重链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，编码所述轻链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。相应序列表具体如下：
SEQ ID NO:1
DVQPQQSGVELMKPGASVKMSCKASGYRFTSYLIEWVKQRPGHGLEWIGEILPGSGSTNYNEKFQGKATFTADTSSNTAYLQLSTLTSEDSAVYYCGREKGGYAMDYWGQGTSVIVSS
SEQ ID NO:2
DIVMTQTPLSLPVSLGDQASISCKSSHSLTHINGNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFIGSGSGTDFTLRITRVEAEDLGVYFCSQSTHVPPWSFGGGTKLEIK
SEQ ID NO:3
GACGTCCAACCGCAGCAATCTGGAGTTGAATTGATGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACAGATTCACTAGTTACTTGATAGAGTGGGTAAAACAGAGGCCTGGACATGGCCTTGAGTGGATTGGAGAGATTTTACCTGGAAGTGGTAGTACTAATTATAATGAGAAGTTTCAGGGCAAGGCCACATTCACTGCAGATACATCCTCCAATACAGCCTACTTGCAGCTCAGTACCCTGACATCTGAGGACTCTGCCGTCTATTACTGTGGAAGAGAGAAGGGGGGCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACTTCAGTCATCGTCTCCTCA
SEQ ID NO:4
GATATTGTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAAATCTAGTCACAGCCTTACACACATTAATGGCAACACCTATTTACATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCACAGCTCCTAATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCATTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAGGATCACCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTTCTGCTCTCAAAGTACACATGTTCCTCCGTGGTCGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAGC
单克隆抗体C9-G11-F3的VH、VL基因的PCR产物与分别与通过限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ进行双酶切后的抗体重链载体骨架pFUSE2ss-CHIg-hG1以及通过限制性内切酶EcoRⅠ和KpnⅠ进行双酶切后的抗体轻链载体骨架pFUSE2ss-CLIg-hK通过同源重组的方式进行连接，将连接产物转化大肠杆菌Trans5α，随后挑选单菌落进行菌液PCR鉴定并将出现符合预期大小条带的菌液进行测序，获得核苷酸序列完全正确的重组质粒。将构建成功单克隆抗体C9-G11-F3重组质粒分别命名为：pFUSE2ss-CHIg-hG1-C9(图14)和pFUSE2ss-CLIg-hK-C9(图15)。
2.重组抗体的获取及中和效果的验证
将上述成功构建的单克隆抗体C9-G11-F3人源化重链和轻链质粒pFUSE2ss-CHIg-hG1-C9和pFUSE2ss-CLIg-hK-C9转染HEK-293T细胞，48h后，收取培养基上清，测定其中和效果，结果如图16所示。由图16可以看出，重组人源化抗体(C9-G11-F3[human])仍能够中和WNV的感染。
综上所述，本发明提供了一种具有中和活性的西尼罗病毒单克隆抗体及其制备方法与应用。本发明通过将灭活西尼罗病毒作为抗原对小鼠进行免疫试验，并在免疫试验过程中对小鼠血清的中和效价进行监测，筛选出血清中和效价最高的小鼠；再将骨髓瘤细胞SP2/0与筛选出的血清中和效价最高的小鼠的免疫脾细胞进行融合，筛选出阳性杂交瘤细胞进行亚克隆后，进一步通过中和试验对杂交瘤细胞株进行筛选，最终获得能够分泌具有中和活性的西尼罗病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株C9-G11-F3。该杂交瘤细胞株C9-G11-F3分泌的单克隆抗体不仅具有中和西尼罗病毒的能力，同时具有针对乙型脑炎病毒的交叉保护能力，具有较高的研究意义和应用价值。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.一种具有中和活性的西尼罗病毒单克隆抗体，其特征在于：由杂交瘤细胞株C9-G11-F3分泌得到，具有中和西尼罗病毒的能力，同时具有针对乙型脑炎病毒的交叉保护能力；所述杂交瘤细胞株C9-G11-F3保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:C202391。
2.根据权利要求1所述的具有中和活性的西尼罗病毒单克隆抗体，其特征在于：所述单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区；所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3.根据权利要求1所述的具有中和活性的西尼罗病毒单克隆抗体，其特征在于：编码所述重链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，编码所述轻链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
4.一种权利要求1-3中任一权利要求所述的具有中和活性的西尼罗病毒单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、制备西尼罗病毒液，依次对其进行灭活处理与浓缩处理后，作为抗原保存备用；
S2、利用步骤S1制备的所述抗原对小鼠进行免疫试验，并对进行免疫试验的小鼠的血清中和效价进行监测，筛选出中和效价最高的小鼠进行冲击免疫；
S3、将小鼠的骨髓瘤细胞SP2/0与步骤S2中冲击免疫后的小鼠的免疫脾细胞进行细胞融合，筛选出阳性杂交瘤细胞进行亚克隆，并通过中和试验对经过亚克隆的阳性细胞株进行筛选，获得能够分泌具有中和活性的西尼罗病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株C9-G11-F3。
5.根据权利要求4所述的具有中和活性的西尼罗病毒单克隆抗体的制备方法，其特征在于：在步骤S2中，对所述试验动物的抗血清中和效价进行监测后，再根据监测的中和效价对所述免疫试验的免疫程序进行调整。
6.根据权利要求5所述的具有中和活性的西尼罗病毒单克隆抗体的制备方法，其特征在于：在步骤S2中，筛选出的所述中和效价最高的小鼠的血清对西尼罗病毒的中和效价为1:3200。
7.根据权利要求4所述的具有中和活性的西尼罗病毒单克隆抗体的制备方法，其特征在于：在步骤S3中，获得的所述杂交瘤细胞株C9-G11-F3分泌的所述单克隆抗体对西尼罗病毒的中和效价为1:50。
8.根据权利要求4所述的具有中和活性的西尼罗病毒单克隆抗体的制备方法，其特征在于：在步骤S3中，获得的所述杂交瘤细胞株C9-G11-F3分泌的所述单克隆抗体对感染西尼罗病毒具有40％的保护效力，对感染乙型脑炎病毒具有20％的保护效力。
9.一种权利要求1-3中任一权利要求所述的具有中和活性的西尼罗病毒单克隆抗体在制备人源化抗体中的应用。
10.一种权利要求1-3中任一权利要求所述的具有中和活性的西尼罗病毒单克隆抗体在制备药物中的应用，其特征在于：所述药物为预防或治疗因西尼罗病毒与乙型脑炎病毒中的至少一种引起的疾病的药物。
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